Coloração de Gram 4

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
ESCOLA SUPERIOR DE TECNOLOGIA
ENGENHARIA QUÍMICA
COLORAÇÃO DE GRAM E MICROSCOPIA
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
ESCOLA SUPERIOR DE TECNOLOGIA
ENGENHARIA QUÍMICA
BEATRIZ GONÇALVES DE OLIVEIRA
JULIENE MEDEIROS DE MARCO
LUCAS ALVES DE OLIVEIRA
MARESSA MARTINS DE PINHO
Relatório solicitado para obtenção de nota parcial referente à 4ª aula prática da disciplina de Microbiologia.
Prof. (a). Responsável: Érica Simplício
MANAUS
2017
	
 
	
INTRODUÇÃO
A microbiologia é o ramo da ciência responsável pelo estudo dos micro-organismos. Esses seres possuem diversas características únicas que os caracterizam. Ainda, dentro da esfera que engloba a bacteriologia, é de extrema importância avaliar alguns aspectos, como por exemplo, a pré-disposição de uma bactéria em ser um agente etiológico. Para isso, utiliza-se informações morfológicas, metabólicas e fisiológicas, muitas vezes associados ao uso do microscópicos (MADIGAN, 2016).
Em geral, há duas formas para se observar uma bactéria: a fresco, em que a célula é analisada pela suspensão entre a lâmina e a lamínula, ou através de um esfregaço fixado e corado. A técnica da coloração de bactérias é a mais utilizada em conjunto da microscopia óptica. Grande parte das bactérias tem afinidade por diversos corantes, principalmente aqueles derivados do grupo básico anilina, como o azul de metileno e o violeta de gencina (Figura 1). Bactérias podem responder de formas diferentes a determinados processos de coloração, o que permite classificá-las em grupos (TORTORA, 2005).
Figura 1: Coloração diferencial de bactérias
Fonte: https://pathologika.com/histoquimica
 Desenvolvido pelo Dinamarquês Hans Christian, uma técnica de coloração amplamente difundida é a coloração Gram. Este método trata-se de uma coloração diferencial (ou seletiva), ou seja, é empregado mais de um corante ou reagente a fim de evidenciar diferenças entre células bacterianas. O processo é fundamentado no fato de que bactérias, quando são coradas por corantes próximos da rosalina e então tratados com determinadas soluções de iodo, adquirem uma coloração escura, resultado da interação entre o iodo e corante (iodopararosanilina) (MADIGAN, 2016).
Nas bactérias classificadas como Grã-positivas, o iodopararosanilina é altamente retido, não sendo facilmente retirado do citoplasma mesmo após tratamento posterior com álcool. Em contrapartida, nas Grã-negativas esse composto é facilmente retirado após lavagem com álcool. Tal distinção ocorre graças a diferenças na parede celular dessas células (TORTORA, 2005). 
Após a lavagem com álcool, é realizada uma segunda coloração, a safrina ou fuscina. Assim, após procedimento, bactérias Grã-negativas ficam com coloração vermelha ou rosa, obtidas pela adição do segundo corante, enquanto que as Grã-negativas permanecem com a coloração roxa escura proveniente do primeiro corante (OPLUSTIL, 2004).
A classificação desses dois grupos originados pela coloração Gram tem grande importância no entendimento e caracterização de bactérias nas mais diversas áreas. As Grã-negativas em geral possuem característica patológicas, devido a substância LPS. Já as Grã-positivas possuem, em geral, características de aderência devido à exotoxina, composta pelo ácido lipoteinóico (SCHAECHTER, 2002).
OBJETIVOS
Entender o conceito e a técnica da coloração de Gram que é utilizada para diferenciação das células de bactérias, obtendo assim os seus resultados no microscópio, conforme as células de bactérias coradas.
METODOLOGIA
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Primeiramente, foi necessária a obtenção de um esfregaço (material de análise). No caso em questão foi coletado da boca de um aluno, após o cotonete ser friccionado na lateral bucal interna. Em seguida, a amostra foi esfregada levemente na lâmina de microscópio e coberta com o primeiro corante (violeta). Foi necessário aguardar 60 segundos para que o corante pudesse penetrar nas membranas das bactérias. A substância mordente foi colocada para agir por igual período de tempo. O material foi então lavado com etanol-cetona e em seguida com água destilada delicadamente. Para conclusão da diferenciação, utilizou-se o corante vermelho (safranina) durante 90 segundos, que servirá de coloração de contraste. Lavou-se com água destilada e a lâmina foi seca sem tocar a amostra.
Após este procedimento, foi feita a visualização em microscópio das bactérias coloridas de violeta e vermelho e sua identificação como gram positivas ou gram negativas.
Figura 2: Demonstração da coloração GRAM
Fonte: goo.gl/n9J6xC
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Inicialmente, a bactéria coletada e fixada à placa adquiriu a coloração violeta, em virtude do corante violeta (corante primário). Em seguida, como dito anteriormente, aplicou-se a solução de Lugol à placa, seguido de álcool 90 ºGL. Observa-se que o iodo presente na solução de Lugol forma um complexo cristal violeta que é insolúvel com o corante primário e, o mesmo possui uma coloração mais intensa que o cristal violeta livre, tornando-se mais difícil de ser removido das células microbianas (MADIGAN et al., 2016). 
Após a adição de álcool, observou-se que houve uma mudança na coloração da lâmina, tornando-se mais clara (ou desbotando-se). Tal fato indica a presença de bactérias gram-negativas e pode atribuído à diferença entre as paredes celulares das bactérias gram-negativas e gram-positivas (MADIGAN et al., 2016). 
Como citado na Introdução, as bactérias gram-positivas possuem estrutura da parede celular mais simples que as gram-negativas. Estas possuem a parede celular constituída por estruturas de múltiplas camadas que são complexas. Assim, uma vez que as bactérias são submetidas a solventes nos quais o corante é solúvel (álcool), torna-se mais difícil para elas reter o mesmo em sua estrutura. Portanto, as bactérias gram-negativas são descoloridas (TORTORA et al., 2012).
 Em comparação, a parede celular das bactérias gram-positivas consiste, em geral de uma única camada, que retém o corante aplicado e, por possuir uma estrutura mais espessa e rígida, o agente descolorante encontra dificuldade para penetrar na célula (TORTORA et al., 2012).
A camada constituinte da parede celular das bactérias, chamada de peptideoglicano, é a principal responsável pela rigidez da estrutura. Ela é constituída por polissacarídeos derivados de açúcares, além de alguns aminoácidos. Nas bactérias gram-positivas (VIEIRA et al., 2012). 
Nas bactérias gram-positivas, 90% da constituição de sua parede celular é de peptideoglicano. Já nas bactérias gram-negativas, apenas uma pequena quantidade da parede celular é formada por esse composto, enquanto a maior parte é composta por uma membrana externa chamada de lipopolissacarídica, uma vez que este é constituída por proteínas, fosfolípideos e polissacarídeos, que se ligam formando um complexo (VIEIRA et al., 2012).
Figura 3: Diferenças estruturais na parede celular das bactérias gram-positivas e gram-negativas.
Fonte: Madigan et al., 2016.
Em seguida, corou-se novamente as bactérias da lâmina com safranina (contra-corante). Dessa forma, as mesmas adquiriam coloração rosada como mostra a Figura 4, confirmando o resultado esperado: as bactérias analisadas são gram-negativas.
Figura 4: Bactérias gram-negativas analisadas no microscópio após o método de coloração de Gram.
Fonte: Própria.
É importante ressaltar que cerca de 90 a 95% das bactérias gram-negativas são patogênicas e mais resistentes do que as bactérias gram-positivas, em razão da complexidade em sua estrutura celular (TORTORA et al., 2012). 
CONCLUSÃO
A técnica do método de coloração de Gram mostrou-se muito eficiente, pois foi possível chegar a uma conclusão sobre a forma e o arranjo das bactérias que nos foi proposto analisar. Com a realização desse teste básico para identificação de bactérias, permitiu-se concluir que existem diferenças significativas na composiçãoda parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas.
REFERÊNCIAS
MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; BENDER, K. S.; BUCKLEY, D. H.; STAHL, D. A. Microbiologia de Brock. 14. ed. Porto Alegre: Artmed, 2016. 
OPLUSTIL, C. P. et al. Procedimentos básicos em Microbiologia clÌnica. 2a ed. S„o Paulo: Sarvier, 2004.
SCHAECHTER, M. et al. Microbiologia - Mecanismos das Doenças Infecciosas. 3. ed. Rio de janeiro: Guanabara Koogan, 2002.
TORTORA, G. J. ; FUNKE, B. R. ; CASE, C. L. Microbiologia. 8. ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. 
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 10. ed. Porto Alegre: Artmed, 2012.
VIEIRA, D.A.P.; FERNANDES, N.A.C.Q. Microbiologia Aplicada. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Goiás. Goiás, 2012.