Aula 4_CRESCIMENTO_-_MICRO1

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CRESCIMENTO MICROBIANO
Aula Higiene na Agroindústria
Prof. Carla Schmidt
2014
Crescimento Microbiano
� 1. Fatores necessários para o crescimento
� - Fatores Físicos ( temperatura, pH, pressão osmótica)
� - Fatores Químicos (nutrientes, água, O2 etc.)
� 2. Meio de Cultura (Naturais e Artificiais)
� - Meio Complexo 
� - Meio Simples
� 3. Crescimento da cultura bacteriana
� - Quantificação Direta (nº. de colônias viáveis ou não)
� - Quantificação Indireta (turbidez, peso seco etc.)
CRESCIMENTO MICROBIANO:
Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a 
um aumento do número de células e não ao aumento 
das dimensões celulares.
Crescimento Microbiano = associado ao
crescimento de uma população de
células (uma célula dará origem a duas ao
fim de um certo tempo, tempo de
geração ou de duplicação.)
FATORES NECESSÁRIOS PARA O CRESCIMENTO
- FATORES FÍSICOS: 
temperatura
pH
pressão osmótica (concentração de sal)
- FATORES QUÍMICOS:
água
fontes de carbono e nitrogênio
minerais
oxigênio
fatores orgânicos
FATORES FÍSICOS
1. TEMPERATURA: 
A maioria dos microrganismos cresce bem nas temperaturas 
ideais para os seres humanos.
- Temperatura de crescimento mínima: 
< temperatura onde a espécie é capaz de crescer
- Temperatura de crescimento ótima:
onde a espécie apresenta melhor crescimento
- Temperatura de crescimento máxima:
> temperatura, onde ainda é possível o crescimento
Figura 1
Figura 1. Taxa de crescimento vs. temperatura
FATORES FÍSICOS
1. TEMPERATURA: 
Microrganismos são classificados em 3 grupos:
- Psicrófilos: crescem em baixas temperaturas (-10 a 15 °C)
- Mesófilos: crescem em temperaturas moderadas (10 a 50 °C)
- Termófilos: crescem em altas temperaturas (40 a 70 °C)
Termófilos extremos (68 a 110 °C)
Figura 2
Figura 2. Curva de crescimento característica de diferentes microrganimos
Termófilos extremos
Psicrófilos: temperatura ótima: 15 °C
encontrados em oceanos e regiões da Ártica
não causam problemas na preservação de alimentos
Psicrotróficos: temperatura ótima: 20 a 30 °C
crescem em temperatura de refrigeradores (4 °C)
encontrados em alimentos estragados
Mesófilos: temperatura ótima: 25 a 40 °C (mais encontrados) 
corpo de animais (temperatura da pele)
bactérias patogênicas: temp. ótima 37 °C
degradam alimentos e são patogênicos
Termófilos: temperatura ótima: 50 a 60 °C
ambiente de águas termais (***não crescem em temp. 
< 45 °C)
material estocado (altas temp.)= compostagem
Área de Alimentos
FATORES FÍSICOS
2. pH: 
- refere-se a acidez ou a alcalinidade de uma solução;
- maioria dos microrganismos cresce melhor perto da 
neutralidade (pH 6,5 – 7,5);
- poucas bactérias são capazes de crescer em pH ácido (como 
pH 4,0)
Bactérias: faixa entre pH 7,0
Exceções: 
- Bactérias acidófilas: alto grau de tolerância à acidez (Thiobacillus de 
0,5 a 6,0 com ótimo entre 2 e 3,5)
- Bactérias alcalófilas: (Bacillus e Archaea) (pH 10 – 11).
Fungos - tendem a ser mais acidófilos que as bactérias (pH <5).
Figura 3
Figura 3. Distribuição de alguns microrganismos de acordo com o pH
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)
FATORES FÍSICOS
3. PRESSÃO OSMÓTICA: 
Os microrganismos retiram da água a maioria dos nutrientes 
solúveis (conteúdo celular 80 – 90 % de água)
Pressão osmótica: retira a H2O dentro da célula
Reação Hipertônica: perda de H2O do meio intracelular para o 
extracelular, através da membrana plasmática (meio com 
concentração de sais).
Plasmólise: destruição da membrana plasmática da célula devido a 
perda de H2O por osmose.
Figura 4
Figura 4. Taxa de crescimento de alguns microrganimos vs. a concentração de sal.
Não Halófilos: não necessitam de sal e 
não toleram a presença no meio.
Halotolerantes: não necessitam de sal 
mas toleram a presença no meio.
Halófilos: necessitam de sal em uma 
concentração moderada
Halófilos extremos: necessitam de sal 
em altas concentrações.
-adição de sais: plasmólise
preservação de alimentos (peixe salgado, mel e leite)
Alta concentração de sal ou açúcar
Área de Alimentos
Halofílicos Extremos (ou obrigatórios): necessitam de altas concentrações
de sais para o crescimento
Halofílicos Facultativos: mais abundantes
não exigem altas concentrações de sais
-Adição de ágar:
normalmente 1,5% para solidificar o meio
> concentração = inibição de alguns microrganismo
> concentração de sal = pressão osmótica
FATORES QUÍMICOS
1. ÁGUA: 
- Essencial para os microrganismos
- Disponibilidade variável no ambiente
Ambiente com < concentração de água:
desenvolvem mecanismos para obter água através do aumento 
da concentração de solutos internos seja pelo bombeamento de 
íons para o interior celular ou pela síntese de solutos orgânicos 
(açúcares, álcoois ou aminoácidos).
FATORES QUÍMICOS
2. FONTES DE CARBONO, NITROGÊNIO, ENXOFRE E 
FÓSFORO: 
a) CARBONO:
essencial para a síntese de todos os compostos orgânicos 
necessários para a viabilidade celular (elemento estrutural básico 
para os seres vivos)
organismos quimio-heterotróficos: obtém C a partir de materiais 
orgânicos como proteínas, carboidratos e lipídeos.
organismos quimio-autotróficos
organismos fotoautotróficos C a partir de CO2
b) NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO:
- N, S: síntese de proteínas
- N, P: síntese de DNA e RNA, ATP
Peso seco de uma célula bacteriana: 14 % N, 4 % S, P
NITROGÊNIO
- utilizado para sintetizar os grupos aminos presentes nos 
aminoácidos.
Obtenção de N:
- Decomposição de materiais orgânicos (proteínas, aminoácidos)
- Amônia (NH4 +) 
- Nitrato (NO3-)
Fixação de N: algumas bactérias são capazes de utilizar N gasoso 
diretamente da atmosfera.
Microrganismos do solo (ex. bactérias dos gêneros Rhizobium e 
Bradyrhizobium) utilizam este processo para obtenção de N, tanto 
para elas como para as plantas que convivem simbioticamente 
(algumas leguminosas – soja, feijão).
Cultivo de leguminosas: > fertilidade do solo sem a necessidade de 
implementação de fertilizantes químicos
Bactérias Fixadoras de Nitrogênio
b) NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO:
ENXOFRE
- utilizado na síntese de aminoácidos contendo S e de vitaminas 
(tiamina e biotina).
FÓSFORO
- essencial para a síntese dos ácidos nucléicos e para os 
fosfolipídeos componentes da membrana celular.
Fontes naturais de S:
íon sulfato (SO4-2), sulfito de hidrogênio, aminoácidos
Fontes naturais de P:
íon fosfato (PO4-3), DNA, RNA, ATP
c) POTÁSSIO, MAGNÉSIO E CÁLCIO:
- também são elementos essenciais para os microrganismos
- frequentemente encontrados como co-fatores para as reações 
enzimáticas.
d) ELEMENTOS TRAÇOS:
- FERRO, COBRE, MOLIBDÊNIO, ZINCO
- utilizados como co-fatores essenciais para atividade de 
algumas enzimas 
utilizar água destilada para meio de cultura – contém todos os 
elementos traços
FATORES QUÍMICOS
3. OXIGÊNIO: 
- extremamente importante no desenvolvimento microbiano
- organismos classificados em:
Figura 5
1. AERÓBIOS
- Estritos (obrigados): necessitam de O2
- Facultativos: não necessitam de O2 mas crescem melhor com O2
- Microaerófilo: necessitam de O2 mas em níveis menores
2. ANAERÓBIOS
- Aerotolerantes: não necessitam de O2 mas crescem melhor sem O2
- Estritos (obrigados): não toleram O2 (letal)
AERÓBIO
ESTRITOS
alta [O2]
catalase
SOD
ANAERÓBIO 
ESTRITO
sem O2
ausência: 
catalase
SOD
MICRO
AERÓFILO
baixa [O2]
AERÓBIO 
FACULTATIVO
alta e baixa 
[O2]
catalase
SOD
alta e baixa 
[O2]
SOD
ANAERÓBIO 
AEROTOLERANTES
Figura 5. Efeito do oxigênio sobre o crescimento de vários tipos de bactérias.
Catalase e a
superóxido
dismutase
reduzem
para H2O os
compostos
tóxicos.MEIO DE CULTURA
MEIO DE CULTURA: material nutriente preparado no laboratório 
para o crescimento de microrganismos.
CULTURA: microrganismos que crescem e se multiplicam no meio 
de cultura.
MEIO DEFINIDO: TODA A COMPOSIÇÃO QUÍMICA É CONHECIDA
MEIO COMPLEXO: COMPOSIÇÃO QUÍMICA NÃO CONHECIDA 
(composto por nutrientes como extrato de levedura, de carne ou 
de plantas)
MEIO DE CULTURA
Meios líquidos: para obter melhor crescimento de
microrganismos, mais abundante, pois o contato com o material
nutritivo é mais fácil. São também usados para o estudo da
morfologia da célula e a sua motilidade, uma vez que oferecem à
célula, menos resistência.
MEIO DE CULTURA
Meios solidificáveis: usados para isolamento. Os microrganismos
desenvolvem na superfície dos meios sólidos, formando colônias.
Também têm emprego na conservação de cultivos por tempo mais
ou menos longo, pois o acesso lento aos elementos nutritivos
limita a reprodução.
MEIO DE CULTURA
MEIO DE CULTIVO SELETIVO E DIFERENCIAL: 
- meio seletivo: favorece o crescimento de uma determinada 
bactéria de interesse, impedindo o crescimento de outras 
bactérias.
Ex: ágar Sabouraud dextrose, pH 5,6, é utilizado no crescimento de 
fungos que são favorecidos, em relação as bactérias, pelo baixo pH.
- meio diferencial: facilita a identificação de um determinado 
organismo.
Ex: meio ágar-sangue, utilizado para a identificação de bactérias capazes 
de destruir células sangüíneas (anel claro em torno da colônia).
MEIO DE CULTURA
MEIO DE CULTIVO SELETIVO E DIFERENCIAL: 
MEIO DE CULTURA
MEIO DE CULTIVO SELETIVO E DIFERENCIAL: 
A. Klebsiella pneumoniae
B. Escherichia coli
C: Salmonella sp.
D: Proteus mirabilis
E: Pseudomona aeruginosa
ágar SS
MEIO DE CULTURA
MEIO DE ENRIQUECIMENTO:
favorece o desenvolvimento de uma população bacteriana que esta 
em desvantagem entre outras populações.
MEIOS REDUTORES:
meios com reagentes, como o tioglicolato de sódio, que é capaz 
de se combinar com o oxigênio dissolvido eliminando este 
elemento do meio de cultura (específico para microrganismos 
anaeróbicos).
CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS
- DIVISÃO BACTERIANA:
- FISSÃO BINÁRIA
- BROTAMENTO
- TEMPO DE GERAÇÃO:
- FASES DE CRESCIMENTO:
- FASE lag
- FASE log
- FASE ESTACIONÁRIA
- FASE DE MORTE CELULAR
CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS
DIVISÃO BACTERIANA: 
é considerado o aumento do número de indivíduos e não do 
tamanho celular.
1. BROTAMENTO: < nº de bactérias (forma um broto que quando 
atinge o tamanho da célula parental se separa)
2. FISSÃO BINÁRIA:
(1) alongamento da célula e a replicação do DNA cromossomal;
(2) início da invaginação da parede celular e da membrana 
plasmática;
(3) em um determinado momento, as duas seções da parede 
celular de encontram;
(4) produção de duas células individuais idênticas à célula mãe. 
Figura 6
Fissão Binária
(Adaptado de Tortora, G.J., et al., Microbiology,2003)
Figura 6. Fissão binária bacteriana.
CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS
TEMPO DE GERAÇÃO: 
é o tempo necessário para uma célula se dividir (e sua população 
dobrar de tamanho). 
- tempo varia de acordo com o organismo;
- depende das condições ambientais (nutricionais, temperatura 
etc);
- maioria das bactérias: 1 – 3 h 
FASES DE CRESCIMENTO 
CURVA DE CRESCIMENTO: 
demonstra o crescimento das células durante um período de 
tempo.
curva de crescimento obtida pela contagem da população em 
intervalos de tempo após um inóculo de um número pequeno de 
bactérias em meio de cultura. 
FASE lag: pouca ou ausência de divisão celular (fase de adaptação) - ≥ 1 hora
(estado de latência, com intensa atividade metabólica)
FASE log: início do processo de divisão (período de crescimento ou aumento 
logarítmo)
(reprodução celular extremamente ativa, sensíveis as mudanças 
ambientais - * EFEITO DE ANTIBIÓTICOS)
FASE ESTACIONÁRIA: velocidade de crescimento diminui
nº de células vivas = nº de células mortas
FASE DE MORTE CELULAR: nº de células mortas excede o de células novas.
Figura 7
Figura 7. Curva de crescimento bacteriano mostrando as 4 fases típicas.
Figura 7. Curva de crescimento bacteriano mostrando as 4 fases típicas.
PREVISÃO DE CRESCIMENTO DE MICRORGANISMO
EscherichiaEscherichiaEscherichiaEscherichia colicolicolicoli
SalmonellaeSalmonellaeSalmonellaeSalmonellae spspspsp....
StaphilococcusStaphilococcusStaphilococcusStaphilococcus aureusaureusaureusaureus
Condições:
20º C
pH=7,0
NaCl=0,5%
Gráfico mostrando curvas de crescimento de microrganismos - Software ComBase.
Software Disponível em: http://www.combase.cc/index.php/en/
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO 
QUANTIFICAÇÃO DIRETA: 
- CONTAGEM EM PLACAS
- FILTRAÇÃO
- MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL
- CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO
QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:
- TURBIDIMETRIA
- ATIVIDADE METABÓLICA
- PESO SECO
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO 
QUANTIFICAÇÃO DIRETA: 
(1) CONTAGEM EM PLACAS
- técnica mais utilizada na determinação do tamanho da 
população bacteriana;
VANTAGEM: quantificação de células viáveis
DESVANTAGEM: tempo (24 h para o aparecimento das colônias)
Figura 8
Cálculo:
nº de colônias na
placa x índice de
diluição da amostra =
nº de bactérias/mL
-DILUIÇÃO SERIADA
-MÉTODO DE
ESPALHAMENTO EM
PLACA
Figura 8. Contagem em placas e diluição seriada
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO 
QUANTIFICAÇÃO DIRETA: 
(2) FILTRAÇÃO
- < nº de bactérias = pode ser utilizado o método de filtração 
para a sua contagem.
- concentração de bactérias sobre a superfície de uma 
membrana de filtro de poros muito pequenos após a passagem 
de um volume de 100 mL de água.
- filtro posteriormente transferido para uma placa de petri 
contendo meio sólido.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO 
QUANTIFICAÇÃO DIRETA: 
(3) O MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)
- utilizado para microrganismos que não crescem bem em meio 
sólido.
A) diluição a partir de um alto volume de inóculo (ex. 10 mL)
B) diluição a partir de um médio volume de inóculo (ex. 1 mL)
c) diluição a partir de um baixo volume de inóculo (ex. 0,1 mL)
d) contagem do nº de tubos positivos
e) estimativa do nº de células/mL de bactérias
Figura 9
Figura 9. Método do número mais provável (NMP)
PARA ÁGUA:
PARA ALIMENTOS:
Diluição 10-1
Figura 9. Método do número mais provável (NMP)
Tabela de combinações (NMP)
3-3-1 
Índice de NMP/100 mL = ??
Inferior = ??
Superior = ??
Confiabilidade de 95%
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO 
QUANTIFICAÇÃO DIRETA: 
(4) CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO
- um volume conhecido de suspensão bacteriana é colocado em 
uma área definida da lâmina de microscópio.
- a amostra pode ser corada ou analisada a fresco.
- utilizam câmaras de contagem
DESVANTAGENS: - não separa células mortas e vivas
- pode haver erros de contagem
- difícil contagem para bactérias móveis Figura 10
Figura 10. Utilização da câmara de contagem Petroff-Hausser.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO 
QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: 
(1) TURBIDIMETRIA
- monitoramento do crescimento bacteriano através da turbidez
- espectrofotômetro (660 nm)
(2) ATIVIDADE METABÓLICA
- quantidade de um certo produto (como ácido ou CO2) é 
diretamente proporcional ao número de células bacterianas.
Figura 11
A quantidade de luz que atravessa o detector é inversamente proporcional ao nº. 
de bactérias.
Quanto > o nº. de bactérias < a quantidade de luz que é transmitida 
Figura 11. Determinação do nº de bactérias por turbidimetria.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO 
QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: 
(3) PESO SECO
- principalmente para fungos filamentosos
a) fungo é removidodo meio por filtração
b) seco em dessecador
c) posterior pesagem.
MÉTODOS DE SEMEADURA DE MICRORGANISMOS 
Técnicas de diluição em meios de cultura:
1. Técnica de diluição com semeadura em superfície:
o inóculo é espalhado na superfície do ágar com o auxílio de uma
alça de vidro (alça de Digralsky).
MÉTODOS DE SEMEADURA DE MICRORGANISMOS 
2. Método de diluição por pour-plate:
uma suspensão de células é colocada em placa de petri (1ml de
amostra) e posteriormente misturada, por uma série de
movimentos em forma de 8, com 20ml de ágar fundido a 45°C, que
se verte sobre o inóculo já depositado na placa. Quando o ágar se
solidificar, as células são nele imobilizadas, formando colônias.
MÉTODOS DE SEMEADURA DE MICRORGANISMOS 
3. Método de diluição em meio líquido:
faz-se a semeadura em profundidade com uma alça de níquel
cromo ou com uma pipeta. Com a alça deve-se introduzi-la no
meio e agitá-la levemente. Com a pipeta, depositar o inóculo no
fundo do tubo e aspirar algumas vezes com a pipeta para
homogeneizar.
MÉTODOS DE SEMEADURA DE MICRORGANISMOS 
Técnicas de esgotamento:
1. Técnica de esgotamento contínuo por estrias:
através de uma alça ou agulha de semeadura, esgota-se o material
por meio de estrias contínuas na superfície do meio de cultura
solidificado em placas ou em tubos em bisel longo.
2. Técnica de esgotamento descontínuo por estrias:
através de uma alça ou agulha de semeadura, esgota-se o material
por meio de estrias descontínuas, intercaladas com flambagens, na
superfície do meio.
MÉTODOS DE SEMEADURA DE MICRORGANISMOS 
2. Técnica de esgotamento descontínuo por estrias:
Colônias 
isoladas
Aparência das 
colônias após 
a incubação
Realizar a flambagem 
da alça entre os usos 
consecutivos até que 
a alça fique vermelha.
IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS 
1. Características dos microrganismos:
MORFOLOGIA DAS COLONIAS
 
IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS 
2. Coloração
Coloração simples: realizada com uma única solução corante.
As células coram-se uniformemente com esta técnica. (ex.:
Violeta de genciana)
Coloração diferencial: envolve mais de uma solução corante.
Evidencia diferenças entre as células microbianas ou parte
das células. (ex.: Coloração de Gram, Coloração de Zihel-
Nielsen)
IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS 
3. Características Metabólicas
Existem vários testes laboratoriais que podem determinar a
atividade metabólica (metabolismo oxidativo, metabolismo
fermentativo, catabolismo protéico) de um organismo.
O registro das reações realizadas por uma espécie microbiana
é útil e muitas vezes essencial para sua identificação.
IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS 
4. Características Fisiológicas
Condições físicas como a atmosfera gasosa, a temperatura, o
pH, a luminosidade e os fatores de crescimento próprios de
cada microrganismo também fornecem parâmetros para a
identificação.
Por exemplo, os microrganismos do corpo humano crescem a
35°C e os do oceano a temperaturas entre 4 e 20°C.
IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS 
5. Características Antigênicas
Uma célula microbiana apresenta estruturas físicas em sua
superfície que podem agir como antígeno e induzir, desta
forma, a produção de anticorpos.
Os anticorpos produzidos em animais de laboratório podem
ser usados para detectar a presença de antígenos únicos em
culturas bacterianas e são usados para caracterizar
microrganismos.
IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS 
6. Características patogênicas
A inoculação do microrganismo em hospedeiro sensível
(animal, plantas ou micróbios), com a finalidade de
reproduzir a doença, poderá determinar se este é ou não
um patógeno.
IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS 
6. Características patogênicas
IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS 
7. Características genéticas
Através dos avanços na biologia molecular surgiram técnicas
que permitem realizar análises genéticas para classificar ou
identificar os microrganismos ou compreender a sua
atividade, através de métodos mais sensíveis e precisos.
CONSERVAÇÃO DE CULTURAS PURAS 
Conservação por um curto período (dias a meses):
� Armazenagem à temperatura de refrigeradores (4°C a 10°C)
� Repiques freqüentes
Conservação por longos períodos:
� Nitrogênio líquido a -196°C
� Freezers a -70°C/ -120°C
� Liofilização (congelamento a seco):
Na liofilização as amostras são congeladas, desidratadas e
fechadas à vácuo, o que possibilita a viabilidade das
culturas por muitos anos. Esta técnica permite a obtenção
de uma coleção de microrganismos como referência, por
exemplo.