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1 ROSELI SANTOS DE FREITAS CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E PADRONIZAÇÃO DE ANTÍGENOS DE H. capsulatum VAR. capsulatum PARA O DIAGNÓSTICO DA HISTOPLASMOSE. Dissertação de Mestrado, apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo. Área de Concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública Orientadora: Dra. Adriana Pardini Vicentini São Paulo 2005 2 FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pelo Centro de Documentação – Coordenadoria de Controle de Doenças/SES Óreprodução autorizada pelo autor Freitas, Roseli Santos de Caracterização fenotípica e padronização de antígenos de Histoplasma capsulatum var. capsulatum para o diagnóstico da histoplasmose / Roseli Santos de Freitas – São Paulo, 2005. Dissertação (mestrado)—Programa de Pós- Graduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo. Área de concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública Orientadora: Adriana Pardini Vicentini 1. Histoplasma 2. Histoplasmose / diagnóstico 3. Antígenos 4. Testes sorológicos 5. Imunoquímica SES/CCD/CD-070/05 3 Este trabalho foi realizado na Seção de Imunologia do Serviço de Microbiologia e Imunologia da Divisão de Biologia Médica do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo e no Laboratório de Micologia Médica (LIM-53) do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo. Apoio Financeiro: Instituto Adolfo Lutz de São Paulo- Coordenadoria de Controle de Doenças- SES-SP. Projeto CTC-IAL # 107/97 e 06/04. 4 MENSAGEM 5 “Uma reflexão implica sempre em uma análise crítica do trabalho que realizamos. Se estamos fazendo uma reflexão sobre nosso trabalho estamos questionando sua validade, o significado que ele tem para nós e para com os sujeitos com quem trabalhamos, e para a comunidade da qual fazemos parte e que estamos construindo. A resposta as questões que nos propomos só pode ser encontrada em dois espaços: no da nossa prática, na experiência cotidiana da tarefa que procuramos desempenhar, e no da reflexão crítica sobre os problemas que essa prática faz surgir como desafios para nós. Questões-limites não são perguntas quaisquer. São perguntas que nascem de situações problemáticas e que, portanto, precisam ser respondidas. O que as caracteriza como problemáticas, aliás, é exatamente a necessidade de superação. Nós nos deparamos com inúmeros obstáculos em nossa vivência das situações em que nos encontramos. Só alguns deles, entretanto, merecem a denominação de problemas – são aqueles que têm uma significação especial em nossa perspectiva existencial e precisam sair de nosso caminho. Esse “tirar do caminho” um obstáculo tem sido chamado de solução do problema. Entretanto, se analisarmos bem, verificaremos que os problemas não sofrem uma solução, não são “solvidos”, não são solúveis. Eles são superáveis, devem ser superados. Quando superamos um problema, não diluímos – o que fazemos é seguir a dinâmica de um processo, no qual há como que uma absorção, um rearranjo de elementos, e em que se vai à frente de forma nova. Não deixamos para trás os elementos problemáticos; levamo-los conosco de outra maneira, incorporados á experiência, que é contínua”. Terezinha A. Rios, “O caminho educador” 6 DEDICATÓRIAS 7 Dedicatórias A Deus...sem Ti...nada é possível! Aos meus filhos Rodrigo, Rafael e André Felipe, maior conquista e razão da minha vida, pelos momentos em que não pude estar presente. Apesar de crianças sempre estavam prontos a me ajudar e compreender da maneira mais carinhosa. Amo vocês!!! A minha mãe Maria da Conceição, meu exemplo de dignidade, força e determinação. Obrigada por confiar em mim. A meus irmãos Rosemeire, Fernanda e Rildo, de perto ou de longe vocês são o meu amparo, meus companheiros nas horas felizes e nos momentos tristes. A meu cunhado Sérgio Luis e sobrinho Luis Henrique pelo incentivo e apoio durante toda esta trajetória. 8 AGRADECIMENTOS 9 Agradecimentos Especiais Ao Prof. Dr. Carlos da Silva Lacaz Que em minha carreira profissional foi o mestre que me orientou a ter a consciência da missão com o próximo, pois segundo ele, tudo que realizamos necessariamente tem que ser o melhor e “Tudo é para a glória de Deus e o bem estar da humanidade”, sendo que para conquistarmos o nosso ideal devemos nos lembrar de Camões: “As coisas árduas e lustrosas só se alcançam com trabalho e fadiga”. A Profa. Dra.Adriana Pardini Vicentini Eu creio que na vida nada é por acaso e que possuímos o que merecemos, por isso agradeço a Deus com todo meu coração e no mais intimo de minha alma a alegria de ter me concedido o melhor, ou seja, a orientação dedicada, profissional e amiga que me introduziu diretrizes e conhecimentos.que serão empregados durante toda minha vida científica. 10 Ao Prof. Dr. Cezar Mendes de Assis pela co-orientação, colaboração amiga, com opiniões enriquecedoras e essenciais no presente trabalho. Ao Prof. Dr. José Eduardo Costa Martins, Chefe do LIM-53 do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo, meu eterno agradecimento pelo apoio, confiança e incentivo. À pesquisadora Regina Tomie Kimura, Chefe da Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz, por ocasião do início de minha trajetória, minha eterna gratidão por permitir o desenvolvimento de grande parte deste trabalho junto ao Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses. Obridaga pela acolhida ... As pesquisadoras Elizabeth Maria Heins e Natalina Takahashi de Melo, pelos ensinamentos, amizade, apoio, carinho e compreensão durante estes longos anos de convivência. A amizade sincera e apoio de Simone Nunes de Azevedo, Otilia Batista e Jussara Clemente de S. P. Moraes. À Profa. Dra. Cídia Vasconcellos, pela amizade, disponibilidade e convívio agradável. Aos funcionários do Laboratório de Micologia do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo, em especial a Sra. Antônia Chagas dos Santos, Cláudia de Freitas Caetano e Creusa Paes Siqueira pela amizade, auxílio e por não terem medido esforços para me ajudar na conquista deste sonho... Aos funcionários, estagiários e pós-graduandos dos Laboratórios de Micologia e Sorologia do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo (LIM 53), Judith Maria de Jesus, Simone Rocha, Sonia Cristina Cavalcante, Vivian Ribeiro Kloth, Cecília Eugenia Charbel, Cristiane Neves Pereira, Sarah Desihee Cavalcanti, Ísis Riboldi,Teixeira, Giovana Letícia Henandez Arriagada, Mônica Martinelli Scarpelli Vidal e Kátia Cristina Dantas, pela amizade e pelos bons momentos que passamos juntos. 11 Aos colegas do Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses da Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz: Lenice Elpídio de Oliveira, Décio Fragata da Silva, Jarita de Oliveira Carvalho-Vivi e Daniele de Lima Franco meu muito obrigada pelo apoio, amizade, momentos de descontração e compreensão na execução deste trabalho. Aos funcionários da Seção de Imunologia, em especial a Sra. Irene Mara Zamboni, Srta. Lúcia Cupertino Barreto, Sr. Vasco Gouveia, pela amizade e valoroso auxílio. Obrigada por não ter medido esforços para me ajudar... Aos pesquisadores, estagiários e pós-graduandos da Seção de Imunologia do Instituto Adolofo Lutz pelo apoio, amizade e momentos de descontração. Aos docentes, funcionários, estagiários e alunos, em especial do Laboratório de Sorologia da Profa.. Dra.. Maria Aparecida Shikanai Yasuda, Claúdia de Abreu Fonseca, Aya Sadahiro e Márcia Andréia Ferreira. Ao Almir Robson Ferreira e Maria Iranides Santana de Oliveira, setor de Programação Visual, meu sincero agradecimento pela amizade e disponibilidade.As funcionárias da Seção de Coleção de Culturas do Instituto Adolfo Lutz: Lia Teixeira e Mônica Cândida Gear Gete Scola pelo inestimável auxilio na liofilização dos antígenos de Histoplasma capsulatum, obrigada pelo apoio e compreensão. À Profa. Dra. Claudete Rodrigues de Paula do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo da Universidade Federal de São Paulo e Ricardo Bamman do Instituto de Infectologia Emílio Ribas, pelas sugestões apresentadas no exame de qualificação. À Dra. Maria de Fátima Costa Pires, coordenadora do Programa de Pós- Graduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, pela colaboração. 12 À Secretaria de Pós-Graduação da Área de Concentração Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças em especial as Sras. Tirces Francine e Liria Maria de Jesus Silva pelo atendimento sempre carinhoso e colaboração. A bibliotecária Sandra do Centro de Documentação da Coordenadoria de Controle de Doenças-SES pelas informações e auxilio. Ao Paulo César da Costa dos Santos, pelo inestimável auxílio na análise estatística dos resultados. A Beatriz Julieta Celeste, do Laboratório de Sorologia (LIM 48), pela doação de soros de pacientes com leishmaniose. Ao Instituto Adolfo Lutz, pelo auxílio financeiro, que viabilizou a execução deste trabalho. Aos pacientes que anônima e voluntariamente, entregam-se à ciência. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento desse trabalho. 13 RESUMO Doze amostras de H. capsulatum foram avaliadas quanto aos aspectos fenotípicos e cinética de crescimento em ágar batata e ágar Sabouraud-dextrose, a 27o C, durante 45 e 90 dias respectivamente. Trinta e três porcento apresentaram textura velutínea e cotonosa, saliência e/ou elevação central, sulcos radiais, faixas concêntricas e pigmentos centrais e difusos. A microscopia óptica verificou-se hifas hialinas, delgadas, septadas, micro e macroaleuroconídios tuberculados; apresentando média de 47 dias para a fase estacionária. 67% eram cotonosas com tendência a ser plana, sendo 75% cotonosa e branca, com hifas delgadas e septadas. Antígenos de H. capsulatum foram obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), a partir das amostras cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose a 27o C durante 15 e 33 dias. A extração dos determinantes antigênicos foi realizada, cobrindo-se as culturas com solução de mertiolato-borato 1:5000 por 24 h, a temperatura ambiente. A imunoreatividade dos antígenos foi avaliada por imunodifusão dupla (ID) e immunoblotting (IB) frente a soros homólogos e heterólogos e anticorpos policlonais espécie- específicos e heterólogos. Verificamos aumento na sensibilidade da técnica de ID quando empregamos antígeno obtido das amostras 200 e 406, em ambos os tempos de cultivos e 20 vezes concentrado, observando ainda que todos os antígenos avaliados apresentaram 100% de especificidade. Por IB, observamos intensa reatividade dos soros de pacientes com HP doença e infecção frente às frações de 74 e 120 kDa. Concluímos que para a obtenção de antígenos com boa especificidade e sensibilidade, a escolha da amostra fúngica bem como o meio de cultura assume grande importância. Além disto, a metodologia adotada para a obtenção dos mesmos mostrou-se uma alternativa de baixo custo operacional, de fácil exeqüibilidade, consumindo menor tempo para sua produção. Palavras chaves: Histoplasma, histoplasmose/diagnóstico, antígenos, testes sorológicos, imunoquímica. 14 ABSTRACT Twelve H. capsulatum samples were cultivated at 27 ºC in potato agar and in Sabouraud-dextrose agar during 33 and 90 days in order to evaluate their phenotypical aspects as well as their growth curve. Thirty three percent showed cottony texture, salience and/or semi-elevated central surface, radial groove, concentric areas, and diffuse and central pigments. By microscopic observation we verified septate, thin, hyaline hyphae and microaleuroconidia and tuberculate macroaleuroconida; showing 47 days to the stationary phase. 67% were cottony texture, plane tendency and 75% were cottony white with septate, thin hyphae. H. capsulatum antigens were obtained from isolates cultivated at 27º C on Sabouraud-dextrose agar for 15 and 33 days. After incubation mycelial cells were suspended in aqueous solution of thimerosal (1:5,000) at room temperature for 24 h. The immunoreactivity pattern of antigens were evaluated, using the immunodifusion (ID) and immunoblotting (IB) assays against homologous and heterologous serum and species-specific and heterologous polyclonal antibodies. Through ID, it was verified that the best pattern of reactivity was observed for antigens obtained with 33 days of culture from the isolates 200 and 406 and for the antigen 200 with 15 days of culture. By IB, it was observed intense reactivity of the sera from patients with HP (infection or illness) against epitopes with molecular mass from 74 to 119 kDa. It is noteworth that the antigen from sample 200, with 15 or 33 days of culture, presented the best pattern of recognition against the homologous sera. The results suggest the employment of the soluble antigen from sample 200 in the ID assay due to its good capacity to discriminate both sera from patients with HP illness and HP infection, besides its high specificity (100%) against heterologous sera. Key words: H. capsulatum var. capsulatum, histoplasmosis, antigens, imunodiagnosis. 15 LISTA DE ABREVIATURAS mL Microlitro mm Micrômetro A. fumigatus Aspergillus fumigatus A. nidulans Aspergillus nidulans A. niger Aspergillus niger Ag Antígeno Ag Hc Antígeno de H. capsulatum Ag Pb Antígeno de P. brasiliensis Aids Acquired immunodeficiency syndrome B. dermatitidis Blastomyces dermatitidis BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyphosphate BHI Brain heart infusion Bp Pares de base C. immitis Coccidioides immitis C. neoformans Cryptococcus neoformans CD Cluster de diferenciação CDC Center for Diseases Control CIE Contraimunoeletroforese Da Daltons cm Centímetro ELISA Enzyme-liked immunosorbent assay EUA Estados Unidos da América FC Fixação de complemento g Gramas GG Gomori-Crocott H Hora H. capsulatum Histoplasma capsulatum H. capsulatum var. duboisii Histoplasma capsulatum variedade duboisii H. capsulatum var. capsulatum Histoplasma capsulatum variedade capsulatum 16 HE Hematoxilina-Eosina HIV Vírus da Imunodeficiência Humana HP Histoplasmose HTT Hipersensibilidade do tipo tardio IAL Instituto Adolfo Lutz IB Immunoblotting ID Imunodifusão dupla IgG Imunoglobulina G IgM Imunoglobulina M IL-12 Interleucina 12 INF-g Interferon gama kDa Kilo Dalton mA Miliamper mg Miligramas mL Mililitro mM Milimolar mm Milímetros NBT Azul de nitrotetrazolio NGTA Neopeptona Glicose Tiamina e Asparagina ºC Graus Celsius P. brasiliensis Paracoccidioides brasiliensis P. marneffei Penicilium marneffei p/v Peso/volume PAS Ácido Periódico de Schiff PBS Solução salina tamponada com fosfatos PBS-T Solução salina tamponada com fosfato acrescida de Tween 20 pH Concentração hidrogênio-iônica PM PMSF Peso molecular Fenil-metil-sulfonil-fluorato RAPD Randon amplified polymorphic DNA Rf Reference front 17 RIA Radioimmunoassay SAB Ágar Sabouraud-dextrose SDS Sódio Dodecil Sulfato SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com sódio dodecil sulfato Sida STA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Sabouraud-tiamina-asparagina TemedN,N, N,’- tetrametil-etilenodiamina Th Linfócitos T helper TNF-a Fator de necrose tumoral alfa Tris Tris-(hidroxi-metil)-amino-metano V Volts v/v Volume/volume Rpm Rotação por minuto mm Milímetro 18 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Isolamento de Histoplasma capsulatum var. capsulatum de solos brasileiros 36 Tabela 2. Microepidemias de HP no Brasil (1959-1978) 38 Tabela 3. Amostras de H. capsulatum var. capsulatum 80 Tabela 4. Aspectos morfológicos das culturas de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar batata e ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, por 33 dias 95 Tabela 5. Aspectos micromorfológicos das culturas de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar batata, segundo Ridell (1950), 27oC, por 45 dias 98 Tabela 6. Aspectos macromorfológicos das culturas de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, por 90 dias. 106 Tabela 7. Dosagem protéica, segundo Bradford (1976), dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 10 e 20 vezes concentrados, cultivados em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, por 15 e 33 dias, segundo Kaufman e Standard (1978) 107 Tabela 8. Screening dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, in natura, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias 112 Tabela 9. Screening dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 10 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias 113 19 Tabela 10. Screening dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias 114 Tabela 11. Padrão de reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 10, 20 e 30 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 15 dias 116 Tabela 12. Padrão de reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias frente a soros de pacientes com histoplasmose doença e histoplasmose infecção, pela técnica de imunodifusão dupla 117 Tabela 13. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, 15 dias frente a soros de pacientes com histoplasmose doença e infecção 119 Tabela 14. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, 33 dias frente a soros de pacientes com histoplasmose doença e infecção 121 Tabela 15. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias, 20 avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose doença 123 Tabela 15 a. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias, avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose infecção 124 Tabela 15 b. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 15 dias, avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose doença 124 Tabela 15 c. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 15 dias, avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose infecção 125 Tabela 16. Perfil eletroforético observado em SDS-PAGE a 10%, dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 10 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud- dextrose, 27ºC, por 33 dias 126 21 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Macromorfologia das culturas 49 (A), 200 (B), 299 (C), 340 (D), 268 (E) e 406 (F) de H. capsulatum var. capsulatum cultivadas em ágar batata, 27ºC, por 33 dias 96 Figura 2. Macromorfologia das culturas 49 (A), 212 (B), 361 (C), 406 (D), 2030 (E) e RP (F) de H. capsulatum var. capsulatum cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias 96 Figura 3. Micromorfologia das culturas 49, 200, 212, 268, 299, 340, 361, 406, 584, 802, 2030 e RP de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar batata, 27ºC, por 45 dias 97 Figura 4. Curva de crescimento das amostras 49 (A) e 200 (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 90 dias 99 Figura 5. Curva de crescimento das amostras 212 (A) e 268 (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 90 dias 100 Figura 6. Curva de crescimento das amostras 299 (A) e 340 (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 90 dias 101 Figura 7. Curva de crescimento das amostras 361 (A) e 406 (B) de H. capsulatum var. capsultum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 90 dias. 102 Figura 8. Curva de crescimento das amostras 584 (A) e 802 (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 90 dias 103 22 Figura 9. Curva de crescimento das amostras 2030 (A) e RP (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 90 dias 104 Figura 10. Anverso e verso das colôniasgigantes das amostras de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 90 dias 105 Figura 11. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 33 dias, frente a anticorpo policlonal anti-antígeno de H. capsulatum. 115 Figura 12. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 15 dias, frente a soros de pacientes com histoplasmose doença 120 Figura 13. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, 33 dias, frente a soros de pacientes com histoplasmose doença 122 Figura 13 a. Reatividade dos exoantígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, 33 dias, frente a soros de pacientes com histoplasmose infecção 122 Figura 14. Perfil eletroforético dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, 33 dias. Linha 1: Padrão de Peso Molecular; linha 2: Exoantígeno de Referência (Filtrado de Cultura de H. capsulatum var. capsulatum- Faculdade de Farmácia da 23 Universidade Estadual Paulista de Araraquara); linha 3: Ag Hc 49, linha 4: Ag Hc 200; linha 5: Ag Hc 212, linha 6: Ag Hc 268; linha 7: Ag Hc 299; linha 8: Ag Hc 340; linha 9: Ag Hc 361; linha 10: Ag Hc 406; linha 11: Ag Hc 584; linha 12: Ag Hc 802; linha 13: Ag Hc 2030 e linha 14: Ag Hc RP. Concentração dos Ag Hc aplicados nos slots 3 a 14: 10 vezes concentrados. 127 Figura 15. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a antígeno da amostra 49, 10 vezes concentrado,obtido segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias 130 Figura 16. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a antígeno da amostra 200, 10 vezes concentrado,obtido segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias 130 Figura 17. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a antígeno da amostra 268, 10 vezes concentrado,obtido segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias 131 Figura 18. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a antígeno da amostra 406, 10 vezes concentrado,obtido segundo 24 Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias 131 Figura 19. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a antígeno da amostra 200, 10 vezes concentrado,obtido segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 15 dias 132 Figura 20. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a antígeno da amostra 268, 10 vezes concentrado,obtido segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 15 dias 132 Figura 21. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a antígeno da amostra 406, 10 vezes concentrado,obtido segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, por 15 dias 133 Figura 22. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de indivíduos pertencentes a um grupo de espeleólogos (1 a 17), grupo de indivíduos que trabalham com fungos (18 a 21), anticorpo policlonal anti-exoantígeno de H. capsulatum (22), pool de soros de indivíduos com leishmaniose (23), pool de soro de indivíduos saudáveis (24), frente a antígeno da amostra 200,10 vezes concentrado, cultivada em ágar Sabouraud-dextrose a 27ºC, por 33 dias 135 25 Figura 23. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-P. brasiliensis frente a soros de indivíduos pertencentes a um grupo de espeleólogos (1 a 17), grupo de indivíduos que trabalham com fungos (18 a 21) e pool de soro de indivíduos saudáveis (22), frente a exoantígeno da amostra 113 de P. brasiliensis cultivada em caldo NGTA a 36ºC, por 20 dias 135 Figura 24. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-A. fumigatus frente a soros de indivíduos pertencentes a um grupo de espeleólogos (1 a 17), grupo de indivíduos que trabalham com fungos (18 a 21) e pool de soro de indivíduos saudáveis (22), frente a exoantígeno de A. fumigatus (pool das amostras 354, 356 e 727), 10 vezes concentrado, cultivadas em caldo Sabouraud-dextrose, a 27º C, por 30 dias 136 Figura 25. Estabilidade dos antígenos das amostras de H. capsulatum, 12 meses após obtenção, frente a anticorpo policlonal anti-exoantígeno de H. capsulatum. Lâmina A: Antígenos das amostras 49, 200, 268 e 406, 20 vezes concentrado. Lâmina B: Antígenos das amostras 49, 200, 268 e 406, 10 vezes concentrado 137 26 INDICE 1.0. Introdução 30 1.1. Histórico da Histoplasmose 30 1.2. Etiologia do H. capsulatum 32 1.3. Distribuição Geográfica e Ecoepidemiologia 32 1.4. Aspectos Clínicos da Histoplasmose 39 1.4.1. Histoplasmose Infecção 40 1.4..2. Histoplasmose Doença 41 1.4.2.1. Histoplasmose Disseminada41 1.4.2.2. Histoplasmose Disseminada Aguda 42 1.4.2.3. Histoplasmose Disseminada Sub-aguda 43 1.4.2.4. Histoplasmose Disseminada Crônica 43 1.5. Resposta Imunológica 44 1.5.1. Resposta Imune Celular 44 1.5.2. Resposta Imune Humoral 46 1.6. Tratamento da Histoplasmose 47 1.7. Diagnóstico Laboratorial da Histoplasmose 48 1.7.1. Exame Direto 48 1.7.1.2. Isolamento 51 1.7.1.3. Técnicas Sorológicas 53 1.7.1.4. Técnicas Moleculares 57 1.8. Antígenos de Histoplasma capsulatum var. capsulatum 60 2.0. Relevância 68 27 3.0. Objetivos 71 4.0. Considerações Éticas 72 5.0. Delineamento Experimental 73 6.0 Materiais e Métodos 74 6.1. Amostras Fúngicas 74 6.1.1. Amostras de H. capsulatum var. capsulatum 74 6.1.2. Amostras de Paracoccidioides brasiliensis 74 6.1.3. Amostras de Aspergillus fumigatus 74 6.2. Animais 75 6.3. Soros 75 6.3.1. Soro Controle Positivo de Referência 77 6.3.2. Soros Hiperimunes Obtidos em Coelhos 77 6.4. Aspectos Morfológicos das Amostras de H. capsulatum var. capsulatum 78 6.4.1. Cultivo das Células Fúngicas em Tubos 78 6.4.2. Cultivo das Células Fúngicas em Placas e Curva de Crescimento 78 6.4.3. Cultivo em Lâminas 78 6.5. Meios de Cultura 82 6.6. Antígenos Fúngicos 82 6.6.1. Antígeno de H. capsulatum var. capsulatum 82 6.6.2. Exoantígeno de P. brasiliensis 83 6.6.3. Exoantígeno de A. fumigatus 83 6.6.4. Antígenos de Referência de H. capsulatum 84 28 6.7. Determinação da Viabilidade Fúngica dos Antígenos 84 6.8. Determinação da Esterilidade dos Antígenos 85 6.9. Determinação de Proteínas 85 6.10. Imunodifusão Dupla em Gel de Agarose 85 6.11. Análise do Perfil Eletroforético dos Anttígenos de H. capsulatum var. capsulatum 87 6.11.1. SDS-PAGE 87 6.11.2.Immunoblotting 88 6.11.3. Detecção do Peso Molecular 90 6.12. Antissoros 90 6.12.1. Soro de Coelhos Anti- Antígeno de H. capsulatum var. capsulatum 90 6.12.2. Soro de Coelho Anti- Exoantígeno de P. brasiliensis e Anti- Exoantígeno de A. fumigatus 91 6.13. Purificação de Imunoglobulinas 91 6.14. Titulação dos Antissoros 92 6.15. Análise Estatística 92 7.0. Resultados 94 7.1. Aspectos Morfológicos das Amostras de H. capsulatum 94 7.2. Curva de Crescimento das Células Micelianas de H. capsulatum var. capsulatum e Aspectos Fenotípicos das Colônias Fúngicas 94 7.3. Dosagem Protéica dos Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum 107 7.4. Screening dos Antígenos de H. capsulatum 108 29 7.5. Análise do Padrão de Reatividade dos Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum 118 7.6. Perfil Eletroforético dos Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum 125 7.7. Immunoblotting para Detecção da Reatividade de Anticorpos anti- H. capsulatum em Soros de Pacientes com HP doença e infecção 128 7.8. Estudo da Estabilidade dos Antígenos de H. capsulatum 137 8.0. Discussão 138 9.0. Conclusões 152 10.0. Referências Bibliográficas 154 Anexos 174 30 1.0. INTRODUÇÃO 1.1. Histórico da Histoplasmose O primeiro caso de histoplasmose (HP) foi estudado no Panamá, por Samuel Darling (1905), ao necropsiar um negro no Ancon Hospital, encontrando numerosos parasitos, redondos ou ovais, sendo na sua maioria fagocitados, observado em microscopia óptica de tecido dos pulmões, baço e fígado. Em 1906, em nova necropsia realizada na Martinica encontrou outro caso apresentando os mesmos caracteres anátomo-patológicos, ainda no mesmo ano, observou um terceiro caso, em nativo do Cantão que residia há alguns meses, no Panamá. A partir dos achados destas três necropsias, Darling individualizou esta nova doença que se caracterizava particularmente por febre irregular, com hepato-esplenomegalia acentuada e leucopenia. Do ponto de vista anatomo-patológico, a doença manifestava-se com aumento de elementos retículo-histiocitários e presença de numerosos parasitos, redondos ou ovais, muito semelhantes a leishmanias, no interior dos histiócitos, que foram considerados por Darling como protozoários. Ele procurava, nas autopsias que realizava, casos suspeitos de calazar ou leishmaniose visceral e por isso selecionava os doentes falecidos que apresentassem quadro clínico com manifestações de leucopenia, febre irregular e hepato-esplenomegalia.Ao encontrar nos tecidos lesados o microrganismo pensou, inicialmente, que se tratasse de um novo protozoário, denominando-o primeiramente de Histoplasma capsulata, a seguir corrigindo para Histoplasma capsulatum (Alves, 1996; Lacaz et al., 2002). Após os relatos de Darling, numerosos casos de HP foram registrados, contribuindo de forma expressiva para compreensão desta patologia. Comparando o material estudado por Darling (1906), com casos de linfangite epizoótica causada por H. farciminosum e esfregaços de 31 sangue de casos de leihsmaniose, Rocha Lima (1912), verificou que o H. capsulatum apresentava, morfologicamente, maior semelhança com leveduras do que com protozoários. Neste estudo, o autor enfatizou as propriedades de impregnação de corantes, a presença de formas em brotamento e a ausência de formas flageladas descrita anteriormente por Darling. Dodd e Tompkins (1932), diagnosticaram o primeiro caso de HP em esfregaços de sangue periférico de uma criança portadora de anemia incomum, residente no Estado de Tennesse (EUA). Este material foi enviado para De Monbreum (1934), que realizou com sucesso o primeiro isolamento de H. capsulatum. O autor demonstrou também o dimorfismo desta espécie fúngica, por meio da inoculação em animais de experimentação, concluindo que formas saprofíticas do fungo provavelmente existiam livres na natureza, causando doença, em humanos, com quadro não fatal mais freqüentemente do que se supunha. O primeiro caso de HP no Brasil foi diagnosticado através do exame de fragmentos de fígado de uma criança, sendo encontrado células retículo-endoteliais parasitadas pelo H. capsulatum (Villela e Madureira Pará, 1941). Com o advento da Aids, em 1981, observou-se aumento do número de casos de HP disseminada associada àquela patologia em zonas endêmicas, sendo que esta associação pode ser desencadeada pelo despertar de processos pulmonares quiescentes (Wheat et al., 1986) e apresentando-se como a primeira infecção oportunística associada a outras infecções e ou neoplasias em pacientes residentes ou procedentes de zonas endêmicas, fato que levou o CDC-USA, em 1985, quando não havia provas sorológicas e moleculares para a identificação do HIV, a incluir a HP disseminada como infecção “marcadora” de Aids. 32 1.2. Etiologia do H. capsulatum Anamorfo:Histoplasma capsulatum var. capsulatum. Darling (1906). Histoplasma capsulatum var. duboisii. Ciferri (1960). Teleomorfo: Emonsiella capsulata. Kwon-Chung (1972). Ajellomyces capsulatus. McGinnis et Katz (1979). A HP é infecção causada por três variedades de fungos pertencentes ao gênero Histoplasma: H. capsulatum var. capsulatum; H. capsulatum var. duboisii e H. capsulatum var. farciminosum. As duas primeiras variedades causam infecção em humanos e animais e a var. farcimonosum é o agente da linfangite epizoótica (Alves, 1996; Lacaz et al., 1998, Lacaz et al., 2002). O agente etiológico da HP clássica ou Doença de Darling é o H. capsulatum var. capsulatum, sendo que o seu teleomorfo é o A. capsulatus. Este microrganismo no estado anamorfo pertence ao reino Fungi, subdivisão Deuteromycotina, classe Hyphomycetes, ordem Moniliales, família Moniliaceae e gênero Histoplasma; enquanto o seu teleomorfo pertence à subdivisão Ascomycotina, classe Ascomycetes, ordem Onygenales e gênero Ajellomyces. A forma sexuada ou teleomorfa das duas primeiras variedades de Histoplasma receberam, inicialmente, a denominação de Emonsiella capsulata e posteriormente de Ajellomyces capsulatus (McGinnis e Katz,1979; Kwon-Chung e Bennett, 1992; Lacaz et al., 1998; Lacaz et al., 2002). 1.3. Distribuição Geográfica e Ecoepidemiologia A HP é micose sistêmica que apresenta ampla distribuição geográfica, sendo possível detectar casos autóctones em mais de 60 países distribuídos nos diversos continentes, principalmente na área compreendida 33 entre 45° latitude ao norte e 30° latitude ao sul do Equador. No entanto, apresenta nítida prevalência nos continentes Americano e Africano. Nas Américas estende-se desde o sul do Canadá até as regiões centrais da Argentina, sendo que as zonas endêmicas de maior importância se situam em Ohio, Bacia do Rio Prata, Serra do Mar, Vales do Rio Mississipi e Missouri (Zancopé-Oliveira e Wanke, 1987; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Silva et al., 1999; Negroni, 2001; Panackal et al., 2002; Lacaz et al., 2002). Casos da doença têm sido descritos nas regiões oeste e sudeste da Europa, no oeste da Ásia e Austrália, contudo, estes se encontram comumente limitados a um único ou a um número muito pequeno, não se sabendo ao certo a fonte de infecção. Soma-se a isto, o fato de nenhum surto epidêmico ter sido descrito até o momento fora do continente americano (Panackal et al., 2002). No Brasil, a ocorrência da HP tem sido descrita pela observação de casos clínicos autóctones, seja sob a forma de casos isolados ou sob a forma de microepidemias, bem como pela realização de inquéritos epidemiológicos empregando o teste cutâneo da histoplasmina (Zancopé- Oliveira e Wanke, 1987; Silva-Vergara e Martinez, 1998; Severo et al., 2001; Cury et al., 2001). H. capsulatum é habitualmente encontrado em regiões de clima tropical ou temperado, com temperatura média anual entre 15 a 22o C, índice pluviométrico anual de 1000 mm e umidade relativa do ar de 67 a 87 % (Negroni, 2001; Lacaz et al., 2002). Acredita-se que alguns ou o conjunto de fatores descritos anteriormente determinam a distribuição do H. capsulatum no meio ambiente, geralmente havendo associação de seu isolamento com microambientes fechados, como cavernas ou grutas, construções abandonadas, galinheiros, celeiros, florestas ou qualquer local onde o solo encontra-se enriquecido com excretas de aves e/ou morcegos (Zancopé- 34 Oliveira e Wanke, 1987; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Silva et al., 1999; Negroni, 2001). Determinadas características físico-químicas do solo como textura e acidez, associadas ao enriquecimento do mesmo por dejetos de aves e quirópteros, que atuariam como importante fonte de nitrogênio, têm sido consideradas por diversos autores como meio de cultura adequado para o crescimento, desenvolvimento e disseminação deste patógeno (Zancopé- Oliveira, 1987; Silva et al., 1999; Negroni, 2001). Segundo Kwon-Chung e Bennett (1992), locais onde existem elevadas concentrações de aves ou morcegos podem dar origem a surtos epidêmicos ou microepidêmicos que diferem em sua magnitude quando da exposição simultânea de pessoas ao agente infectante. Em publicação recente Panackal et al. (2002), relatam que na América do Norte a HP tem sido considerada por diversos pesquisadores como doença recreacional entre espeleólogos. Segundo os autores 60 a 64% dos indivíduos que possuem o hábito de freqüentar cavernas e ou grutas apresentam teste cutâneo positivo à histoplasmina. Recentemente, maio de 2001, um grupo de 15 estudantes do Estado da Geórgia-EUA viajou para Nicarágua onde visitaram uma mina de prata. Três dias após o retorno do grupo para os EUA, 12 (80%) indivíduos apresentaram sinais clínicos compatíveis com HP aguda, confirmada posteriormente por meio de provas sorológicas (Panackal et al., 2002). Erkens et al. (2002), descrevem a presença de anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum, empregando a técnica de immunoblotting, em cinco integrantes de um grupo de oito pesquisadores alemães, que haviam passado dez dias em Cuba, estudando os hábitos de morcegos. Registrou-se também, que duas pessoas do grupo que relataram a utilização de máscaras faciais, não apresentaram nenhuma sintomatologia, 35 enfatizando assim, a necessidade e importância do uso de equipamentos de proteção individual para pessoasque visitam cavernas. H. capsulatum tem sido isolado de diferentes fontes ambientais como ar, solo de cavernas e grutas, bem como de vísceras e fezes de morcegos, ratos, cães e outros animais silvestres (Emmons, 1949; Silva e Paula, 1956; Silva, 1961 apud Silva-Vergara et al., 2001; Araújo, 1970; Arias et al., 1982; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Lacaz et al., 1998; Cury et al., 2001; Lacaz et al., 2002). Zancopé-Oliveira e Wanke (1986), realizaram a captura de 103 animais silvestres nativos no Município do Rio de Janeiro, isolando H. capsulatum de vísceras de três animais (2,9%), aparentemente sadios; sendo dois marsupiais (Metachirus opossum) e um rato (Rattus rattus). Taylor et al. (1999), descreveram o isolamento de H. capsulatum das vísceras (intestino, pulmão, fígado e baço) em 17, de um total de 208, morcegos capturados nos Estados de Guerrero e Morelos, no México. Silva-Vergara et al. (2001), demonstraram o isolamento de H. capsulatum no Estado de Minas Gerais, a partir de cultura de vísceras de Didelphis albiventris, uma espécie de marsupial encontrado no Brasil. Os autores chamam a atenção para a ampla distribuição geográfica deste mamífero pelo continente, a qual coincide com a distribuição da HP. A Tabela 1 resume os isolamentos do H. capsulatum a partir de amostras de solo de diferentes regiões do Brasil, a grande maioria obtida de locais com elevada quantidade de excretas de galinhas e morcegos. 36 Tabela 1. Isolamento de H. capsulatum var. capsulatum de solos brasileiros. Localidade Associação com aves ou morcegos Amostras examinadas Amostras positivas Referência Jacobina (BA) Galinheiros 50 01 Silva,1956 Ubatuba/Caraguatatuba (SP) Fezes de Morcegos 01 01 Fava Netto, 1967 Lagoa Santa (MG) Galinheiro 02 01 Araújo,1970 Brasília (DF) Fezes de morcego 15 02 Schmidt ,1973 Humboldt (MT) Galinheiro 06 01 Moraes e Almeida,1976 Angra dos Reis (RJ) Galinheiro 02 02 Wanke,1985 Angra dos Reis (RJ) Fezes de Morcego 04 02 Wanke,1985 São Gonçalo (RJ) Fezes de morcego 07 05 Wanke,1985 Petrópolis/Itaipava (RJ) Fezes de morcego 18 13 Wanke,1985 Niterói/Rio do Ouro (RJ) Fezes de morcego 05 03 Wanke,1985 General Câmara (RS) Galinheiro -------- -------- Severo, 1986 Fonte: Zancopé-Oliveira, 1987. O último relato de isolamento de H. capsulatum a partir de amostras de solo realizado no Brasil foi o conduzido por Zancopé-Oliveira e Wanke (1987). Neste estudo, os autores avaliaram o índice de contaminação do solo pelo H. capsulatum na localidade de Rio da Prata (RJ), área periurbana com características rurais. A análise de 111 amostras de solo coletadas em diferentes locais revelou positividade em oito (7,2%). Todas as amostras para análise foram colhidas de galinheiros, sendo que em um destes foi observado a existência de guano de morcegos. Segundo os pesquisadores, o elevado nível de contaminação do solo nesta região pode ser comparado aos níveis observados em áreas endêmicas para esta micose nos EUA. 37 Testes intradérmicos empregando a histoplasmina têm sido realizados em cães, no rebanho bovino e eqüino, a fim de verificar a incidência da HP infecção. Estes inquéritos epidemiológicos revelam que 50% dos cães e gatos abrigam esta espécie fúngica, sendo considerados, portanto, como disseminadores desta enfermidade, sugerindo desta forma, que a infecção primária possa acontecer primeiramente em hospedeiros animais. Acredita-se que a transmissão ao homem possa estar associada à presença de determinados vetores invertebrados, como os carrapatos; estando assim relacionada tanto a ocupações rurais como urbanas (Alves, 1996; Lacaz et al., 2002). Em 1945, importante estudo epidemiológico contribuiu para a demonstração da reatividade cutânea à histoplasmina, correlacionando-a a presença de calcificações pulmonares em indivíduos tuberculina negativos (Christie e Peterson, 1945). Palmer (1946), em estudo multicêntrico realizado nos EUA, onde avaliou 10.580 enfermeiras, demonstrou a incidência de reagentes à histoplasmina. O autor verificou que o Estado de Kansas apresentava o maior índice de positividade (7,1%), encontrou, contudo, 58,1% de provas duvidosas. A média dos casos positivos foi de 3,2% e casos duvidosos de 20,1%. No Brasil, pelo fato da HP não ser doença de notificação compulsória, fica extremamente difícil o mapeamento da real distribuição deste processo infeccioso. A Tabela 2 resume as microepidemias ocorridas em território nacional no período compreendido entre 1959 e 1987. Tabela 2. Microepidemias de HP no Brasil (1959-1987). 38 Fontes de infecção Nº de casos Autor (es) e ano de publicação 1. Gruta com morcegos/Paraíba do Sul/RJ 13 Paula (1959) 2. Caixa d’agua/ Santa Teresa/RJ 07 Tufic Simão (1959) 3. Forro de casa/ Ubatuba/SP 08 Fava Netto et al. (1967) 4. Gruta com morcegos/ Vassouras/RJ 05 Paula & Pomp (1972) 5. Gruta com morcegos/ Brasília/DF 14 Schmidt et al. (1973) 6. Gruta com morcegos/ Rio de Janeiro/RJ 05 Rego et al. (1976) 7. Gruta com morcegos/ Ubatuba/SP 10 Fava Netto et al. (1976) 8. Gruta/ Angra dos Reis/RJ 08 Mello et al. (1976) 9. Gruta/ Rio do Ouro – Niterói /RJ 08 Peçanha et al. (1981) 10. Mina abandonada/ São Gonçalo/RJ 10 Wanke (1981) 11. Mina abandonada/ São Gonçalo/RJ 04 Wanke (1981) 12. Minas abandonadas/ Itaipava /RJ 10 Wanke (1981) 13. Minas abandonadas/ Itaipava /RJ 05 Wanke (1981 14. Minas abandonadas/ Niterói /RJ 05 Wanke (1982) 15. Gualinheiro/ Tinguá/RJ 10 Bethlem et al (1984) 16. Galeria de águas/ Pendotiba/RJ 10 Paula e Aidê (1979) 17. Bueiro/ Borborema/PB 06 Fernandes & Costa (1967) Fonte: Aloysio de Paula (1988) apud Lacaz et al., 2002. Wanke (1985), estudou a epidemiologia da HP, empregando como antígeno a histoplasmina, avaliando população de 453 indivíduos, na região hiper-endêmica de Praia Vermelha (Ilha Grande, Angra dos Reis, RJ), encontrando 94,6% de positividade ao ensaio de HTT. O autor demonstrou também, que minas abandonadas de caulim eram a fonte de infecção desta microepidemia de HP aguda. Neste estudo o agente etiológico desta micose foi isolado em rato-paca (Proechimys dimidiatus); roedor silvestre comum naquela área. 39 Zancopé-Oliveira e Wanke (1986), realizaram em área periurbana do Município do Rio de Janeiro (localidade de Rio da Prata) inquérito epidemiológico com histoplasmina em 470 escolares, com faixa etária entre 5 a 14 anos, encontrando 19,6% de positividade. Neste mesmo trabalho, a autora, realizou inquérito epidemiológico empregando paracoccidioidina em 455 crianças da mesma região. A leitura foi realizada em 433 crianças, apresentando 9,2% de positividade (40 reações). Severo et al. (2001), relataram a endemicidade da HP no Estado do Rio Grande do Sul, particularmente na região do Vale do Rio Jacuí. Segundo o autor, H. capsulatum tem sido isolado do solo e 89% da população masculina jovem desta região apresenta positividade ao teste cutâneo com histoplasmina. Cury et al. (2002), descreveram casos de HP pulmonar aguda desenvolvida por quatro indivíduos que freqüentavam cavernas habitadas por morcegos, na cidade de Pedro Leopoldo, Estado de Minas Gerais. 1.4. Aspectos Clínicos da Histoplasmose H. capsulatum não é regularmente um microrganismo oportunista, contudo, nas últimas décadas o aumento de sua incidência tem sido observado em pacientes imunocomprometidos,entre os quais podem-se citar aqueles portadores de doenças hematológicas malignas, acometidos pelo vírus da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (HIV/Aids), pacientes transplantados ou indivíduos que receberam terapias citotóxicas ou imunossupressoras (Wu-Hsieh e Howard, 1989; Alves, 1996; Lacaz et al., 1998; Marques et al., 2000; Cury et al., 2001; Negroni, 2001; Lacaz et al., 2002). A HP é uma infecção fúngica caracterizada por determinar variadas manifestações clínicas no hospedeiro, desde infecção 40 assintomática até doença disseminada (Silva et al., 1999; Marques et al., 2000; Lacaz et al., 2002). Acredita-se que o mecanismo de infecção do hospedeiro vertebrado se faça pela via aérea superior, por meio da inalação de propágulos fúngicos infectantes conhecidos como conídios, que se instalariam primeiramente nos alvéolos pulmonares, invadindo posteriormente os linfonodos hilo-mediastinais e finalmente disseminando-se pela corrente sanguínea. Essa fungemia é assintomática e permite que o agente etiológico parasite todos os tecidos do sistema monocítico- histiocitário, tais como pulmões, fígado, baço, linfonodos e estruturas linfáticas do tubo digestivo. A partir daí, a resposta tissular do hospedeiro contra o processo infeccioso vai determinar a extensão da doença. (Silva et al., 1999 ; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Marques et al., 2000; Lacaz et al., 2002). A HP clássica, ou seja, a causada pelo H. capsulatum var. capsulatum pode se manifestar como: HP infecção e HP doença (Eissenberg e Goldman, 1991; Lacaz et al., 2002). 1.4.1. Histoplasmose Infecção A gravidade da doença em indivíduos imunocompetentes parece estar relacionada ao número de microaleuroconídios inalados. Nestes indivíduos, o processo infeccioso se estabelece após o microrganismo conseguir escapar do sistema de defesa inato imposto pelo tecido hospedeiro. Estima-se que cerca de 90 a 95% dos indivíduos que inalaram microaleuroconídios desta espécie fúngica não desenvolvem a doença (Wu- Hsieh e Howard, 1989; Eissenberg e Goldman, 1991; Lacaz et al., 2002). 41 Pode ser dividida em: primo infecção assintomática e infecção pulmonar aguda. A primo infecção assintomática, representa a maior parte das infecções primárias. Neste caso, o contato do indivíduo com o agente etiológico é evidenciado apenas com a realização de inquéritos epidemiológicos havendo conversão da reatividade de negativa para positiva em teste cutâneo, frente a histoplasmima ou aparecimento de calcificações pulmonares (Eissenberg e Goldman, 1991; Lacaz et al., 2002). A infecção pulmonar aguda corresponde a primo-infecção sintomática. É caracterizada por apresentar um amplo espectro de manifestações clínicas, desde casos que simulam gripe até pneumopatias agudas graves, com insuficiência respiratória. A tosse é o sintoma freqüentemente observado na maioria dos casos. Febre com duração maior que uma semana, astenia, anorexia, dor torácica, cefaléia e mialgias fazem parte do quadro clínico. Radiologicamente observam-se infiltrados intersticiais pulmonares difusos, uni ou bi laterais, pode-se também encontrar nódulos, únicos ou múltiplos, disseminados em ambos pulmões com adenomegalia hilar e/ou mediastinal. Essa forma clínica é autolimitada e a involução das lesões ocorre de um até três meses, deixando como seqüelas calcificações pulmonares e extra- pulmonares (Eissenberg e Goldman, 1991; Alves, 1996). 1.4.2. Histoplasmose Doença 1.4.2.1. Histoplasmose Disseminada A HP disseminada é uma doença rara que apresenta evolução potencialmente fatal decorrente da deficiência da imunidade celular do 42 hospedeiro, devendo ser relacionada a infecções oportunistas. São descritos três grupos de possíveis hospedeiros: as crianças com imaturidade imunológica, imunossuprimidos e um grupo sem deficiência imune mensurável pelos métodos atuais (Lacaz et al., 1999; Silva et al., 1999). A presença do fungo observado em exame de sangue periférico ou anátomo-patológico e seu desenvolvimento em cultura desempenha papel fundamental para o diagnóstico dessa forma da doença (Silva et al., 1999; Lacaz et al. 2002). 1.4.2.2. Histoplasmose Disseminada Aguda Observa-se essa forma na primeira infância, em algumas áreas de alta endemicidade e em pacientes com comprometimento da imunidade celular, especialmente naqueles indivíduos acometidos por leucose, linfomas e Aids. Clinicamente predominam as manifestações gerais de um processo infeccioso severo: febre elevada, perda ponderal, astenia, diarréia, vômitos, hepatoesplenomegalia, adenomegalias generalizadas e lesões cutâneas, com meningoencefalite em 20% dos casos. Em crianças e pacientes com Aids, pode ocorrer coagulação intravascular disseminada. A evolução para óbito ocorre na totalidade dos casos, em um período de dois a seis meses (Silva et al., 1999; Alves, 1996; Lacaz et al., 2002; Wheat et al.,2004). A HP quando está associada a Aids pode apresentar quadro clínico benigno, moderadamente grave ou grave. Alves (1996), analisou do ponto de vista clínico e laboratorial, 27 casos de HP disseminada associados a Aids. Febre, perda de peso, dispnéia, lesões cutâneas disseminadas, adenomegalia, hepato e esplenomegalia foram evidentes, bem como infiltrado intersticial difuso dos pulmões. O tratamento, nesses casos, com drogas antifúngicas podem conduzir a uma cura clínica e micológica. 43 A Aids contribuiu de maneira decisiva para o aumento da incidência da HP disseminada. Em zonas endêmicas acomete de dois a cinco porcento dos pacientes com Aids, atingindo nas cidades de grandes endemias até 25%. O Estado de São Paulo não é considerado zona endêmica de HP disseminada, entretanto em pacientes com Aids, esta forma clínica da doença, apresenta elevada letalidade, com grande incidência de lesões mucocutâneas, podendo apresentar quadro clínico semelhante à tuberculose miliar, patologia de alta freqüência no país, induzindo os médicos a pensarem nesta última infecção, não considerando a HP disseminada no diagnóstico diferencial, conseqüentemente promovendo prejuízo na instauração do tratamento antifúngico adequado (Alves, 1994; Lacaz et al., 2002). 1.4.2.3. Histoplasmose Disseminada Sub-aguda Forma clínica semelhante à aguda, diferenciando-se apenas por apresentar evolução mais prolongada e deterioração mais lenta do estado geral do paciente (Wheat et al.,2004). 1.4.2.4. Histoplasmose Disseminada Crônica É observada com maior freqüência em indivíduos do sexo masculino, com idade superior a 40 anos, apresentando relação de 12:1 de incidência/prevalência entre indivíduos do sexo masculino em relação ao feminino. Geralmente os pacientes apresentam deficiências imunes leves, produzidas por diferentes fatores, associados ou não, como idade avançada, alcoolismo crônico, diabetes, tumores sólidos, corticoterapia e linfomas. Os sinais clínicos mais importantes são astenia, perda de peso e presença de lesões cutâneas e/ou mucosas. 44 As lesões mucosas são observadas em aproximadamente 90% dos casos, sendo polimorfas, ulceradas ou úlcero-vegetantes e se situam na língua, na mucosa oral, na faringe, no septo nasal e na laringe. As lesões cutâneas são menos freqüentes que as anteriores, sendo descritas em apenas 10% dos casos. Apresentam-se como úlceras de bordas nítidas, profundas, com fundo granuloso e pápulas acneiformes, com ápice ulcerado, pustuloso ou nodoso (Silva et al., 1999; Alves, 1996; Lacaz et al., 2002; Wheat et al.,2004). 1.5. Resposta Imunológica 1.5.1. Resposta Imune Celular A resposta imune celular mediada por células T é pré-requisito indispensável para que o tecido hospedeiro resista ao processo infeccioso causado por H. capsulatum (Allendoerfer e Deepe,1998).Segundo os autores, a importância das células T para o hospedeiro humano, pode ser evidenciada pelo aumento expressivo da susceptibilidade a HP disseminada observada entre indivíduos HIV positivos ou por aqueles cuja imunidade celular foi deprimida pelo uso prolongado de agentes supressores. Willians et al. (1978) apud Allendoerfer e Deepe (1998), demonstraram que camundongos congenitamente deficientes de células T são mais susceptíveis a HP. Em adição, Allendoerfer (1998), relata que camundongos depletados de receptor ab de célula T (TCR+) sucumbiram à infecção primária e secundária causada por H. capsulatum. Sabe-se que os dois maiores fenótipos de células T, CD4+ e CD8+, desempenham funções distintas durante o processo infeccioso. Allendoerfer et al. (1998), demonstraram que a depleção de linfócitos T CD4+ em camundongos infectados experimentalmente com células de H. 45 capsulatum promoveu aumento expressivo da taxa de mortalidade destes animais. Por outro lado, o mesmo autor observou que a transferência de clones de células T CD4+ foi capaz de conferir proteção a animais naive desafiados com leveduras de H. capsulatum. Deepe (1994), relatou que camundongos knockout para b-2 microglobulina ou camundongos depletados de células T CD8+ demonstraram nítido clearance de células fúngicas. Baseado no exposto pode-se dizer que linfócitos T CD4+ são cruciais para a sobrevivência de hospedeiros infectados por H. capsulatum, enquanto células CD8+ são necessárias para o clearence dos fungos. O principal mecanismo pelo qual, células T contribuem para a resposta imune protetora se dá pela liberação de citocinas, responsáveis pela ativação dos macrófagos. Das diferentes citocinas secretadas, o IFN-g desempenha papel primordial, uma vez que atua inibindo o crescimento intracelular das células fúngicas, pela limitação do ferro existente no interior da célula, decorrente provavelmente da síntese do óxido nítrico (Allendoerfer e Deepe, 1998). Zhou et al. (1998), demonstraram que a neutralização de IFN-g resultou em aumento da taxa de mortalidade de camundongos infectados por via endovenosa com células de H. capsulatum. Allendoerfer e Deepe (1997 e 1998), observaram que camundongos naive que apresentaram falha na expressão do gene para IFN-g, não foram capazes de controlar a infecção pulmonar provocada por H. capsulatum. O papel da IL-12 no mecanismo de proteção contra o processo infeccioso causado por H. capsulatum, foi estudado por Allendoerfer et al. (1998), que demonstraram que a neutralização de IL-12 endógena esta 46 associada com o aumento de unidades formadoras de colônias e com a aceleração do tempo de mortalidade durante a infecção primária. Allendoerfer et al. (1998), descreveram que a neutralização de TNF-a, por anticorpo policlonal ou monoclonal anti- TNF-a aumenta a susceptibilidade da infecção primária e secundária causada pelo H. capsulatum, promovendo uma aceleração no tempo de mortalidade. O autor observou também, que a carga fúngica aparece aumentada em camundongos depletados de TNF-a. Em resumo, a efetividade da resposta imune celular contra o processo infeccioso causado pelo fungo H. capsulatum depende da interação de diferentes tipos de citocinas com diferentes componentes celulares em estágios distintos da infecção. 1.5.2. Resposta Imune Humoral Pouco se sabe sobre a influência das células B no mecanismo de proteção do tecido hospedeiro contra o H. capsulatum (Wu-Hsieh e Howard, 1989). Alguns estudos têm indicado que a transferência de soro hiperimune não altera o processo infeccioso, Saslow (1956) apud Allendoerfer e Deepe (1998). Em linha de pesquisa semelhante, Newman et al. (1990), demonstraram que a opsonização de leveduras com anticorpos e/ou complemento não promoveu aumento expressivo no mecanismo de fagocitose. 47 1.6. Tratamento da Histoplasmose O tratamento das primos-infecções sintomáticas é realizado empregando-se apenas medidas de suporte ventilatório em indivíduos que apresentem casos mais graves, visto que o processo infeccioso involue espontaneamente (Kauffman, 2000). Segundo Goldman (1994), o emprego de terapia antifúngica só se justifica, neste grupo, quando os sintomas não regridem após uma a três semanas de acompanhamento ou quando o paciente necessita de hospitalização. O tratamento específico só é indicado em pacientes imunodeprimidos, visando principalmente evitar a progressão da doença. Nestes casos, aplica-se uma série curta de anfotericina B, até completar dose total de 500 mg, ou cetoconazol, em dose de 400 mg/dia, por seis meses, ou itraconazol 100 mg/dia, por igual período (Kauffman, 2000). Nas formas pulmonares crônicas ou disseminadas crônicas, pode- se indicar derivados imidazólicos, com dose diária em prazos iguais aos citados anteriormente. Mediante falha terapêutica, com esses derivados, ou em casos associados à tuberculose ativa, usa-se a anfotericina B, na dose de 0,7 a 0,8 mg/kg, chegando à dose total/dia de 35 mg/Kg (Kauffman, 2000). Negroni et al. (1980), utilizaram o cetoconazol no tratamento da HP, na dosagem de 400 mg diariamente, obtendo bons resultados em 78,5% (grupo de 13 pacientes). O tratamento com cetoconazol em pacientes imunocompetentes com HP pulmonar crônica mostrou-se eficiente em 85% ou com taxa de cura de 72% (Dismukes, 1995); no entanto quando usada em paciente 48 imunodeprimido, inclusive pacientes com Aids, esta terapia apresentou taxa de falência em mais de 90% (Wheat et al., 1990). Nas formas disseminadas agudas, indica-se o itraconazol, na dose de 200 a 400 mg/dia, por 12 meses, ou anfotericina B, com dose total de 400 mg/kg (Kauffman, 2000). Negroni et al (1986), trataram com itraconazol por via oral, 18 pacientes com HP na dosagem de 100 mg/dia durante seis meses e após a cura clínica na dosagem de 50 mg/dia. Em dois casos com recidivas anteriores, a medicação foi prolongada por um ano. Ao término do tratamento, 16 pacientes encontravam-se clinicamente curados, e os dois restantes exibiam sensível melhora. Ao se referir ao uso do itraconazol, Wheat (1994), discutiu um problema de extrema importância, ou seja, a interação medicamentosa entre este antifúngico e as medicações que aceleram seu metabolismo hepático, inibindo seletivamente as enzimas P-450 do fígado, provocando falhas no tratamento, não se alcançando concentrações sanguíneas terapêuticas. Nos casos associados a Aids, é aconselhável profilaxia secundária com 100 mg/dia de itraconazol, durante um ano (Kauffman, 2000). 1.7. Diagnóstico Laboratorial da Histoplasmose 1.7.1. Exame Direto O exame direto para a observação, em microscopia óptica, de células leveduriformes de H. capsulatum é realizado em material biológico 49 (secreções do trato respiratório, aspirado de medula óssea, esfregaços sanguíneos periféricos, úlceras bucais, raspados cutâneos, líquor, linfonodo e urina) fixado em lâminas, por meio de esfregaços e imprints, empregando- se as técnicas de colorações de May-Grünwald-Giensa, Wright ou Leishman. A visualização destas formas fúngicas pode também ser observada em cortes histológicos, geralmente corada pelas técnicas de Hematoxilina- Eosina (HE), PAS (Ácido periódico de Schiff) ou Gomori-Grocott (Lacaz et al., 1984; Rincon, 1989; Lacaz et al.,1998; Sidrim e Oliveira, 1999; Kwon- Chung e Bennett, 1992; Mendes-Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Artal, 2004). Nos cortes histológicos corados pela HE, observam-se células de H. capsulatum var. capsulatum esféricas ou ovais ligeiramente basofílicas, com 2 a 4 mm de diâmetro, com halo envolvente devido à retração do citoplasma. Geralmente estas leveduras podem ser encontradas no interior das célulasdo sistema retículo endotelial ou liberadas, nesse tecido, após ruptura do citoplasma das mesmas. Raramente encontram-se brotamentos, mas quando presentes são unipolares (Kwon-Chung e Bennett, 1992; Lacaz et al.,1998; Mendes-Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Artal, 2004). Apesar de fornecer diagnóstico precoce, o exame histopatológico possui menor sensibilidade quando comparado a cultura. Soma-se a este fato a dificuldade na visualização das leveduras, freqüentemente observada nos locais onde os laboratoristas têm pouca experiência em identificar o H. capsulatum, além disto, o estudo morfológico do H. capsulatum nos tecidos não determina sua identidade, sendo considerado apenas um parâmetro sugestivo da doença (Almeida e Lacaz, 1947). Embora as leveduras de H. capsulatum var. capsulatum sejam visíveis em médio aumento quando coradas pela HE, recomenda-se a utilização de objetiva de imersão visando o diagnóstico do patógeno, 50 diferenciando-o de protozoários como Leishmania donovani e Toxoplasma gondii, que apresentam formas intracelulares semelhantes ao H. capsulatum (Mendes-Giannini e Melhem, 2001, Lacaz et al., 2002; Artal, 2004). O diagnóstico diferencial do H. capsulatum var. capsulatum é realizado pelo fato das amastigotas de L. donovani, quando coradas pelo Giemsa, apresentarem cinetoplasto em forma de bastonete, não sendo observada esta característica quando submetidas à coloração de HE (Mendes-Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Artal, 2004). Os cistos de T. gondii diferenciam-se das células fúngicas de H. capsulatum, por apresentarem células menores e sem halo claro envolvente, quando coradas pela HE (Lacaz et al., 2002). Observou-se que estes protozoários não se coram com corantes específicos (Gridley, PAS, GG) para fungos (Mendes- Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Artal, 2004). A análise microscópica das hifas revela estruturas finas e septadas, das quais se originam lateralmente conidióforos curtos, que raramente se desenvolvem e em algumas culturas estão ausentes. Os conídios são de dois tipos: microaleuroconídios e macroaleuroconídios. Os microaleuroconídios aparecem primeiro, sendo redondos a piriformes, hialinos (2 a 4 µm), apresentando parede celular lisa e finamente rugosa. Eles originam-se dos conidióforos ou diretamente da parede de hifas. Os macroaleuroconídios são redondos podendo ocasionalmente ser oblongos e ou piriformes (7 a 15 µm), com parede celular espessa, que com o amadurecimento desenvolvem espículas ou finas projeções na sua superfície, sendo conhecidos como macroaleuroconídios tuberculados. Verificou-se que nas amostras de H. capsulatum cultivadas em condições de anaerobiose, à 27ºC, os macroaleuroconídios tuberculados formam-se em abundância. (Rincon, 1989; Sidrim e Oliveira, 1999; Lacaz et al., 1998; Lacaz et al., 2002). 51 1.7.1.2. Isolamento Em alguns casos é extremamente difícil diferenciar células de H. capsulatum var. capsulatum em tecidos, de células de Candida glabrata, Penicilium marneffei, H. capsulatum var. farciminosum e formas diminutas de Blastomyces dermatitidis (Mendes-Giannini e Melhem, 2001). A cultura é o método definitivo no diagnóstico da HP (Kwon- Chung e Bennett, 1992; Yeo e Wong, 2002; Lacaz et al., 2002). O isolamento do H. capsulatum ocorre à temperatura ambiente (27º C), em ágar Sabouraud-dextrose, ágar batata ou ágar infusão cérebro coração (BHI) suplementado com cinco porcento de hemácea de carneiro, produzindo micélios aéreos brancos com aspecto algodonoso; formando colônias branco-creme a ocre-marrom, produzindo abundantes macroconídios. A esporulação geralmente está associada com esta coloração. Estes micélios desenvolvem-se lentamente, requerendo de 10 a 14 dias de incubação para iniciar crescimento, sendo que após varias semanas de incubação a superfície inteira da base estará recoberta com a colônia. Com a realização de repiques sucessivos as mesmas tornam-se brancas, de forma irreversível, não produzindo mais estas estruturas (Rincon, 1989; Sidrim e Oliveira, 1999; Lacaz et al., 1998; Lacaz et al., 2002). A reversão de micélio para levedura é observada em ágar BHI suplementado com 5 a 10% de sangue ou com soro bovino fetal ou L- cisteina. Neste caso, observa-se macroscopicamente a presença de colônias sulcadas apresentando tonalidade creme a bege, que pode tornar-se acinzentada com o tempo de cultura (Fressatti et al., 1992; Alves, 1996; Lacaz et al., 1998; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Lacaz, et al., 2002). 52 Entre as dificuldades de isolamento do H. capsulatum pode-se citar: a) o tempo prolongado (duas a seis semanas) necessário para o isolamento e identificação do agente etiológico, fato este que além de provocar atraso na liberação do resultado pode ocasionar atraso na introdução da medida terapêutica específica; b) prejuízo no isolamento e identificação do fungo, por métodos tradicionais, a partir de hemocultura, devido estes possuirem pouca sensibilidade. Para sanar este problema, diversas modificações técnicas foram introduzidas, visando melhorar a sensibilidade e/ou reduzir o tempo da cultura. Entre estes se destacam: o meio bifásico (Kiehn et al., 1981), que elevou a freqüência de isolamento de fungos a partir de sangue de pacientes infectados; lise-centrifugação (Gill et al.,1984), introduzido no mercado como DuPont Isolator® System, no qual o microrganismo é liberado a partir de leucócitos sanguíneos, inativando fatores séricos inibitórios e agentes microbianos, gerando em conseqüência maior rapidez e sensibilidade na identificação de fungemias. Além destes, existe a monitoração automatizada usando o BacT/Alert® System ou o BACTEC® System (Munoz et al, 1990). A fibrobroncoscopia é um procedimento útil no diagnóstico da HP, quando o material clínico é processado adequadamente. Unis et al. (2004), relataram a utilização da fibrobroncoscopia para a obtenção de material clínico de dez pacientes do sexo masculino, com idade entre 29 e 57 anos, procedentes do Rio Grande do Sul, com HP disseminada e Aids. A avaliação micológica foi realizada semeando-se a amostras nos meios Mycosel e ágar- Sabouraud-dextrose acrescido de 0,01% de cloranfenicol. Segundo os autores, a positividade do cultivo para material biológico cultivado em Mycosel foi 60%, enquanto no ágar-Sabouraud-dextrose-cloranfenicol foi de apenas 20%, evidenciando a importância do meio seletivo no isolamento do H. capsulatum de espécimes clínicos potencialmente contaminados, 53 salientando também, a importância das informações clínicas para o laboratório. 1.7.1.3. Técnicas Sorológicas O emprego de ensaios sorológicos é de extrema importância no diagnóstico confirmatório da HP, visto que a demonstração em exame direto bem como o isolamento e identificação do H. capsulatum muitas vezes apresenta resultados negativos, principalmente em formas autolimitadas da doença. Além disso, as provas sorológicas propiciam a obtenção de resultados em menor tempo quando comparadas as micológicas (Hopwood e Evans, 1991; Kwon-Chung e Bennett, 1992; Hamilton, 1998; Mendes- Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Wheat , 2003). Entre os diferentes ensaios sorológicos existentes, testes como imunodifusão dupla (Heiner, 1958; Kaufman, 1970; Wheat et al., 1986; Kwon-Chung e Bennett, 1992; Hamilton, 1998; Hamilton e Gómez, 1998; Lacaz et al., 2002; Yeo e Wong, 2002; Wheat, 2003) contraimunoeletroforese (Kleger e Kaufman, 1973; Wheat et al., 1986; Lacaz et al., 2002), fixação de complemento (Hopwood e Evans, 1991; Lacaz et al., 2002) são freqüentemente utilizados para a pesquisa de anticorpos circulantes anti - H. capsulatum. Em 1958, Heiner detectou seis faixas de precipitação
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