Unidade IV Espectrofotometria

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UNIDADE IV 
 
ESPECTROFOTOMETRIA 
1 
Prof. Me. Augusto César R. Araújo 
Revisão aula passada 
2 
• Adaptação e acomodação do olho 
 
Adaptação a Luz (pupila – pálpebra – pigmentos) 
Adaptação a distância( Cristalino – Idade) 
 
Ponto Próximo (elasticidade) 
 
• Defeitos Óticos 
 
Emetropia – Olho normal 
Ametropia – Olho com defeito 
 
Revisão aula passada 
• Ametropia 
 
Aberrações (Esféricas – Cromáticas) 
 
Dispersão e Difração da luz 
 
Defeitos de transparência (Catarata) 
 
Defeitos de Forma (Miopia – Hipermetropia – 
Astigmatismo – Presbiopia) 
 
3 
Revisão aula passada 
• Visão e formação da imagem 
 
Deslocamento de retina 
 
Fotorreceptores (Cones e Bastonetes) 
 
Reações de Fototransdução 
 
Daltonismo 
 
4 
UNIDADE IV 
 
ESPECTROFOTOMETRIA 
5 
 FUNDAMENTOS DE ESPECTROFOTOMETRIA 
 CURVA DE ABSORÇÃO ESPECTRAL 
 EQUIPAMENTO - ESPECTROFOTÔMETRO 
 CURVA DE CALIBRAÇÃO 
 
Fundamentos 
 
6 
Substâncias 
Biológicas 
(Complexas) 
 Água 
 
 ÍONS (Na+ / K+ / Cl-/ 
 HCO3-) 
 
Uréia / Glicose 
 
Creatinina / Colesterol 
 
Lipídeos / Hormônios 
 
Fundamentos 
• Conceito do método 
 
É a determinação da concentração de substâncias em 
solução de acordo com a absorção e/ou emissão de 
radiação do espectro eletromagnético. 
 
Movimentação dos elétrons de átomos e moléculas 
 
Boa sensibilidade – Baixo custo – Fácil Operação 
 
 
7 
Fundamentos 
 
8 
Fundamentos 
• Luz – Onda Eletromagnética 
 
 
 
9 
Fundamentos 
• Luz 
 
Duas Naturezas: 
 
Comportamento Corpuscular – Efeito fotoelétrico (porta 
shopping, porta de elevador) 
 
Comportamento Ondulatório – Fenômenos de refração, 
reflexão, interferência, difração, polarização. 
 
10 
Fundamentos 
• Espectro Magnético 
 
É o arranjo ordenado das radiações conforme seus 
comprimentos de onda. 
 
Divisão conforme: 
 
Origem das radiações 
Fontes de origem 
Desenvolvimento dos Instrumentos 
11 
Fundamentos 
12 
Fundamentos 
• Espectro Visível 
 
 
13 
Fundamentos 
• Características da luz 
 
Comprimento de Onda (λ)– Ao se propagar no vácuo 
vibra percorrendo uma trajetória senoidal e passando por 
máximos e mínimos. 
 
 
14 
Fundamentos 
• Características da luz 
 
Comprimento de Onda – Unidades de Medida 
 
Micrometro - µm = 10-6 m 
 
Namometro – nm - 10-9 m 
 
Angstrom - Å - 10-10 m 
15 
Fundamentos 
• Características da luz 
 
Frequência (ν) 
Número de ondas que 
passa por determinado 
ponto por unidade de 
tempo. 
 
Unidade: s-1 
 
 
16 
Fundamentos 
• Características da luz 
 
Período (T) 
Tempo necessário para que haja oscilação completa por 
uma onda. 
 
Unidade: s 
 
17 
Fundamentos 
• Características da luz 
 
Relação da Comprimento de onda (λ) x frequência (ν) x 
Período (T) 
 
Obtém-se a velocidade de uma onda (v) ou no vácuo (c) 
 
V = s V = λ ν = 1 V = λ x 1 V = λ x ν 
 t T T T 
 
18 
Fundamentos 
• Características da luz 
 
É um conjunto de partículas (fótons) se deslocando no 
espaço com um comprimento de onda e uma frequência. 
 
Energia 
 
É a quantidade de energia radiante absorvida que permite 
a transição de um estado de menor energia para um 
estado de maior energia 
 
 
 
19 
Fundamentos 
• Características da luz 
Energia 
 
E – Energia 
 
ν – Frequência(s-1) 
 
h – Constante de Planck ( 6,63 x 10-34 J x s). 
 
 Unidade: ? 
 
20 
E = h x ν 
Fundamentos 
• Características da luz - Energia 
 
 
 
 
21 
Fundamentos 
• Características da luz 
 
Relação da Comprimento de onda (λ) x frequência (ν) 
x Energia (E) 
 
 
 λ E ν 
 
 
 λ E ν 
22 
Fundamentos 
• Características da luz - Energia 
 
 
 
 
23 
Fundamentos 
• Características da luz 
Energia - Exemplo 
 
1) Calcular a velocidade de uma onda de cor amarela 
com uma frequência de 30THz e de comprimento de 
onda 500nm. Em seguida calcular a energia 
proveniente desta onda. 
 
Identificar: ν / λ 
 
Calcular: v / E 
 
 
24 
Fundamentos 
• Características da luz 
Energia - Exemplo 
 
2) Calcular a velocidade de uma onda de cor amarela 
com período de 0,3 ps e de comprimento de onda 
650nm. Em seguida calcular a energia proveniente 
desta onda. 
 
Identificar: T / λ 
 
Calcular: v / E 
 
 
25 
Fundamentos 
• Absorbância 
 
Capacidade do material em 
absorver radiações em 
frequência específica. 
 
A absorbância é 
proporcional a sua 
concentração e a espessura 
que a luz atravessa 
 
 
26 
Fundamentos 
• Transmitância 
 
 
Razão entre intensidade da luz 
transmitida e da luz incidente. 
 
Se apresenta de maneira de não 
linear. 
 
Não apresenta tanto aplicação 
prática e por isso se utiliza mais 
a absorbância. 
 
27 
Curva de Absorção Espectral 
• Fundamento 
 
Quando se utiliza uma varredura do comprimento de 
onda desde o ultravioleta até o infravermelho para uma 
determinada substância, medindo a sua absorção e 
plotando em um gráfico ( λ x Absorção). 
 
Cada substância irá absorver em comprimento de onda 
específico. 
 
Se deve a presença dos grupos cromóforos. 
 
 
28 
CURVA DE ABSORÇÃO 
ESPECTRAL 
29 
Curva de Absorção Espectral 
• Curva de Absorção espectral 
 
 
 
30 
0.5 
1.0 
1.5 
1: bacterioclorofila; 2: clorofila a; 3: clorofila b; 
4: ficoeritrobilina; 5: beta-caroteno 
A
b
s
o
r
b
â
n
c
ia
 
Comprimento de onda 
(nm) 
Azul Verde 
Vermelho 
IV UV 
Espectro Visível 
Curva de Absorção Espectral 
• Curva de Absorção espectral - Cor complementar 
 
 
31 
Curva de Absorção Espectral 
• Função 
 
Identificar substâncias 
 
Identificar grupamentos químicos 
 
Indicar a pureza das substâncias 
 
Indicar o comprimento de onda para dosar as 
substâncias 
 
 
32 
EQUIPAMENTO 
ESPECTROFOTÔMETRO 
33 
EQUIPAMENTO 
• Conceito 
 
Gerar energia Luminosa; 
 
Selecionar comprimento de onda de luz específico; 
 
Passar raios de luz através da amostra; 
 
Medir a mudança na intensidade da luz na passagem; 
 
Mostrar a intensidade do sinal em display. 
34 
EQUIPAMENTO 
• Funcionamento 
35 
EQUIPAMENTO 
• Funcionamento 
 
Fonte 
 Luminosa 
 
36 
EQUIPAMENTO 
• Funcionamento 
 
Fonte Luminosa - Tipos de Lâmpadas 
 
Deutério e Hidrogênio – 200 a 400 nm (UV) T =1.000 h 
 
Tungstênio (W) – 320 a 2500 nm (VIS) T = 10.000 h 
 
Xenônio (Xe) – Maior durabilidade, Custo elevado (UV-
VIS) 
 
37 
EQUIPAMENTO 
• Funcionamento 
 
Monocromador 
 
Filtros 
de entrada 
e saída 
 
Luz 
Monocromática 
38 
EQUIPAMENTO 
• Funcionamento 
 
Monocromador 
 
Filtro de Entrada / Saída – Selecionam uma banda 
estreita de comprimento de onda desejadoPrisma ou Grade de Difração – Dispersam a radiação nos 
comprimentos de onda que a compõem e selecionam o 
comprimento de onda adequado para análise. 
 
 
39 
EQUIPAMENTO 
• Funcionamento 
 
Monocromador 
 
Espectrofotômetros 
 
Filtros 
 
Fotômetros 
 
 
 
40 
EQUIPAMENTO 
• Funcionamento 
 
Monocromador – Luz Monocromática 
 
Permite identificar compostos (sensibilidade); 
 
A quantidade de luz absorvida permite estabelecer a 
concentração da solução. 
41 
EQUIPAMENTO 
• Funcionamento 
 
Cubeta ( Armazenamento) 
Tipos 
42 
Vidro (Visível) 
 
Plástico (Visível) 
 
Cubeta de Quartzo (Ultravioleta) 
 
Poliestireno (340nm < λ >800 nm 
EQUIPAMENTO 
• Funcionamento 
 
Detector 
 
Produz sinal elétrico quando atingido por fótons 
 
Mede a resposta em função do comprimento de onda da 
radiação incidente. 
 
A informação é processada e decodificada como um sinal 
elétrico. 
43 
EQUIPAMENTO 
• Funcionamento 
 
Detector - Tipos 
 
Fotoemissão 
Fotocondução 
Fototubos 
Fotomultiplicadores 
Fotodiodos de silício 
Arranjo de fotodiodos 
44 
EQUIPAMENTO 
Detector - Tipos 
 
 
45 
Fotoemissão 
Fototubos 
EQUIPAMENTO 
Detector - Tipos 
 
 
 
 
46 
Fotomultiplicadores Fotodiodos 
EQUIPAMENTO 
Detector - Tipos 
 
 
 
 
47 
Fotodiodo de silício 
EQUIPAMENTO 
• Tipos 
 
 
 
 
Simples 
Feixe 
48 
EQUIPAMENTO 
• Tipos 
 
 
 
 
Duplo 
Feixe 
49 
CURVA DE CALIBRAÇÃO 
50 
Curva de Calibração 
 
Utilizado para se calibrar o equipamento que será 
utilizado na análise. 
 
Calibrar – Descobrir o erro inerente ao instrumento. 
 
Corresponde a relação gráfica entre os valores de 
absorbância (A) e os de concentração. 
 
Analisa a linearidade do método para que se possa 
determinar uma concentração de amostra desconhecida. 
 
51 
Curva de Calibração 
52 
CÁLCULO I 
Curva de Calibração 
• Lei de Lambert 
 
Quando a concentração 
da substância é 
constante, absorção 
depende do trajeto 
ótico. 
 
53 
Lei de Lambert 
Curva de Calibração 
• Lei de Beer 
 
A absorbância é 
diretamente proporcional 
a concentração da 
substância 
54 
Lei de Beer 
Curva de Calibração 
• Lei de Lambert – Beer 
 
A = a x b x c 
 
A – Absorção (nm) 
 
a – Absortividade (ε - absortividade molar (L/mol)) 
 
b – Caminho óptico (cm) 
 
c – Concentração (mol/L) 
55 
Curva de Calibração 
• Desvios da Lei de Lambert-Beer 
 
• Desvios químicos quando a espécie absorvente reage 
associa-se com o solvente. 
 
• Desvios instrumentais na escolha do comprimento de 
onda. 
 
• Desvios físicos em que pequenas concentrações não são 
bem analisadas quando equipamento possui baixa 
sensibilidade e em altas concentrações quase toda luz é 
absorvida. 
56 
EXERCÍCIOS 
DE 
FIXAÇÃO 
57 
EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 
 
1) Podem ser considerados fenômenos da natureza 
ondulatória da luz, exceto: 
 
a) Reflexão 
b) Refração 
c) Efeito fotoelétrico 
d) Interferência 
e) Difração 
 
 
58 
EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 
 
2) A luz com sua natureza ondulatória apresenta 
determinadas características , exceto: 
 
a) Velocidade 
b) Comprimento de Onda 
c) Energia 
d) Frequência 
e) Tensão Superficial 
 
 
59 
EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 
 
3) Assinale como verdadeiro (V) ou Falso (F) as 
afirmativas abaixo: 
 
a) Quanto maior o comprimento de onda menor é a 
energia 
b) Quanto menor o comprimento de onda menor é a 
frequência 
c) A transmitância se apresenta de maneira linear. 
d) O monocromador utiliza variados comprimentos de 
onda. 
 
60 
EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 
 
4) A qual se refere o seguinte enunciado: “Quando a 
concentração da substância é constante, absorção 
depende do trajeto ótico.” 
 
a) Lei de Dalton 
b) Lei de Snell 
c) Lei de Beer 
d) Lei de Lambert 
 
61 
Fundamentos 
 
5) Calcular a velocidade de uma onda de cor laranja 
com uma frequência de 155 THz e de comprimento 
de onda 690 nm. Em seguida calcular a energia 
proveniente desta onda. 
 
Identificar: ν / λ 
 
Calcular: v / E 
 
 
62