Microbiologia isolamento e identificação de Bactérias

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Gram Positivo:
Stafilococos: S. aureus S. epidermidis S. 
saprophyticus
Streptococos: S. pyogenes S. agalactiae S. 
pneumoniae S. bovis S. mutans; S. salivarius; S. 
sanguis ; S. mitis; S. anginosus 
Enterococcus E. faecalis E. faecium
Gram negativos: E. coli, 
Shigella: S. dysenteriae, S, flexheri, S. boydii, S. 
sonnei 
Salmonella: S. enterica, S. bongori, S. thypi. 
Proteus: P. mirabilis e P. vulgaris 
Yersinia Y. enterocolitica 
Klebsiella K. pneumoniae
Enterobacter 
Serratia, Citrobacter, Hafnia, Providencia, 
Morganella, Erwinia, Kluyvera. 
Vibrionaceae Vibrio V. choloreae, V. 
parahaemolyticus, V. vulnificus 
BGN não fermentadores Pseudomonadaceae 
Pseudomonas P. aeruginosa 
Resumo prova prática de Microbiologia clínica 6° período de 
Biomedicina- UFTM 
Geane Aparecida Simões Lelis- Biomed 32- 2017/2 
Principais Bactérias 
Orofaringe: Streptococos (G+) 
Fossas Nasais: Stafilococos (G+) 
Urina: Bacilo gran negativo 
 
 
 
 
 
 
 
 
Método de GRAM 
 
 Preparo do esfregaço: 
a- Colocar na lâmina uma gota de solução salina fisiológica; 
d- Flambar a agulha bacteriológica, deixar esfriar próximo a chama, abrir a placa com a cultura 
teste e tocar a colônia escolhida para retirada da amostra, 
e- Esfregar o material com movimentos de rotação da alça bacteriológica, para se obter um 
esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme; 
 f- Deixar secar nas proximidades da chama; 
g- Fixar o esfregaço passando a lâmina 3 vezes na chama do bico de Bunsen (rapidamente). 
 Método de Coloração de Gram: 
1) Cobrir toda a lâmina com solução cristal violeta (corante roxo), aguardar um minuto; 
2) Cobrir a lâmina com solução de Iugol (mordente) por um minuto; 
3)Inclinar a lâmina e gotejar álcool (cerca de 15 segundos). Lavar a lâmina rapidamente em 
água corrente; 
4) Cobrir com fucsina de gram e aguardar um minuto 
5) Lavar a lâmina em água destilada e secar (sem esfregar) 
 
RESULTADO: bactérias Gram-positivas: roxo 
 bactérias Gram-negativas: rosa/vermelho 
 
Técnicas de Semeadura 
As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos 
de um meio de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para um outro meio 
de cultura 
Estria simples: transferir uma alçada da cultura para meio 
sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A estria 
pode ser realizada em movimento de zig- zag (estria sinuosa) ou como 
uma linha reta sobre o meio (estria reta). 
 
Objetivo: Essa técnica é muito utilizada para visualização de 
determinadas propriedades metabólicas, como a produção de enzimas 
hidrolíticas (hidrólise de substâncias do meio - gema de ovo, 
sangue...), e produção de pigmentos. 
 
Esgotamento em estrias ou estrias 
múltiplas: transferir uma alçada da cultura para 
meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o 
meio. 
 4 estrias: estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90°, estriar 2/3 
do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 
2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90° e estriar o 
restante do meio. 
Objetivo: obtenção de colônias isoladas. É importante não cruzar as 
estrias (não tocar a alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a 
cada estria e obter as colônias isoladas. Pode-se, alternativamente, 
flambar a alça entre as estrias e tocar a ponta da estria anterior, 
arrastando um pequeno inóculo para a próxima estria. 
 
Meios de cultura 
Ágar MacConkey é um meio seletivo para enterobactérias. Organismos que fermentam 
lactose, produzem pH localizado, o qual, seguido pela absorção do vermelho neutro contido no 
meio, confere uma coloração vermelha ou rósea à colônia, enquanto que colônias não 
fermentadoras de lactose permanecem incolores ou transparentes.(Urina) 
O caldo BHI é utilizado na recuperação de microrganismos fastidiosos ou não, incluindo 
bactérias aeróbicas e anaeróbicas e fungos. 
Possui em sua formulação peptona e infusão cérebro-coração que servem de fonte de nitrogênio, 
carbono, enxofre e vitaminas. A glicose é um carboidrato que os microrganismos utilizam para 
fermentação. 
Manitol Salgado é um meio de cultura, muito usado para o isolamento 
de Staphylococcus aureus de amostras biológicas (fossas nasais). A degradação do manitol com 
a produção de ácido muda a cor do meio de rosado a amarelo. Devido ao seu alto conteúdo de 
cloreto de sódio, pode-se fazer uma inoculação maciça da amostra em estudo. Geralmente se 
incubadas as placas por mais ou menos 36 horas, aparecendo as colônias de estafilococos não-
patogênicos de tamanho pequeno e rodeadas de uma zona vermelha. As colônias 
de Staphylococcus aureus fermentadores do manitol são maiores e rodeadas de uma zona 
amarela. 
O meio SIM é um meio semi-sólido usado para determinação da produção de indol e 
H2S e motilidade .O citrato ferroso de amônio e tiossulfato de sódio são usados para detectar 
produção de gás H2S. 
Indol : a prova é realizada inoculando-se o meio contendo excesso de triptofano. Após a 
incubação colocar 0,5 ml do reagente de Kovac ou o reativo de Ehrlich (solução aquosa ou 
alcoólica de p-dimetil aminobenzaldeído, respectivamente) através da parede interna do tubo. A 
prova é positiva quando na porção superior, desenvolve-se um anel de cor rósea dentro de no 
máximo 5 minutos. Este resultado é devido à complexação do indol com o aldeído, em meio 
ácido, formando o composto colorido. A prova é negativa com qualquer outra tonalidade de cor 
(original do meio ou marrom) 
Prova da produção de gás sulfídrico ou sulfeto de hidrogênio O gás sulfídrico 
também pode ser produzido pela redução de compostos inorgânicos de enxofre tais como o 
tiossulfato, sulfato ou sulfito. Os microrganismos capazes de produzir a enzima redutase do 
tiossulfato convertem o tiossulfato em sulfito com liberação de sulfeto de hidrogênio. Os átomos 
de enxofre atuam como aceptores de hidrogênio durante a oxidação do composto inorgânico. 
A prova da motilidade indica indiretamente a produção de flagelos. Não é uma prova 
bioquímica e sim fisiológica, mas auxilia a identificar bactérias. A prova é efetuada inoculando-
se em linha reta, através da técnica da punctura (com agulha), 2/3 de um meio semi-sólido. A 
prova indica motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de 
inoculação, turvando o meio. A prova é negativa quando os microrganismos ficam restritos ao 
local da inoculação sem, contudo, turvar o meio. 
 
O ágar citrato é utilizado na identificação de bactérias, principalmente as 
enterobactérias, que o utilizam como fonte de carbono. Quando as bactérias metabolizam o 
citrato alcalinizam o meio. O pH básico faz o meio, que antes apresentava-se verde, ficar azul, 
devido ao indicador azul de bromotimol. 
Ágar Sangue é um meio de cultura de base rica. Utiliza-se ágar columbia como base 
deste meio, sem glicose, pois esta poderia atrapalhar a visualização da hemólise. Acrescido de 
5% de sangue de carneiro desfibrinado. Excelente meio para o isolamento estreptococos beta-
hemolítico. O meio de Ágar sangue, usando uma base rica, fornece condições de crescimento 
para a maioria dos microrganismos. A conservação dos eritrócitos íntegros favorece a percepção 
da hemólise, úteis para a diferenciação de bactérias como os Streptococcus spp.(orofaringe) 
Ágar Cled é um meio de cultura enriquecido, destinado ao isolamento e cultivo de 
diversos microrganismos, recomendado para amostras de urina. A lactose facilita a detecção de 
coliformes contaminantes fermentadores da mesma e que são facilmente reconhecidos pela 
mudança de coloração do meio (verde para o amarelo) e concomitantemente a isso, por se tratar 
de um meio eletrólito-deficiente, impede a formaçãodo “véu” de Proteus spp.(urina) 
O meio base para oxidação e fermentação - OF Verifica a capacidade do 
microrganismo em utilizar os carboidratos pela via oxidativa ou fermentativa. Diferencia bacilos 
Gram negativos quanto ao tipo de metabolismo empregado em utilizar carboidratos. Produtos 
da fermentação são ácidos fortes e da oxidação são extremamente fracos portanto precisam 
de um meio mais sensível que aumente a quantidade de ácidos e diminua a formação de 
aminas alcalinas. Cor inicial: verde 
Não fermentadores (Met. Oxidativo): reação ácida somente no tubo aberto (amarelo) e fechado 
fica inalterado (verde) 
Fermentativos: reação em ambos os tubos (amarelo) ou somente no fechado. 
 
O ágar TSI O meio de TSI fornece uma série de reações bioquímicas que dão uma visão 
geral do metabolismo bacteriano. O TSI ou tríplice açúcar e ferro é um meio sólido distribuído de 
tal sorte que apresenta uma base e uma inclinação. É constituído de glicose (0,1%), lactose 
(1,0%) e sacarose (1,0%), peptonas, aminoácidos, incluindo sulfurados, tiossulfato de sódio e 
citrato férrico amoniacal (indicador da produção de H2S), com pH neutro e um indicador de pH, 
o vermelho de fenol. O meio é semeado com agulha por punctura na base e estrias na superfície. 
Após o crescimento da bactéria pode-se observar os seguintes resultados: A bactéria não 
fermenta qualquer dos açúcares, ficando inalterado o meio, ou até mesmo utiliza os 
aminoáçidos respirando-os com produção de aminas que alcalinizam o meio; fermenta 
somente a glicose de tal sorte que os ácidos formados mudam o pH do meio apenas na 
base, que se torna amarela e a inclinação vermelha por utilização dos aminoácidos (por 
respiração), alcalinizando a mesma e neutralizando a pequena quantidade de ácidos, pois a 
concentração de glicose é baixa - assim o resultado é expresso como K/A (inclinação alcalina e 
base ácida); fermenta a lactose ou a sacarose com viragem do indicador de todo o meio 
para amarelo, tanto a base como a inclinação permanecem ácidas, pois os álcalis 
produzidos na inclinação são facilmente neutralizados pela grande quantidade de ácidos 
produzidos na base, tendo em vista que a concentração desses açúcares é dez vezes 
maior que a da glicose - o resultado é expresso como A/A (inclinação e base ácidas). Nos dois 
últimos casos, existe a possibilidade de detectar gases resultantes da degradação do ácido 
fórmico em hidrogênio e anidrido carbônico, se a bactéria possuir o sistema hidrogênio fórmico 
liase - os gases são indicados ou visualizados indiretamente por levantar ou fragmentar o meio 
- o resultado é representado como A/A com gás. Há também a possibilidade da bactéria produzir 
H2S por respirar anaerobiamente o tiossulfato, captando elétrons através da tiossulfato redutase, 
resultando em gás sufídrico e sulfito. O sulfeto de hidrogênio na presença de sais de ferro forma 
sulfeto ferroso, originando um precipitado negro insolúvel - dessa forma o resultado é dado 
como A/A com gás e H2S. 
Desse modo, pode-se observar num único meio os processos fermentativos, respiração 
aeróbia e anaeróbia. A utilização dos açúcares e aminoácidos na inclinação se dá apenas por 
respiração aeróbia, enquanto que na base os processos são realizados por fermentação 
(incluindo também putrefação, quando da utilização dos aminoácidos básicos, sulfurados, 
triptofano, com produção de gás sulfídrico, mercaptanas, aminas, dentre outras). Já a utilização 
do tiossulfato é ocorre por respiração anaeróbia, gerando também gás sulfídrico. 
O ágar uréia serve para detectar a produção da enzima urease por bactérias e fungos. 
A uréia presente no meio é degradada pela enzima urease em duas moléculas de amônia. A 
amônia formada alcaliniza o pH e esta é indicada pelo vermelho de fenol, fazendo com que o 
meio antes palha torne-se rosa. 
Ágar Sabourrad : O ágar Sabouraud é recomendado para o cultivo, isolamento e 
identificação de fungos patogênicos e leveduras. O ótimo crescimento dos fungos se deve às 
altas concentrações de carboidratos. O meio não dispõe de inibidores de microflora 
acompanhante, mas agentes inibidores podem ser adicionados. Os inibidores mais utilizados em 
associação com o ágar Sabouraud são: ciclohexemida (500mg/L), penicilina (20.000UI/L), 
estreptomicina (40mg/L), cloranfenicol (40mg/L). 
Para a detecção de leveduras, adicionar 40mg/L de neomicina e 20.000UI/L de 
penicilina. Para isolar Candida albicans recomenda-se Sabouraud com 4% de destrose 
adicionado de cloreto de trifeniltetrazolio (TTC) (100mg/L). 
O pH do meio, levemente ácido, inibe o desenvolvimento de algumas bactérias e de 
algumas espécies de fungos. O período de incubação deste ágar é de no mínimo 3 dias a 25ºC. 
O ágar Sabouraud glicose é o meio adequado para o isolamento dermatófitos; 
Bile esculina: A prova de bile-esculina baseia-se na hidrólise de esculina em presença 
de bile por determinadas bactérias. As bactérias bile-esculina positivas crescem em presença de 
sais biliares. A hidrólise da esculina gera glicose e esculetina. A esculetina reage com íons 
férricos resultando em um complexo de cor preta. 
Prova de CAMP: Proteína “Fator CAMP” reage com a hemolisina produzida peloS. 
aureus, causando um sinergismo das hemólises. Em placa ágar sangue fazer uma estria central 
com 
S. aureus hemolítico e depois duas estrias verticais com a amostra. 
Positivo: regiões de hemólise em forma de seta. Possivelmente um estreptococo B-hemolítico 
do grupo B (S. agalactiae) 
 
Ágar Fenilalanina: O Agar Fenilalanina é um meio recomendado para a diferenciação 
de membros dos grupos Proteus e Providencia de outras enterobactérias. Bactérias possuem 
desaminases que removem o grupo amida da fenilalanina do meio e forma ácido fenilpirúvico 
que reage com o cloreto férrico (10%) adicionando ao meio, formando a cor verde. 
Positivo: Verde 
Negativo: Esbranquiçado (Inalterado 
Prova do NaCl: O NaCl age como um agente seletivo, pois o NaCl interfere na 
permeabilidade de membrana celular, bem como no equilíbrio osmótico e eletrocinético em 
organismos intolerantes a ele. A turvação do meio indica crescimento de microrganismos. Se for 
um coco gram positivo, catalase negativa tratar-se-á de Enterococcus spp. Não havendo 
crescimento de microrganismos, meio sem alteração de turvação tratar-se-á de Streptococcus 
spp. Outras provas poderão completar a identificação quando necessárias. 
Prova do Vermelho de metila (VM) – prova efetuada para determinar a capacidade do 
microrganismo de oxidar a glicose com produção e estabilização de altas concentrações de 
produtos finais ácidos. Serve para diferenciar organismos entéricos, em particular E. coli de E. 
Aerogenes. 
Reação de Voges-Proskauer: Capacidade de produzirem produtos não ácidos ou 
neutros. Converte acetil-metil-carbinol(acetoína) em diacetil pela ação do hidróxido de potássio 
e oxigênio atmosférico. Diacetil é convertido em um complexo vermelho pelo reagente de 
Barritt’s.Positivo: vermelhoNegativo: amarelo 
Descarboxilação de lisina, ornitina e arginina: Muitas espécies são capazes de 
descarboxilar aminoácidos, no final o meio fica alcalino e desenvolve a cor azul-púrpura. 
Arginina: meio original roxo +: roxo -: Amarelo 
Lisina: meio original cinza +: roxo -: Amarelo 
Ornitina: meio original cromado/avermelhado +: roxo -: Amarelo 
 
Isolamento e identificação das Bactérias 
O processo de identificação propriamente dito começa com a observação das características das 
colônias isoladas (a olho nu, com lupa ou microscópio, usando a objetiva de menor aumento). 
Os seguintes critérios são utilizados para a caracterização colonial: 
1. Forma - punctiforme (até 1 mm de diâmetro); circular, com mais de 1 mm de diâmetro; 
irregular; filamentosa; radiada, dentre outras; 
2. Tamanho - ...em milímetros; 
3. Elevação - achatada (alta, baixa), espraiada,convexa, umbilicada ou umbonada, 
mamilonada, papilífera, etc.; 
4. Bordos - inteiros, ondulados, lobados, denticulados, franjados, etc.; 
5. Superfície - lisa, rugosa; 
6. Estrutura - amorfa, granulosa, filamentosa; 
7. Caracteres ópticos - opaca, translúcida e transparente; 
8. Cromogenia ou Pigmentação - amarela, branca, preta, rósea, etc.; 
Em outros meios podem ser observadas outras características como hemólise (ágar Sangue), 
redução de telurito (meio para corinebactérias, estafilicocos), fermentação de açúcares (meio de 
MacConkey, ágar SS, dentre outros. As características culturais podem ser observadas também 
em meios líquidos e sólidos inclinados (em tubos). 
 
 
 
 
 
COAGULASE
Se a bactéria prodizir a enzima, na 
presença do plasma iremos ver um 
coágulo
S. aureus 
MANITOL SALGADO: As
colônias de Staphylococcus
aureus fermentadores do
manitol são maiores e rodeadas
de uma zona amarela.(ácida)
DNAse: Se a bactéria produzir a enzima que
degrada o DNA, ao colocarmos o HCl
observamos a formação de um alo
transparente ao redor da colônia.
(confirmando o aureus)
S. epidermidis 
S. saprophyticus 
outros
NOVOBIOCINA: Inocular a 
bactéria em ágar Muller 
Hinton e colocar o disco de 
Novobiocina
Grupo 
epidermidis
Sensivel
Grupo 
saprophydicus
Resistente 
 
Isolamento e identificação dos cocos Gram Positivos 
 
 
Prova da catalase: Esta enzima atua sobre a água oxigenada (peróxido de hidrogênio 3 a 
5%) desdobrando-a em oxigênio e água. A prova é feita colocando uma gota de solução 
aquosa de peróxido de hidrogênio a 3-5% numa lâmina e, em seguida, com uma alça de 
platina, colocar uma porção do crescimento bacteriano sobre a gota. Ou de outra forma, 
adicionando-se 0,5 ml da mesma solução a uma cultura em meio líquido ou em ágar inclinado. 
A prova é considerada positiva quando há borbulhamento ou efervescência devido à liberação 
do oxigênio. A catalase é produzida por muitos microrganismos e é usualmente empregada 
para diferenciar Staphylococcus, que são catalase positivos de Streptococcus, catalase 
negativos 
Identificação dos estáfilococos: Catalase + 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Estreptococcus e Enterococcus
Teste de CAMP:
Proteína “Fator CAMP” reage com a
hemolisina produzida pelo S. aureus,
causando um sinergismo das
hemólises. Em placa ágar sangue fazer
uma estria central com S. aureus
hemolítico e depois duas estrias
verticais com a amostra.
Positivo: regiões de hemólise em
forma de seta.
S. agalactae
Optoquina : Suspensão 
bacteriana e colocar o disco
S. pneumonae
sensível
Bacitracina: Suspensão 
bacteriana e colocar o disco
S. pyogenes
Sensível
Bile Esculina: Avalia a capacidade de hidrolisar esculina na presença
de bile, os produtos da hidrolise(glicose e esculetina) reagem com íons
férricos formando um composto negro passível de difusão. Positivo:
crescem na presença de sais biliares e o tubo fica enegrecido.
Prova doNaCl: testa a capacidade do microrganismo crescer em um
meio com NaCla 6,5%. Teste positivo caso haja turvação e mudança da
cor do meio.
Enterococcus ssp.
Fermentação de carboidratos 
Para identificar o Enterococo
S. grupo D: S.bovis e S. 
equinus
Outros Streptococcus
Fermentação da Lactose: primeiramente analisamos 
no Ágar Mc cockey as bactérias Gram negativas que 
fermentam lactose (LAC+) e, consequentemente, 
produzem ácidos que dissociam este sal, apresentando-
se como colônias rosa-avermelhadas com ou sem um 
centro negro, devido ao azul de metileno, enquanto as 
não fermentadoras (LAC-) formam colônias 
transparentes. 
Oxidase : As bactérias que possuem o
sitema de tranposte de elétrons denominado
citocromo oxidase realizam respiração
aeróbica.
Negativo: Cor inalterada (estado reduzido)
Positivo: fita com a cor azul. Quando positiva
são anaeróbicos
Enterobactérias: exemplos Escherichia coli, 
Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabillis, 
Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Salmonella, 
Shigella.
Aeromonas,Vibrio,Campylobacter
Oxidase: As bactérias que possuem o
sitema de tranposte de elétrons denominado
citocromo oxidase realizam respiração
aeróbica.
Negativo: Cor inalterada (estado reduzido)
Positivo: fita com a cor azul. Quando positiva
são anaeróbicos
Acinetobacter
Pseudomonas sp. 
 
 
Identificação dos Streptococcus e Enterococcus: Catalase – 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Isolamento e identificação dos bacilos Gram Negativos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Feito esses dois primeiros testes e dividido em 4 grupos, são feitos outros testes (10) para 
identificação do microorganismo analisando na tabela. 
 
1) Fermentação da glicose 
2) Oxidação Fermentação(OF) 
3) Fermentação de açucares no TSI 
4) Prova no meio SIM 
5) Citrato de Simmons 
6) Uréia 
7) Fenilalnina 
8) Prova dos três aminoácidos 
9) VM 
10) VP 
 
 
 
 
Testes de Sensibilidade a Antimicrobiano 
 
Pode ser por disco difusão em que se mede o alo e compara na tabela, ou por diluição em caldo, 
que se determina a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida 
Mínima(CBM) 
 
 
Bacterioscopia 
1) H. Ducrey: 
Geralmente raspado de lesão vemos células epiteliais junto, coco bacilo gram negativo, 
pode arranjarem diplococos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2) Fezes: BGN da família enterobacteria povavelmente 
 
 
 
 
 
3) Micobacterium leprae 
Alcool ácido resistente 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4) Secreção vaginal normal (lactobacilos) 
Podemos observar os Bacilos de Doderlein constituintes da microbiota vaginal normal, 
observe as células epiteliais inteiras 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5) Diplococo Gram + cocobacilo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6) Stafilococo gram +: Cocos Gram-positivos arranjados em cachos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7) Gardnela secreção vaginal 
 Cocobacilo gram variável, na maioria das vezes gram +, observar as células epiteliais 
da mucosa destruidas 
 
 
 
8) Neisseria 
 diplococo gram – riniformes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9) BGN (liquido acitico) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
10) Diplococo gram + (pneumococo do LCR)