Metabolismo de Nucleotídeos

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Revisar a estrutura de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos;
Distinguir entre as vias de novo e as vias de salvação que levam aos nucleotídeos;
Os nucleotídeos são precursores do DNA e RNA, carregadores de energia química e alguns são segundo-mensageiros celulares. 
Há dois tipos de vias que levam aos nucleotídeos: as vias de novo e as vias de salvação. 
A síntese de novo começa com seus precursores metabólicos: aminoácidos, ribose-5-fosfato, CO2 e NH3. Essa via para a biossíntese de purinas e pirimidinas parece quase igual em todos os organismos. As bases nitrogenadas não são intermediarias nessas vias. 
A estrutura do anel púrico é construída ligada à ribose durante todo o processo, com a adição de um ou de poucos átomos por vez.
O anel pirimídico é sintetizado como orotato, ligado à ribose-fosfato depois convertido nos nucleotídeos pirimídicos comuns, necessários para a síntese de ácidos nucleicos. 
Precursores são compartilhados para a síntese de pirimidina e purina. O PRPP (fosforribosil-pirofosfato) é importante pra ambas. Nessas vias, a estrutura da ribose é mantida no nucleotídeo produzido. 
Um aminoácido é um precursor importante em cada via:
Glicina para as Purinas
Aspartato para as Pirimidinas 
Glutamina é a fonte mais importante de grupos amina, participando em cinco passos das vias de novo. Aspartato também é usado como fonte do grupo amino, em dois passos. 
Na síntese das purinas, as enzimas estão presentes nas células como grande complexos multienzimáticos. 
Conjuntos celulares de nucleotídeos (exceto ATP) são muito pequenos para a síntese de DNA celular. Então, as células devem continuar sintetizar nucleotídeos. Em alguns casos, essa síntese de nucleotídeos pode limitar a velocidade de replicação e transcrição do DNA. 
A síntese salvação recicla as bases livres e nucleosídeos liberados a partir da degradação de ácidos nucleicos. As bases nitrogenadas livres são intermediarias em algumas das partes da via. 
Entender as vias de síntese de novo de nucleotídeos púricos e pirimídicos;
Síntese de N. Púricos
Os nucleotídeos púricos precursores púricos são AMP (adenilato) e GMP (guanilato), com suas respectivas bases púricas adenosina e guanina. 
No primeiro passo, a glutamina doa um grupo amino, que é ligado ao PRPP. O resultado (5-fosforribosilamina) é muito instável. O anel púrico é construído sobre essa estrutura, depois. 
No segundo passo, a glicina doa três átomos, que serão adicionados. Um ATP é consumido pra ativar o grupo carboxila da glicina, pra reação de condensação.
No terceiro passo, o grupo amino que foi adicionado é formilado pelo N10-formiltetra-hidrofolato.
No quarto passo, a glutamina doa um nitrogênio, antes que ocorra a próxima etapa 
No quinto passo, o anel desidrata e fecha, formando o anel imidazólico do núcleo púrico, com cinco membros, na forma de AIR (5-aminoimidazol-ribonucleotídeo). Aqui, três dos seis átomos que precisa pra formar o segundo anel da estrutura das purinas já estão no lugar.Só ocorre
em bactérias
e fungos
No sexto passo, adiciona um grupo carboxila. Essa carboxilação é incomum, por não requerer biotina, mas usar bicarbonato.
No sétimo passo, um rearranjo transfere o carboxilato do grupo amino exocíclico para a posição 4 do anel imidazólico
No sexto passo (em eucariotos superiores [o que inclui humanos]), o AIR produzido na etapa 5 é carboxilado em carboxiaminoimidazol-ribonucleotideo, numa reação catalisada pela AIR-carboxilase. O Aspartato doa seu grupo amino
No oitavo passo, há formação de uma ligação amina
No nono passo, ocorre a eliminação do esqueleto de carbono do aspartato, como fumarato 
No décima passo, o último carbono é doado pelo N10-formiltetra-hidrofolato
No décimo primeiro passo, ocorre um segundo fechamento do anel, produzindo o segundo anel fundido ao núcleo púrico. 
O primeiro intermediário com um anel púrico completo é o IMP (inosinato). As enzimas da íntese do IMP parecem estar organizadas em grandes complexos multienzimáticos na célula. 
Em humanos, uma enzima multifuncional combina as atividades da AIR-carboxilase (sexto passo) e SAICAR-sintetase (oitavo passo). 
A conversão de IMP em adenilato requer a inserção de um grupo amino derivado do aspartato. Isso ocorre por reações semelhantes às etapas 8 e 9. Porém, é o GTP (não o ATP) que fornece energia para a síntese de adenilssuccinato. 
O guanilato é produzido pela oxidação no C-2 do IMP, que depende de NAD+, tendo adição de um grupo amino, derivado da glutamina. E depois, um ATP é clivado em AMP e PPi.
Regulação de N. Púricos
Três mecanismos de feedback cooperam pra regular a velocidade da síntese dos n. púricos e a velocidade relativa da síntese dos produtos finais, adenilato (AMP) e guanilato (GMP)
Na transferência de um grupo amino pro PRPP formar 5-fosforribosilamina. Catalisada pela enzima alostérica glutamina-PRPP-amidotransferase. Ela é inibida pelos produtos finais IMP, AMP e GMP. Quando AMP e GMP se acumulam e ficam em excesso, inibem parcialmente o primeiro passo de sua biossíntese a partir de PRPP. 
Um excesso de GMP inibe a reação do IMP (feita pela IMP-desidrogenase), sem afetar a formação de AMP. Esse adenilato inibe a formação de adenilossuccinato pela adenilossuccinato-sintetase, sem afetar a formação de GMP. 
Quando AMP e GMP estão em quantidades suficientes, o IMP acumula e inibe um passo anterior da via, na estratégia chamada inibição sequencial por feedback.
GTP é necessário para IMP AMP. ATP é necessário para IMP GMP. É um arranjo reciproco, que tende equilibrar a síntese dos dois nucleotídeos. 
A inibição da síntese de PRPP pela regulação alostérica da ribose-fosfato-fosfocinase. ADP e GDP inibem a enzima que faz a síntese. 
Síntese de N. Pirimídicos
Os ribonucleotídeos pirimídicos são CMP (ditidilato) e UMP (uridina), que tem as pirimidinas citosina e uracila. 
O anel pirimídico de seis membros é sintetizado no início, depois ligado à ribose-5-fosfato. 
Também é necessário o carbamoil-fosfato, que também é intermediário no ciclo da ureia, mas produzido em locais e por enzimas diferentes:
Ureia é produzido na mitocôndria, pela ação da carbamoil-fosfato-sintetase I.
Nucleotídeos é produzido no citosol, pela forma II da mesma enzima. 
Carbamoil-fosfato + aspartato N-carbamoil-aspartato (aspartato-transcarbamoilase ou ATCase)
N-carbamoil-aspartato (desidrata) L-di-hidro-orotato, com anel pirimídico fechado (di-hidro-orotase)
L-di-hidro-orotato (oxidado) derivado pirimídico orotato, NAD+ aceptor final de e´ 
Nos eucariotos, carbamoil-fosfato-sintetase II, aspartato-transcarbamoilase e di-hidro-orotase são parte de uma única proteína trifuncional, a CAD. 
PRPP fornece a cadeia lateral para a ribose-5-fosfato.
Orotato + ribose-5-fosfato orotidilato
Orotidilato (descarboxilado) uridilato (fosforilado) UTP
UTP CTP (citidilato-sintetase). Tem formação de um intermediário, acil-fosfato, que consome um ATP
O doador de N geralmente é a glutamina, mas citidilato-sintetases de muitas espécies podem usar diretamente o NH4+.
Regulação de N. Pirimídicos
Em bactérias, a regulação é feita sobre a ação da ATCase, que catalisa a primeira reação e é inibida por CTP, produto final. 
A enzima tem seis subunidades catalíticas e seis subunidades reguladoras. As subunidades catalíticas ligam as moléculas de substrato, e as subunidades alostéricas ligam o inibidor alostérico, o CTP.
A molécula de ATCase completa, assim como suas subunidades, existe em duas conformações, ativa e inativa. Quando o CTP não estiver ligado às subunidades reguladoras, a enzima apresenta atividade máxima. À medida que o CTP se acumula e se liga às subunidades reguladoras, estas sofrem uma mudança em sua conformação. Essa mudança é transmitida às subunidades catalíticas, que então mudam para uma conformação inativa.
O ATP impede essas mudanças induzidas pelo CTP.
Compreender que os desoxirribonucleotídeos são formados a partir de ribonucleotídeos;
Os desoxirribonucleotídeos são produzidos a partir dos ribonucleotídeos correspondentes,por redução direta do átomo de carbono 2’ da D-ribose, formando o derivado 2’-desóxi
Por exemplo: ADP (redução) 2’-desoxiadenosina (dADP)
Essa reação é incomum, porque a redução ocorre em um carbono não ativado. É catalisada pela ribonucleotídeo-redutase. 
A redução da porção D-ribose de um ribonucleosídeo difosfatado em 2’-desóxi-D-ribose requer um par de átomos de hidrogênio, que são doados pelo NADPH, via tiorredoxina (proteína carregadora de H intermediária)
A tiorredoxina tem pares de grupo -SH, que carregam átomos de H do NADPH até o ribonucleotídeo difosfatado. Sua forma oxidada (dissulfeto) é reduzida pelo NADPH numa reação catalisada pela tiorredoxina-redutase. Reduzida, ela é usada pela ribonucleotídeo-redutase pra produzir NDP (nucleosídeos difosfatados), produzindo dNDP. 
A glutationa (GSH) também é uma fonte de equivalentes redutores. Ela serve como agente redutor pra uma proteína parecida com a tiorredoxina, a glutarredoxina, que transfere poder redutor à enzima ribonucleotídeo-redutase.
A ribonucleotídeo-redutase tem três classes, que diferem quanto ao grupo que fornece o radical no sitio ativo e os cofatores usados para gera-lo.
Classe I: a da E. coli. Requer oxigênio pra gerar o radical tiroxila, se ele estiver inativado. 
Classe II: encontradas em outros microorganismos. Tem 5’-desoxiadenosilcobalamina ao invés de centro de ferro binuclear. 
Classe III: evoluíram pra atuar em ambientes anaeróbios, diferente da I. Tem um centro ferro-enxofre, estruturalmente diferente do centro binuclear de ferro da enzima classe I. Requer NADPH e S-adenosilmetionina pra sua atividade. Usa nucleosídeos trifosfatados ao invés de difosfatados. 
Cada subunidade alfa da ribonucleotídeo-redutase tem dois tipos de sítios reguladores.
Um afeta a atividade geral da enzima e liga o ATP (ativa a enzima) ou o dATP (inativa ela)
O Segundo determina uma alteração na especificidade do substrato, em resposta à molécula efetora que se liga nele:
ATP ou dATP: redução de CDP e UDP é favorecida
dTTP: redução de GDP é favorecida
dGTP: redução de ADP é favorecida
Esse esquema é projetado pra fornecer um conjunto equilibrado de precursores para a síntese de DNA.
O ATP também é um ativador geral para a biossíntese e a redução de ribonucleotídeos. A presença de dATP em pequenas quantidades aumenta a redução de nucleotídeos pirimídicos
Um suprimento excessivo de dNTP pirimídico é sinalizado por altos níveis de dTTP, que altera a especificidade em favor da redução de GDP. Níveis elevados de dGTP deslocam a especificidade pra redução do ADP, e altos níveis de dATP inativam a enzima (como descrito na letra A)
Esses efeitos regulatórios são acompanhados por rearranjos estruturais na enzima. 
Entender a formação de timina a partir de dUMP e relacionar este fato à importância do ácido fólico;
O DNA contém timina em vez de uracila, e a via de novo até a timina envolve apenas desoxirribonucleotídeos.
O precursor imediato do timidilato (dTMP) é o dUMP. A conversão é catalisada pela timidilato-sintase. 
Uma unidade de um carbono, no estado -CH2OH, é transferida do N5,N10-metilenotetra-hidrofolato para o dUMP
Essa unidade é então reduzida até um grupo metila, ás custas de tetra-hidrofolato (oxida) di-hidrofolato
Di-hidrofolato (redução) tetra-hidrofolato (di-hidrofolato-redutase) 
Quando há deficiência de ácido fólico, alguns sintomas surgem da pouca síntese de timidilato, o que leva a uma incorporação anormal de uracila no DNA. Essa base nitrogenada é reconhecida pelo sistema de reparo do DNA e removida. Mas como tem muita uracila, essa remoção quebra as fitas, o que pode afetar a função e regulação do DNA nuclear, causando os efeitos (no coração, encéfalo, aumento da mutagênese) 
Identificar os produtos de degradação de purinas e pirimidinas: ácido úrico e ureia, respectivamente;
Degradação de Purinas (ác. úrico) 
Nessa via, os nucleotídeos perdem seu fosfato, pela ação da 5’-nucleotidase. 
Adenilato [AMP] (5’-nucleotidase) adenosina (adenosina-desaminase) inosina (hidrólise)hipoxantina + D-ribose
Hipoxantina (oxida) xantina + ácido úrico (xantina-oxidase)
A xantina-oxidase é uma flavoenzima, com um átomo de molibdênio e quatro centros de ferro-enxofre em seu grupo prostético. O oxigênio molecular é o aceptor de elétrons dessa reação.
O catabolismo de GMP também produz ácido úrico.
GMP (hidrólise) guanosina (clivagem) guanina livre 
Guanina livre (remoção hidrolítica do grupo amino) xantina ácido úrico (xantina-oxidase)
Na maioria dos mamíferos e em muitos outros vertebrados, o ácido úrico é ainda degradado até alantoína pela ação da urato-oxidase.
Degradação de Pirimidinas (ureia)
Pirimidinas NH4+ síntese de ureia 
Por exemplo: timina semialdeído metil-malônico (um intermediário do catabolismo da valina) degradado via propionil-CoA e metilmalonil-CoA succinil-CoA
Relacionar o excesso de ácido úrico à gota, uma doença das articulações;
A gota é uma doença das articulações, causada pela concentração elevada de ácido úrico no sangue e nos tecidos. As articulações tornam-se inflamadas, doloridas e artríticas devido à deposição anormal de cristais de urato de sódio.
Os rins também são afetados, pois ácido úrico em excesso se deposita nos túbulos renais. A gota ocorre predominantemente em pessoas do sexo masculino. Sua causa precisa não é conhecida, mas frequentemente envolve uma excreção reduzida de uratos. A deficiência genética de alguma enzima do metabolismo das purinas também pode ser um fator em alguns casos.
A gota pode ser tratada de maneira eficiente por uma combinação de terapias nutricionais e farmacológicas. Alimentos especialmente ricos em nucleotídeos e ácidos nucleicos, como fígado ou produtos glandulares, devem ser removidos da dieta. Um grande alívio dos sintomas pode ser obtido pela administração de alopurinol, que inibe a xantina-oxidase, a enzima que catalisa a conversão de purinas em ácido úrico. O alopurinol é um substrato da xantina-oxidase, que o converte em oxipurinol (aloxantina).
O oxipurinol inativa a forma reduzida da enzima permanecendo fortemente ligado ao seu sítio ativo. Quando a xantina-oxidase é inibida, os produtos de excreção do metabolismo das purinas são xantina e hipoxantina, que são mais hidrossolúveis que o ácido úrico e apresentam menor probabilidade de formar depósitos de cristais.
Entender por que muitos quimioterápicos têm como alvo enzimas das vias de biossíntese de nucleotídeos
O crescimento de células cancerosas não é controlado da mesma forma que o crescimento das células na maioria dos tecidos normais. As células cancerosas tem mais necessidade de nucleotídeos e consequentemente são mais sensíveis aos inibidores da biossíntese deles. 
O primeiro conjunto de inibidores incluem compostos que inibem glutamina-amidotransferases. Lembrando que a glutamina atua como doador de nitrogênio em cinco passos da biossíntese de nucleotídeos. 
Os sítios de ligação para a glutamina e o mecanismo pelo qual o NH4+ é extraído são bastante semelhantes em muitas dessas enzimas. A maioria delas é fortemente inibida por análogos da glutamina, como azasserina e acivicina. 
A timidilato-sintase e a di-hidrofolato-redutase, que fazem a via para a síntese de timina, também tem importância. A fluorouracila atua como inibidor na síntese de timidilato. Nas células, vias de salvação a convertem no desoxinucleosídeo monofosfatado FdUMP, que se liga à enzima, inativando-a.
O metotrexato inibe a di-hidrofolato-redutase. Ele atua como um inibidor competitivo. A enzima se liga à ele com mais afinidade do que o di-hidrofolato.
A aminopterina é um composto relacionado, que age de modo semelhante.
A trimetoprima é um antibiótico que se liga à di-hidrofolato-redutase bacteriana, usada em tratamento de certas infecções bacterianas urinárias e no ouvido médio.