Novas funções de sinalização cAMP

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Novas funções de sinalização cAMP / cGMP-dependente em plaquetas
Resumo. A prostaciclina endotelial e o óxido nítrico inibem potentemente as funções das plaquetas. As ações de prostaciclina e óxido nítrico são mediadas por adenilil plaquetas e guanil-ciclases, que sintetizam AMP cíclico (cAMP) e GMP cíclico (cGMP), respectivamente. Os nucleotídeos cíclicos estimulam a proteína quinase dependente de cAMP (proteína quinase A [PKA] I e PKAII) e proteína quinase dependente de cGMP (proteína quinase G [PKG] I) para fosforilar um amplo painel de proteínas de substrato. A fosforilação do substrato resulta na inativação de pequenas proteínas G das famílias Ras e Rho, inibição da liberação de Ca 2+ das lojas intracelulares e modulação da dinâmica do citoesqueleto da actina. Assim, os substratos PKA / PKG traduzem sinais de prostaciclina e óxido nítrico em um bloco de adesão plaquetária, liberação de grânulos e agregação. O cAMP e o cGMP são degradados por fosfodiesterases, o que pode restringir a sinalização a compartimentos subcelulares específicos. Um princípio emergente da sinalização de nucleótidos cíclicos em plaquetas é o alto grau de interconexão entre as vias de sinalização inibitória dependentes de cAMP / cGMP em todos os níveis, incluindo a síntese e degradação de cAMP / cGMP e a fosforilação do substrato mediada por PKA / PKG. Além disso, os defeitos nas vias cAMP / cGMP podem contribuir para a hiperreatividade das plaquetas em doenças cardiovasculares. Este artigo centra-se em informações recentes sobre a regulamentação da rede de sinalização cAMP / cGMP e sobre novos alvos de PKA e PKG em plaquetas. 
Introdução 
AMP cíclico (AMPc) tem sido conhecido como poderoso inibidor da agregação plaquetária desde a década de 1960. Estudos iniciais mostraram efeitos inibitórios da prostaglandina E 1 na ativação plaquetária [ 1 ], que logo foram ligados ao cAMP [ 2 ]. Mais tarde, a prostaciclina derivada do endotélio foi descoberta como o principal estimulador fisiológico da produção de AMPc nas plaquetas [ 3 ]. O óxido nítrico (NO) e GMP cíclico (cGMP) foram observados para inibir as funções das plaquetas em torno de 1980 [ 4 ], e a libertação endotelial de NO foi associada à inibição plaquetária dependente de cGMP [ 5 ]. Os defeitos na sinalização de nucleotídeos cíclicos plaquetários podem desempenhar um papel em doenças comuns, como doença cardíaca isquêmica, insuficiência cardíaca e diabetes, onde a sensibilidade reduzida das plaquetas aos efeitos inibitórios do NO contribui para a hiperreatividade das plaquetas [ 6 ]. Além disso, foram descritas uma série de anormalidades genéticas raras na sinalização de nucleotídeos cíclicos plaquetários. Os defeitos na sinalização da prostaciclina reduzem os níveis de AMPc, resultando em plaquetas hiperreativas e um estado protrombótico [ 7 ]. A hipersensibilidade da sinalização da prostaciclina causada pelo ganho de mutações da função em uma proteína Gs resulta em níveis elevados de AMPc e induz um fenótipo sangrando, presumivelmente por inibição exagerada das funções plaquetárias [ 7 ]. Os agentes elevadores de cAMP e / ou cGMP elevadores demonstraram benefício clínico como inibidores de plaquetas. Por exemplo, o dipiridamol em combinação com doses baixas de aspirina é uma terapia aprovada para prevenção de AVC [ 8 ]. O dipiridamol eleva os níveis de cAMP nas plaquetas por vários mecanismos, incluindo a inibição da degradação mediada por fosfodiesterase (PDE). O cilostazol é um inibidor específico da PDE3 que foi aprovado pela Food and Drug Administration para o tratamento da claudicação intermitente e parece ser efetivo na redução do risco de reestenose após angioplastia coronariana [ 8 ]. O cilostazol também foi utilizado com sucesso para a prevenção secundária do acidente vascular cerebral isquêmico [ 9 ]. Recentemente, um grupo de compostos que ativam a produção de cGMP pela guanilil ciclase solúvel mostrou reduzir a formação de trombos em modelos animais [ 10 ]. Os mecanismos exatos envolvidos na inibição de plaquetas mediada por cAMP / cGMP e na fiação da rede de sinalização de nucleotídeos cíclicos são parcialmente compreendidos. O cAMP e o cGMP são capazes de bloquear muitos aspectos da ativação plaquetária, incluindo sinais ativadores iniciais, como a liberação de Ca 2+ das lojas intracelulares e a ativação da proteína G, e adesão, liberação de grânulos, agregação e apoptose [ 11,12 ]. Em geral, a inibição de plaquetas por nucleótidos cíclicos não parece estar restrita a qualquer caminho ativador particular. AMPc e cGMP bloqueiam a ativação das plaquetas mediada por ligandos de receptores acoplados à proteína G, como trombina, ADP e tromboxano, e por colágeno, fator von Willebrand (VWF) e fibrinogênio. Este artigo fornecerá uma visão geral dos vários componentes da rede de sinalização cAMP / cGMP em plaquetas, incluindo novos insights sobre mecanismos de regulação e novas moléculas alvo. 
Regulação da síntese de AMPc 
Os níveis de cAMP citosólico livre são controlados pela sua síntese através de adenilil ciclases (ACs) ( Fig. 1 ). A análise do proteoma de plaquetas sugere que as plaquetas expressam várias diferentes isoformas de AC ligadas à membrana, incluindo AC3, AC6 e AC7 [ 13 ]. As ACs são ativadas pela sinalização do receptor acoplado à proteína G. A ligação da prostaciclina (prostaglandina I 2 ) ao seu receptor na superfície das plaquetas (receptor de IP) [ 14 ] desencadeia a ativação das subunidades a-s (Gs) da proteína G estimuladas ligadas ao receptor intracelular. Gs é transformado em sua forma GTP vinculada, Gs-GTP e, em seguida, liga-se a AC e estimula a síntese de AMPc da ATP. A ativação mediada por Gs da AC é desligada pelo regulador da sinalização de proteína G 2, uma proteína ativadora de GTPase específica que ajuda a hidrolisar Gs-GTP de volta ao Gs-GDP inativo [ 15 ]. Outros receptores ligados à estimulação de CA mediada por Gs em plaquetas incluem receptores A2A e A2B para adenosina [ 16,17 ] e receptores VPAC1 para peptídeos intestinais e vasoativos intestinais pituitários [ 18 ]. Ativadores de plaquetas, como ADP e bloqueio de trombina, funcionam através de proteínas inibitórias Gα-i (Gi), resultando em queda nos níveis de cAMP durante a ativação plaquetária [ 19,20 ]. Os papéis específicos das isoformas de AC individuais e sua possível regulação por outros fatores independentes da proteína G não foram estudados nas plaquetas até o momento. 
Figura 1. 
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Modelo da rede de sinalização cAMP / cGMP em plaquetas. O endotélio intacto libera prostacilina (prostaglandina I 2 [IGP 2 ]) e óxido nítrico (NO), que se ligam ao receptor da prostaciclina (IP-R) e à guanilil ciclase solúvel (sGC), respectivamente. IP-R estimula a síntese de cAMP por adenilil ciclase (AC) através de proteína Gs heterotrimérica. NÃO ativa sGC, resultando na síntese de cGMP. O fator de von Willebrand (VWF), a trombina e o colágeno provavelmente também são capazes de ativar sGC, embora em muito menor grau do que o NO. O cGMP ativa a fosfodiesterase (PDE) 2A e PDE5A, resultando na degradação de cAMP e cGMP, enquanto cGMP inibe PDE3A. O cAMP estimula a proteína quinase dependente de cAMP (proteína quinase A [PKA]), que é expressa como duas isoformas, composta por subunidades reguladoras RIa ou RIβ juntamente com subunidades C catalíticas ou subunidades RIIβ e C. A subunidade C da PKA também foi encontrada em associação com um complexo nuclear κB (NF-κB) -IkB complexo, a partir do qual pode ser liberado pela sinalização de trombina e colágeno. Apenas a isoforma PKGIβ da proteína quinase dependente de cGMP (proteína quinase G [PKG]) é expressa em plaquetas. Subunidades C de PKA e PKGIβ fosforilam substratos comuns, que foram agrupados de acordo com a função (caixa, para detalhes, ver texto principal e Tabela 1 ). A fosforilação do substrato resulta na inibição da ativação plaquetária, liberação de grânulos, adesão e agregação. GP, glicoproteína; HSP27, proteína de choque térmico 27; Receptor IP3-R,inositol 1,4,5-trisfosfato; Proteína de domínio LASP, Lim e SH3; TRPC6, canal de potencial de receptor transitório 6; VASP, fosfoproteína estimulada por vasodilatador. 
Regulação da síntese de cGMP 
A produção de cGMP em plaquetas depende de uma única enzima, a guanilil ciclase solúvel em NO-sensível (sGC ou NO-GC), que é composta por duas subunidades, α1 e β1 [ 21 ]. NÃO se origina em células endoteliais contendo sintetase de NO endotelial (eNOS), e análises completas de plaquetas de ratos e humanos parecem descartar a presença de qualquer enzima significativa de NO sintase dentro das plaquetas [ 22-24 ]. Dados recentes de animais knockout de eNOS indicam que outras fontes de NO não identificadas podem desempenhar um papel na inibição plaquetária [ 25 ]. NO permeia a membrana plasmática das plaquetas e ativa o sGC citosólico para gerar cGMP ( Fig. 1 ), resultando em um aumento de aproximadamente 10 vezes nos níveis de cGMP. Uma série de estudos recentes de plaquetas deficientes em sGC demonstraram que a maioria dos efeitos de NO em plaquetas são realmente mediadas por sGC e cGMP, pelo menos em camundongos. A ausência de sGC aboliu a síntese de cGMP, resultando em uma perda quase completa de efeitos de NO, tanto em um modelo de mouse constitutivo sGC-deficiente quanto em ratos com deficiência de séricos de plaquetas específicos [ 11,26,27 ]. Utilizando concentrações muito elevadas de nitroprussiato de sódio donador de NO (acima de 100 μ m ), um grupo observou inibição residual da agregação plaquetária induzida por colágeno e liberação de ATP em plaquetas isoladas com sGC isoladas, o que foi atribuído à nitrosilação de proteína mediada por NO independente de cGMP [ 27 ]. No entanto, em um estudo diferente, nem nitroprussiato de sódio de 800 μ m nem altas concentrações de outros doadores de NO afetaram a agregação induzida por colágeno de plaquetas isoladas de sGC isoladas [ 26 ]. A função sGC pode ser ativada por VWF, trombina ou colágeno ( Fig. 1 ). Observou-se um aumento pequeno (principalmente cerca de duas vezes) dos níveis de cGMP após a exposição de plaquetas a VWF, ionóforo de cálcio, H 2 O 2 [ 22,28,29 ] trombina ou colágeno [ 27,30,31 ], embora estas Os achados não são suportados por todos os estudos [ 23,32,33 ]. Deve notar-se que os métodos atuais para determinar os níveis de nucleótidos cíclicos intracelulares em lisados ​​de células inteiras são limitados pela rápida queima de medição de PDE e a compartimentação subcelular potencial de cAMP e cGMP (ver abaixo). Caminhos alternativos para a ativação de sGC podem envolver a fosforilação. O aumento induzido por VWF nos níveis de cGMP está ausente em camundongos que não possuem a serina / treonina cinases Akt1 e Akt2 ou a tirosina quinase Lyn [ 34,35 ]. A fosforilação de tirosina das subunidades α1 e β1 de sGC foi observada em plaquetas tratadas com VWF e colágeno [22, 36 ]. O papel fisiológico dessas caminhos alternativos e possivelmente não-independentes de ativação de sGC continua a ser determinado. A SGC recentemente foi sugerida para se envolver na ativação plaquetária em um modelo de mouse com deficiência de sGc específico para plaquetas. A agregação e a liberação de ATP de plaquetas isoladas de sGC isoladas foram reduzidas em baixas concentrações de colágeno e trombina, e os tempos de sangramento da cauda e a formação de trombos foram ligeiramente aumentados nesses animais [ 27 ]. No entanto, em camundongos constitutivos de deficiência de sGC, foram descritos tempos de sangramento fortemente reduzidos [ 26 ]. Assim, um papel potencial para a sGC na ativação plaquetária precisará ser esclarecido por estudos adicionais. Recentemente, os ratos com deficiência de sGCs específicos de plaquetas foram utilizados para estabelecer um novo papel para NO e cGMP na inibição da apoptose plaquetária [ 11 ]. A função sGC plaquetária defeituosa foi descrita em pacientes com doença cardíaca isquêmica, insuficiência cardíaca e diabetes [ 6 ]. Estudos de pacientes com obesidade sugerem que não só a função da sGC plaquetária pode ser incompatível, mas defeitos adicionais na síntese de AMPc e nos alvos cAMP e cGMP a jusante podem contribuir para hiperreatividade plaquetária em doenças cardiovasculares e metabólicas [ 37 ]. Nesses pacientes, a inibição da agregação plaquetária mediada por NO mediada por NO foi associada a níveis reduzidos de síntese de cGMP na presença de estresse oxidativo [ 6 ]. SGC é conhecido por ser inativado por oxidação, o que pode eventualmente levar à perda do grupo heme de ligação à NO da enzima. A sGC oxidada ou isenta de heme mostrou desempenhar um papel importante na patogênese das doenças cardiovasculares, e novos compostos foram desenvolvidos capazes de ativar o sGC isento de heme [ 10 ]. Além disso, existem estimuladores de sGC que atuam em sinergia com NO para aumentar a atividade de SGC. O estimulador de sGC BAY 41-2272 é um potente novo inibidor de plaquetas [ 38 ], embora alguns de seus efeitos possam ser mediados pelo bloqueio da degradação mediada por PDE5 de cGMP [ 39 ]. 
PDD-mediada por degradação de nucleótidos cíclicos 
Os níveis de nucleótidos cíclicos de plaquetas são controlados por degradação mediada por PDE, fornecendo um circuito de feedback negativo para sinalização de nucleótidos cíclicos. As plaquetas demonstraram expressar PDE2A, PDE3A e PDE5A [ 40 ]. PDE2 e PDE3 são capazes de degradar cAMP e cGMP; no entanto, os estudos de inibidores sugeriram que PDE2 e PDE3 regulam principalmente o AMPc nas plaquetas [ 41,42 ], enquanto a PDE5 degrada especificamente o cGMP. cGMP tem um efeito regulatório sobre as três PDE plaquetárias ( Fig. 1 ). O cGMP estimula a atividade de PDE2 e PDE5 por ligação a domínios específicos de ligação a nucleótidos cíclicos, chamados domínios GAF. O cGMP inibe a atividade de PDE3 ao competir com a ligação de AMPc no local catalítico. PDE3A ajuda a manter baixos níveis basais de cAMP em plaquetas [ 41-43 ]. A atividade de PDE3A é regulada positivamente em cerca de 50% durante a ativação da trombina envolvendo proteína fosforilação mediada por proteína quinase C (PKC) e possivelmente também proteína kinase B [ 44, 45 ]. A fosforilação mediada por PKC de PDE3A em Ser428 resulta na ligação de 14-3-3, embora isso não pareça ser necessário para aumentar a atividade. PDE3A também é ativado por proteína quinase dependente de cAMP (proteína quinase A [PKA]) - fosforilação mediada, sugerindo um loop de feedback negativo para sinalização de cAMP [ 44,46 ]. A inibição mediada por cGMP da PDE3A tem sido implicada na elevação dos níveis de AMPc que conduzem à activação cruzada da PKA, o que poderia desempenhar um papel na inibição induzida por NO da alteração na forma de plaquetas [ 47 ]. A principal função do PDE5 é fornecer feedback negativo sobre os níveis de cGMP. Não só a PDE5 é ativada por cGMP, mas a fosforilação adicional da PDE5 pela proteína quinase dependente de cGMP (proteína quinase G [PKG] I) resulta na ativação da atividade catalítica da PDE5 e na dessensibilização a longo prazo de uma resposta cGMP induzida por NO [ 48 ] . PDE5 pode estar envolvido na compartimentalização da sinalização cGMP em regiões sub-específicas específicas (ver abaixo) [ 49 ]. 
Proteína quinases dependentes de cAMP / cGMP 
PKA e PKG traduzam os níveis de cAMP / cGMP em padrões de fosforilação de proteínas. As plaquetas humanas contêm concentrações micromolares de PKA e PKG [ 50 ]. PKA é um heterotetramer composto por duas subunidades catalíticas e duas subunidades reguladoras. Quando o cAMP se liga às subunidades reguladoras, as subunidades catalíticas se dissociam do complexo e fosforilam seus substratos, suprimindo assim a ativação das plaquetas. As principais isoformas de subunidades reguladoras e catalíticas expressas em plaquetas humanas são RIα, RIβ, RIIβ, Cα e Cβ, resultando na formação de holoenzimas PKAI e PKAII [13, 24]. Os papéis específicos de PKAI e PKAII em plaquetas não foram investigados. Dados recentes sugerem que as plaquetas que não possuem RIIβ de PKA podem ser suprimidas em suacapacidade de se ativar, presumivelmente por causa da atividade inibidora não regulada da subunidade catalítica [ 51 ]. Outra maneira de ativar PKA envolve a liberação da subunidade catalítica de PKA a partir de um complexo nuclear-κB-IκB complexo [ 32 ]. A trombina eo colágeno são capazes de desencadear a liberação da subunidade catalítica de IκB, resultando na fosforilação das proteínas do substrato fosfoproteína estimulada por vasodilatador (VASP) e Rap1GAP2 [ 32 ]. Este mecanismo alternativo para a ativação de PKA pode representar um circuito de feedback negativo para a indução de plaquetas induzida por trombina e induzida por colágeno ( Fig. 1 ). 
Em contraste com a PKA, os domínios reguladores de ligação cGMP e catalítica de PKG são combinados dentro de uma molécula que se dimeriza através da sua região reguladora N-terminal [ 52-54 ]. A isoforma principal expressa em plaquetas humanas é PKGIβ. O knockout do gene PKGI em camundongos levou a um fenótipo protrombótico. Os efeitos de um análogo de cGMP na mudança de forma de plaquetas, liberação de grânulos e agregação foram abolidos em plaquetas com deficiência de PKGI, enquanto que os efeitos de um análogo de AMPc foram mantidos [ 55 ]. Além disso, as plaquetas de ratos com deficiência de PKGI aderiram mais fortemente às superfícies vasculares lesadas [ 55 ]. Os efeitos inibitórios dos dadores de NO na ligação de fibrinogênio foram perdidos em plaquetas com deficiência de PKGI, enquanto que os efeitos de um análogo de prostaciclina foram mantidos, indicando que a maioria dos efeitos da cGMP endógena são mediados por PKGI. Estudos em plaquetas humanas com deficiência de PKGI confirmam o papel da PKGI na inibição da libertação de Ca 2+ mediada por cGMP das lojas intracelulares [ 56 ]. Em 2003, um artigo de Li et al. provocou uma série de investigações sobre um potencial papel da PKGI na ativação plaquetária. Verificaram-se que as plaquetas de ratinhos knock-out PKGI exibiram distúrbios da propagação em VWF, e os tempos de sangramento desses animais foram ligeiramente aumentados [ 28 ]. Em experiências com análogos de cGMP permeáveis ​​à membrana, sugeriram-se níveis baixos de estimulação com PKGI para contribuir para a ativação plaquetária, enquanto que a estimulação prolongada da PKGI resultaria em inibição plaquetária [ 31 ]. Esses dados foram desafiados por outros grupos, que mostraram que o tratamento a curto prazo de plaquetas com baixas concentrações de análogos de cGMP pode levar a efeitos não específicos [ 33, 57 ]. Outra questão com o modelo bifásico proposto de função PKGI em plaquetas é a falta de dados consistentes sobre possíveis alvos de cGMP ou PKGI que possam mediar a ativação plaquetária. As sugestões iniciais de que a PKGI pode ativar a sinalização de proteína quinase ativada por mitógenos p38 (MAPK) [ 58 ] não pode ser confirmada [ 59,60 ]. Por outro lado, uma pesquisa recente por um grupo independente mostrou pequenos, mas significativos efeitos estimulantes de baixas concentrações de doadores de NO na liberação de Ca2 + de lojas intracelulares induzidas por baixas concentrações de trombina [ 61 ]. Em conjunto, esses achados mostram que um potencial papel da PKGI durante uma fase inicial específica de ativação plaquetária ainda não foi estabelecido. 
A sinalização de nucleotídeos cíclicos é compartimentada em vários tipos de células, e algumas evidências de localização da função cAMP e cGMP em plaquetas foram fornecidas [ 49,62 ]. A sinalização de cAMP localizado é frequentemente coordenada por proteínas de ancoragem A-quinase (AKAPs) que ligam a PKA e outros componentes de sinalização tais como PDEs, resultando na formação de compartimentos de sinalização de cAMP subcelular. Recentemente, com uma abordagem de triagem baseada em espectrometria de massa, sete AKAPs (AKAP1, AKAP2, AKAP7, AKAP9, AKAP10, AKAP11 e proteína 2 associada a microtúbulos) foram identificados em plaquetas [ 63 ], embora esses achados iniciais precisam ser verificados com métodos independentes. A análise do transcriptoma sugere que as plaquetas também podem expressar AKAP5, AKAP8, AKAP8L e AKAP13 [ 24 ]. A proteína de substrato PKGI IRAG representa a única proteína de ancoragem de G-quinase conhecida (GKAP) em plaquetas [ 64 ]. 
Substratos de proteína cinases dependentes de cAMP / cGMP 
As vias cAMP e cGMP inibem a ativação plaquetária, adesão, liberação de grânulos e agregação. Os substratos fosforilados de PKA e PKGI ligam a sinalização cAMP / cGMP aos resultados funcionais das funções de plaquetas bloqueadas. Poucas proteínas de substrato de PKA e PKGI foram identificadas até o momento, e os números e identidades totais de todos os substratos fosforilados permanecem desconhecidos. Os substratos PKA e PKGI em plaquetas podem ser amplamente agrupados em duas categorias principais: reguladores de sinalização e proteínas de ligação a actina (ABPs) ( Fig. 1 ). Um ponto interessante sobre a sinalização de nucleotídeos cíclicos nas plaquetas é que, em muitos casos, os sinais de cAMP e cGMP parecem convergir ao nível das proteínas do substrato, uma vez que a ativação de PKA e PKGI tende a resultar na fosforilação das mesmas proteínas ( Tabela 1 ). Ferramentas importantes para avaliar a fosforilação de proteínas em plaquetas intactas são anticorpos específicos para o fosforilação. Apenas alguns anticorpos contra sites de fosforilação de PKA / PKG estão atualmente disponíveis para estudos de plaquetas ( Tabela 1 ). As proteínas de substrato incluídas nesta revisão são proteínas para as quais a fosforilação em resposta à ativação de cAMP / cGMP foi mostrada em plaquetas intactas com anticorpos específicos do local de fosforilação ou marcação de 32 P. 
Tabela 1. Substratos de proteína quinase dependente de cAMP (proteína quinase A [PKA] I / II) e proteína quinase dependente de cGMP (proteína quinase G [PKG] I) em plaquetas 
G-proteínas e reguladores de proteína G 
Um dos primeiros substratos de PKA e PKGI a serem identificados em plaquetas foi a pequena proteína G Rap1B [ 65 ]. O local de fosforilação foi localizado no terminal C da proteína em Ser179, dentro de uma região de ligação à membrana [ 66 ]. Rap1B é um potente regulador da atividade da integrina, e rap1b - / - mostra o índice de plaquetas prejudicada e os tempos prolongados de sangramento da cauda [ 67 ]. Pouco se sabe sobre as conseqüências funcionais da fosforilação de Rap1B. A fosforilação não afeta a capacidade de Rap1 para ligar a GTP ou a sua atividade GTPase [ 68 ]. A cinética de fosforilação é muito mais lenta (minutos) do que a troca rápida entre os estados ligados ao GTP e ao PIB (segundos). A única conseqüência funcional conhecida da fosforilação Ser179 é uma redistribuição de Rap1 da membrana plasmática para o citosol [ 69 ]. A microscopia viva de Rap1B de tipo selvagem marcada com DsRed em células HeLa mostra a coloração de membrana plasmática, enquanto que um mutante fosfatométrico S179E Rap1B localiza o citoplasma (O. Danielewski e A. Smolenski, dados não publicados). Assim, a fosforilação de Rap1B em Ser179 parece ter impacto na localização subcelular de Rap1B. 
Considerando o papel vital da Rap1 na sinalização de integrina, a função e a regulação de sua atividade são de importância central. Estudos de níveis de Rap1-GTP em plaquetas humanas mostraram que a prostaciclina bloqueia a formação de Rap-GTP induzida por trombina [ 70 ]. NÃO os doadores e os análogos de cGMP ativadores de PKG bloqueiam a ativação de Rap1 induzida por trombina, induzida por colágeno e induzida por ADP, e este efeito mostrou envolver PKGI [ 71 ]. É importante notar que as plaquetas humanas não parecem expressar qualquer Epac, que é um ativador dependente do cAMP de Rap1 [ 72 ]. Assim, a sinalização de cAMP nas plaquetas é principalmente inibitória para Rap1. Para identificar o possível alvo de PKA e PKGI que poderia regular a atividade de Rap1 em plaquetas, Schultess et al. ARNm de plaquetas selecionadas para a expressão de fatores específicos de troca de nucleótidos de guanina (GEFs) e proteínas ativadorasde GTPase (GAPs) de Rap1. Isso resultou na identificação de Rap1GAP2 como o único GAP de Rap1 em plaquetas [ 72 ]. Estudos posteriores revelaram que Rap1GAP2 poderia ser fosforilado em Ser7 por PKA e PKGI e um anticorpo específico para o local de fosforilação foi utilizado para verificar a fosforilação em plaquetas tratadas com ativadores de cAMP e sinalização cGMP [ 72,73 ]. Um site de ligação 14-3-3 foi mapeado para o Ser9 vizinho de Rap1GAP2 [ 73 ]. As proteínas 14-3-3 são pequenas, proteínas de ligação à fosfoserina / treonina que funcionam como andaimes e, apesar de não possuírem atividade catalítica, podem regular componentes chave de sinalização [ 74 ]. Existem sete isoformas altamente conservadas em seres humanos, das quais seis são expressas em plaquetas [ 75 ]. Elevação de nucleótidos cíclicos e, portanto, ativação de PKA e PKGI, resulta em fosforilação de Ser7 e dissociação de 14-3-3 de Rap1GAP2. A ligação 14-3-3 parece amortecer a função de Rap1GAP2, enquanto que o desprendimento de 14-3-3 desencadeia atividade aumentada, resultando em uma adesão celular marcadamente reduzida em células transfectadas [ 73 ]. Curiosamente, a ativação plaquetária com agonistas, como ADP ou trombina, aumentou a ligação de Rap1GAP2 a 14-3-3, indicando que essa interação é regulada por via inibitória ativadora e cíclica dependente de nucleotídeos. A segmentação de Rap1 via Rap1GAP2 pode explicar alguns dos efeitos inibitórios de nucleotídeos cíclicos na ativação da integrina, adesão plaquetária e agregação. Além disso, PKA e PKG bloqueiam a liberação de Ca 2+ das lojas intracelulares, o que pode contribuir para a inibição da ativação de Rap1, como um dos GEFs de Rap1 em plaquetas, CalDAG-GEFI, é ativado por Ca 2+ [ 76 ]. A ativação da proteína Rap2B relacionada à Rap1B também é efetivamente bloqueada pelas vias de AMPc, embora os substratos de PKA envolvidos não tenham sido determinados [ 77 ]. 
Outra pequena proteína G que é regulada pelo cAMP e possivelmente também pelo cGMP é RhoA. RhoA está envolvido em fosforilação de cadeia leve de miosina, remodelação de actina, ativação de integrina e agregação de plaquetas. Tanto a prostaciclina quanto os ativadores PKA diretos bloqueiam a formação de RhoA-GTP, enquanto que os ativadores de PKG têm um efeito menos pronunciado [ 78 ]. A inibição de RhoA pode ser mediada por fosforilação do Gα 13 (G 13 ) heterotrimérico, que ativa os Rho-GEFs. G 13 pode ser fosforilado por caminhos de AMPc em plaquetas, e a fosforilação de G13 em Thr203 reduz a ativação de RhoA [ 79,80 ]. No entanto, não foram descritos anticorpos específicos do local de fosforilação contra Thr203 de G 13 e a fosforilação por PKGI não foi testada. Ainda outra pequena proteína G que demonstrou ser regulada por nucleotídeos cíclicos é Rac1. Rac1 está envolvido na formação de lamellopodia e liberação e agregação de grânulos de plaquetas. cAMP e cGMP mostraram bloquear a formação de Rac-GTP [ 78 ], mas os substratos PKA e PKGI que medem a inibição de Rac não são conhecidos. 
Complexo do receptor de inositol 1,4,5-trisfosfato (IP 3 ) (IP 3 -R) 
A elevação das concentrações intracelulares de Ca2 + desempenha um papel importante na ativação plaquetária. A ativação das isoformas de fosfolipase Cβ e fosfolipase Cγ leva à hidrólise do 4,5-bisfosfato de fosfatidilinositol, gerando IP3, que por sua vez desencadeia a liberação de Ca 2+ de lojas intracelulares através de canais IP 3 -R. As vias cAMP e cGMP inibem fortemente a elevação das concentrações citosolicas de Ca 2+ em plaquetas, incluindo todos os tipos de oscilações de Ca 2+ que foram observadas em condições de fluxo [ 81 ]. Pelo menos alguns desses efeitos são considerados mediados pela fosforilação direta de IP 3 -R [ 82 ]. As três isoformas de IP 3 -R são expressas em plaquetas e todas podem ser fosforiladas por PKA e PKGI em locais ainda desconhecidos [ 83 ]. 
Uma proteína associada IP 3 -R de tipo I chamada IRAG (proteína de substrato CGKI associada a IP 3 -R, também conhecida como MRVI1) foi claramente ligada à inibição da libertação de Ca2 + mediada por PKGI em plaquetas [ 64,84 ]. Os principais locais de fosforilação de IRAG são Ser664 e Ser677, e os anticorpos específicos do local de fosforilação foram utilizados para mostrar a fosforilação em plaquetas intactas em resposta a ativadores de sinalização cGMP [ 64 ]. Em um modelo de mouse que expressa uma forma mutante de IRAG que não se liga a IP 3 -R, a inibição da indução induzida por colágeno e da indução induzida por trombina por análogos de cGMP ou por doadores de NO foi significativamente prejudicada [ 64 ]. Os efeitos inibitórios dos doadores de NO na formação de trombos na artéria carótida intacta foram abolidos no mutante IRAG, enquanto os efeitos de prostacilina e cAMP foram mantidos. A deleção completa da expressão de IRAG em camundongos resultou em plaquetas hiperreactivas com uma resposta de agregação significativamente aumentada em relação a trombina, colágeno e U46619, um magnético de tromboxano [ 84 ]. Os estudos destas plaquetas deficientes em IRAG confirmaram que o IRAG está envolvido na inibição mediada por NO / cGMP de ativação, agregação e liberação de ATP dependentes de trombina, dependentes de colágeno e dependentes de U46619 [ II ]. Os efeitos de um análogo de AMPc na ativação da integrina não foram alterados em plaquetas deficientes em IRAG; no entanto, os efeitos da prostaciclina e do AMPc não foram estudados extensivamente [ 84 ]. PKGI associa com IP 3- IR / IRAG em plaquetas [ 64 ]. Além disso, o tipo I IP 3 -R mostrou-se que liga a PDE5 em plaquetas, proporcionando assim uma ligação entre PKGI e PDE5 [ 49 ]. Curiosamente, apenas uma fração de PDE5 plaquetária foi associada com IP 3 -R, e a PKGI pode preferencialmente fosforilar e ativar esta PDE5 associada a IP 3 -R, resultando em controle local sobre a inibição da libertação de Ca2 + dependente de cGMP [ 49 ]. Esses resultados representam a evidência inicial de sinalização de cGMP compartimentada em plaquetas; no entanto, outros dados sugerem que a maioria das PDE5 de plaquetas é ativada e fosforilada por cGMP e PKGI [ 48 ]. 
Os níveis de Ca 2+ são ainda regulados pelo canal de potencial de receptor transitório 6 (TRPC6), que mostrou ser um substrato de PKA e PKGI em plaquetas [ 85 ]. O TRPC6 poderia desempenhar um papel na entrada de Ca 2+ operada na loja, mas as conseqüências da fosforilação não são claras.TRPC6 foi relatada para formar um complexo com o tipo II IP 3 -R em plaquetas [ 86 ].
Outras proteínas de sinalização 
PDE5A é preferencialmente fosforiladas por PKGI em Ser92, resultando na activação de longo prazo da actividade de PDE e de degradação de cGMP [ 48 ]. Da mesma forma, PDE3A é fosforilada pela PKA em Ser312, e isto está associado com um aumento da actividade catalítica, o que resulta na degradação de cAMP [ 44 ]. Outro alvo de sinalização de vias de nucleótidos cíclicos em plaquetas é a p38 MAPK. activação de p38 MAPK é bloqueado por cAMP e cGMP [ 59,60 ]; no entanto, o pKa ou PKGI substratos que medeiam a inibição de p38 MAPK são desconhecidos. A glicoproteína (GP) Ib complexo é necessária para a adesão de plaquetas, e GPIbβ foi mostrado para ser fosforilada pela PKA em Ser166 [ 87 ]. Um anticorpo específico do local de fosforilação contra Ser166 foi descrito [ 88]. As consequências funcionais de GPIbβ Ser166 fosforilação não são claras. Ambos inibição e activação de adesão celular foram observados [ 88,89 ]. Ser166 também foi sugerido para desempenhar um papel na ligação de 14-3-3 ao GPIb complexo [ 90,91 ]; no entanto, outros sítios de ligação 14-3-3-têm sido descritos, e a importância da fosforilação em Ser166 14-3-3 ligação tem sido questionada [ 75 ]. O papel de cGMP / PKGI em GPIb fosforilação não foi investigada. Os resultados de um estudo utilizando plaquetas isoladas sugerem que o NO pode ser menos eficiente na inibição da aderência pelo próprio complexo GPIb, mas pode, em vez bloquear a activação da integrina secundária [ 92]. Um substrato potencial de PKA e PKGI em plaquetas queé geralmente mencionado é tromboxano receptor-α. No entanto, em 32 plaquetas marcadas com P, sem incorporação significativa de fosfato para o receptor de tromboxano no tratadas pela prostaglandina ou tratados com forscolina plaquetas pode ser detectada [ 93 ], e não há outros dados sobre a fosforilação do receptor de plaquetas intactas foram relatados. Abordagens de rastreio baseados em espectrometria de massa levaram à identificação de outros substratos de PKA e PKG putativos em plaquetas que precisam ser verificado com métodos independentes [ 94 ].
ABPs 
A regulação do citoesqueleto de actina é uma das principais funções de cAMP / cGMP sinalização em plaquetas. Uma das primeiras substratos de PKA e PKGI a ser identificado em plaquetas foi VASP [ 95 ]. VASP é expresso a uma alta concentração de 25 ~ u m em plaquetas [ 50 ], e os principais locais de fosforilação são Ser157 e Ser239 [ 96 ]. Análise da cinética de fosforilação indicou que Ser157 pode ser preferencialmente fosforiladas por PKA, enquanto que Ser239 é preferido por PKGI [ 97]. Os anticorpos específicos do local de fosforilação foram gerados contra fosforilada Ser157 e Ser239 fosforilada, e estes anticorpos têm sido amplamente utilizados como marcadores de actividade de nucleótido cíclico em plaquetas e outras células [ 97,98 ]. O mAb 16C2 contra Ser239 fosforilada foi usado num ensaio de citometria de fluxo para o controlo da função Gi do receptor P2Y12 ADP em pacientes [ 99 ]. Modelos de ratinho deficientes na expressão VASP têm mostrado que VASP de plaquetas está envolvida na activação de plaquetas e que medeia VASP NO-dependente inibição da adesão de plaquetas à parede do vaso [ 100101]. Além disso, a VASP parece estar envolvido nos efeitos inibidores de PKA e PKGI sobre a ligação do fibrinogénio e a agregação de plaquetas, mas não na inibição de Ca 2+ libertação ou secreção de grânulos [ 102 ]. VASP é claramente um importante regulador da dinâmica de actina, mas as consequências moleculares de VASP fosforilação em plaquetas não são bem definidas. A fosforilação inibe a ligação da VASP a F-actina, e reduz a agregação de F-actina in vitro [ 103 ]. VASP fosforilação também tem sido mostrado para ser envolvido na dinâmica de adesão focal [ 104 ] e na regulação da rigidez do citoesqueleto de actina [ 105 ]. Fosforilação de PKA-mediada de VASP em Ser157 pode ser controlada localmente por integrina β 3[ 106 ].
Outras proteínas associadas à actina que são fosforilados em plaquetas humanas incluem Lim e SH3 da proteína de domínio (LASP), proteína de choque térmico 27 (HSP27), filamina-A (ABP-280), e caldesmona. LASP é fosforilada pela PKA e PKGI em Ser146, resultando em ligao reduzida de LASP a F-actina e para focal aderências [ 107 ]. Durante a activação da trombina, LASP é fosforilada em Tyr171, provavelmente por Src-quinase [ 108 ]. A fosforilação de HSP27 por PKA e PKGI em Thr143 atenua a polimerização de actina dependente de HSP27 [ 109 ]. No momento do tratamento de ADP de plaquetas, HSP27 é fosforilada em serinas adicionais (Ser15, Ser78 e Ser82) por vias dependentes de p38 MAPK [ 110], O que sugere que, como acontece com LASP, vários eventos de fosforilação contribuir para a regulação da HSP27. Outro substrato se liga à actina de PKA é filamina-A. A fosforilação de filamina-A na Ser2152 protege filamina-A proteína contra a degradação [ 111,112 ]. A relevância da filamina-A estabilização para a função plaquetária não é clara. Curiosamente, filamina-A é necessária para a manutenção da estabilidade da membrana de plaquetas a níveis elevados de corte através da ligação à GPIb complexo [ 113 ]. Caldesmona é um PAF que tem sido mostrado para ser fosforilada pela sinalização induzida por prostaciclina em plaquetas humanas [ 114]. As consequências funcionais de fosforilação de caldesmona para o citoesqueleto de actina em plaquetas não foram estudados. Um substrato potencial de PKA e PKGI que foi mencionado nos comentários anteriores é a miosina-quinase de cadeia leve (MLCK). No entanto, no único estudo do MLCK fosforilação mostrou a fosforilação da MLCK purificado por PKA purificada in vitro, mas não em plaquetas intactas [ 115 ].
Conclusões 
Embora cAMP e cGMP têm sido conhecida a desempenhar um papel importante na regulação de plaquetas por muitos anos, os padrões moleculares e detalhes mediadoras este efeito estão apenas começando a emergir ( Fig. 1). A maioria, se não todas, das funções inibidoras de cAMP e cGMP nas plaquetas pode ser atribuída a fosforilação de proteínas de substrato e por PKA PKGI. Grupos de diferentes proteínas do substrato com as funções relacionadas contribuem para as acções inibidoras de PKA e PKGI. Actualmente substratos conhecidos podem ser amplamente classificadas em reguladores de sinalização e / ou reguladores de dinâmica de actina. regulação de sinalização envolve pequenas proteínas G Ras das famílias e Rho, tais como Rap1, RhoA, e Rac. Estas alterações dinâmicas na arquitectura do citoesqueleto de actina estão envolvidas em muitas respostas de plaquetas, incluindo alteração da forma, a aderência, a libertação de grânulos, e a agregação. Os efeitos de PKA e PKGI sobre SPA pode complementar os efeitos para as pequenas proteínas G, resultando no resultado líquido da adesão de plaquetas e agregação inibida.A evidência inicial para compartimentada de cAMP / cGMP sinalização em plaquetas, surgiu a partir de estudos de PI3 -RI complexo envolvido na regulação da Ca 2+ liberação dos estoques intracelulares. Regulamento de Ca 2+ níveis é susceptível de ter um grande impacto em muitas vias, incluindo a activação das proteínas G e a reacção de libertação de grânulos. Alguns dos substratos de PKA e PKGI identificados, ou seja, Rap1GAP2, PDE3A, e HSP27, parecem abrigar sítios de fosforilação adicionais, que são orientados por vias activadora. Vários eventos de fosforilação precisam ser traduzidos em resultados funcionais apropriados. Este pode, pelo menos em alguns casos, ser conseguida pela ligação de 14-3-3 diferencial, como mostrado, por Rap1GAP2 e PDE3A [ 44,73 ].
O controle adequado da reatividade plaquetária exige um cuidadoso equilíbrio entre activadora e vias de sinalização inibitórios. Activadores de plaquetas são conhecidos para neutralizar o sistema / cGMP de cAMP em vários níveis. Por exemplo, a sinalização do receptor Gi-acoplado atenua a síntese de cAMP, a activação dos resultados PDE3A na degradação de cAMP [ 44 ], e sinalização activadora de plaquetas interfere com a sinalização de nucleótido cíclico no nível de proteínas do substrato de PKA / PKG [ 73 ]. A trombospondina-1 foi sugerido para mediar a activação de plaquetas, bloqueando a sinalização de nucleótido cíclico no nível de sGC, PDE3A, PKA, e PKGI [ 116,117 ]. Por outro lado, os activadores de plaquetas podem cruzar-activar a sinalização de nucleótido cíclico inibidora, como mostrado para a activação induzida pelo vWF de sGC [22,28 ] e para induzida por trombina e a activação induzida por colagénio de PKA [ 32 ].
As principais questões em aberto no campo de plaquetas de sinalização / cGMP que precisam ser abordadas são: (i) os mecanismos e importância de novas vias de ativação GCs; (Ii) a compartimentalização da sinalização de cAMP / cGMP e o papel de isoformas AC, AKAPs, e GKAPs; (Iii) o papel específico de PKAI e PKAII isoformas; (Iv) o papel proposto de MFGc na activação das plaquetas por baixas concentrações de agonistas de plaquetas; (V) a identidade de todos os substratos de PKA e PKGI e a coordenação das suas acções; e (vi) a contribuição de defeitos nas vias cAMP / cGMP de plaquetas hiper-reactividade na doença cardiovascular. Estudos adicionais da rede de sinalização de cAMP / cGMP em plaquetas pode levar à identificação de novos marcadores da função plaquetária e reactividade, e possivelmente novos alvos terapêuticos.