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Produção de Antígeno de Histoplasma capsulatum

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1
ROSELI SANTOS DE FREITAS
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E PADRONIZAÇÃO
DE ANTÍGENOS DE H. capsulatum VAR. capsulatum
PARA O DIAGNÓSTICO DA HISTOPLASMOSE.
Dissertação de Mestrado, apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências da Coordenadoria de
Controle de Doenças da Secretaria de Estado da
Saúde de São Paulo.
Área de Concentração: Pesquisas Laboratoriais em
Saúde Pública
Orientadora: Dra. Adriana Pardini Vicentini
São Paulo
 2005
2
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pelo Centro de Documentação – Coordenadoria de Controle de Doenças/SES
Óreprodução autorizada pelo autor
Freitas, Roseli Santos de
 Caracterização fenotípica e padronização de
antígenos de Histoplasma capsulatum var. capsulatum
para o diagnóstico da histoplasmose / Roseli Santos de
Freitas – São Paulo, 2005.
 Dissertação (mestrado)—Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Coordenadoria de Controle
de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São
Paulo.
 Área de concentração: Pesquisas Laboratoriais em
Saúde Pública
 Orientadora: Adriana Pardini Vicentini
 1. Histoplasma 2. Histoplasmose / diagnóstico 3.
Antígenos 4. Testes sorológicos 5. Imunoquímica
SES/CCD/CD-070/05
3
Este trabalho foi realizado na Seção de
Imunologia do Serviço de Microbiologia e
Imunologia da Divisão de Biologia Médica
do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo e no
Laboratório de Micologia Médica (LIM-53)
do Instituto de Medicina Tropical da
Universidade de São Paulo.
Apoio Financeiro:
Instituto Adolfo Lutz de São Paulo-
Coordenadoria de Controle de Doenças-
SES-SP.
Projeto CTC-IAL # 107/97 e 06/04.
4
MENSAGEM
5
“Uma reflexão implica sempre em uma análise crítica do trabalho
que realizamos. Se estamos fazendo uma reflexão sobre nosso
trabalho estamos questionando sua validade, o significado que ele tem
para nós e para com os sujeitos com quem trabalhamos, e para a
comunidade da qual fazemos parte e que estamos construindo. A
resposta as questões que nos propomos só pode ser encontrada em
dois espaços: no da nossa prática, na experiência cotidiana da tarefa
que procuramos desempenhar, e no da reflexão crítica sobre os
problemas que essa prática faz surgir como desafios para nós.
Questões-limites não são perguntas quaisquer. São perguntas
que nascem de situações problemáticas e que, portanto, precisam ser
respondidas. O que as caracteriza como problemáticas, aliás, é
exatamente a necessidade de superação. Nós nos deparamos com
inúmeros obstáculos em nossa vivência das situações em que nos
encontramos. Só alguns deles, entretanto, merecem a denominação de
problemas – são aqueles que têm uma significação especial em nossa
perspectiva existencial e precisam sair de nosso caminho. Esse “tirar
do caminho” um obstáculo tem sido chamado de solução do problema.
Entretanto, se analisarmos bem, verificaremos que os problemas não
sofrem uma solução, não são “solvidos”, não são solúveis. Eles são
superáveis, devem ser superados. Quando superamos um problema,
não diluímos – o que fazemos é seguir a dinâmica de um processo, no
qual há como que uma absorção, um rearranjo de elementos, e em que
se vai à frente de forma nova. Não deixamos para trás os elementos
problemáticos; levamo-los conosco de outra maneira, incorporados á
experiência, que é contínua”.
Terezinha A. Rios, “O caminho
educador”
6
DEDICATÓRIAS
7
Dedicatórias
A Deus...sem Ti...nada é possível!
Aos meus filhos Rodrigo, Rafael e André Felipe, maior conquista e
razão da minha vida, pelos momentos em que não pude estar presente.
Apesar de crianças sempre estavam prontos a me ajudar e
compreender da maneira mais carinhosa. Amo vocês!!!
A minha mãe Maria da Conceição, meu exemplo de dignidade, força e
determinação. Obrigada por confiar em mim.
A meus irmãos Rosemeire, Fernanda e Rildo, de perto ou de longe
vocês são o meu amparo, meus companheiros nas horas felizes e nos
momentos tristes.
A meu cunhado Sérgio Luis e sobrinho Luis Henrique pelo incentivo e
apoio durante toda esta trajetória.
8
AGRADECIMENTOS
9
Agradecimentos Especiais
Ao Prof. Dr. Carlos da Silva Lacaz
Que em minha carreira profissional foi o mestre que me orientou
a ter a consciência da missão com o próximo, pois segundo ele, tudo
que realizamos necessariamente tem que ser o melhor e “Tudo é para a
glória de Deus e o bem estar da humanidade”, sendo que para
conquistarmos o nosso ideal devemos nos lembrar de Camões: “As
coisas árduas e lustrosas só se alcançam com trabalho e fadiga”.
A Profa. Dra.Adriana Pardini Vicentini
Eu creio que na vida nada é por acaso e que possuímos o que
merecemos, por isso agradeço a Deus com todo meu coração e no
mais intimo de minha alma a alegria de ter me concedido o melhor, ou
seja, a orientação dedicada, profissional e amiga que me introduziu
diretrizes e conhecimentos.que serão empregados durante toda minha
vida científica.
10
Ao Prof. Dr. Cezar Mendes de Assis pela co-orientação, colaboração
amiga, com opiniões enriquecedoras e essenciais no presente trabalho.
Ao Prof. Dr. José Eduardo Costa Martins, Chefe do LIM-53 do Instituto
de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo, meu eterno
agradecimento pelo apoio, confiança e incentivo.
À pesquisadora Regina Tomie Kimura, Chefe da Seção de Imunologia
do Instituto Adolfo Lutz, por ocasião do início de minha trajetória,
minha eterna gratidão por permitir o desenvolvimento de grande parte
deste trabalho junto ao Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses.
Obridaga pela acolhida ...
As pesquisadoras Elizabeth Maria Heins e Natalina Takahashi de Melo,
pelos ensinamentos, amizade, apoio, carinho e compreensão durante
estes longos anos de convivência.
A amizade sincera e apoio de Simone Nunes de Azevedo, Otilia Batista
e Jussara Clemente de S. P. Moraes.
À Profa. Dra. Cídia Vasconcellos, pela amizade, disponibilidade e
convívio agradável.
Aos funcionários do Laboratório de Micologia do Instituto de Medicina
Tropical da Universidade de São Paulo, em especial a Sra. Antônia
Chagas dos Santos, Cláudia de Freitas Caetano e Creusa Paes Siqueira
pela amizade, auxílio e por não terem medido esforços para me ajudar
na conquista deste sonho...
Aos funcionários, estagiários e pós-graduandos dos Laboratórios de
Micologia e Sorologia do Instituto de Medicina Tropical da Universidade
de São Paulo (LIM 53), Judith Maria de Jesus, Simone Rocha, Sonia
Cristina Cavalcante, Vivian Ribeiro Kloth, Cecília Eugenia Charbel,
Cristiane Neves Pereira, Sarah Desihee Cavalcanti, Ísis Riboldi,Teixeira,
Giovana Letícia Henandez Arriagada, Mônica Martinelli Scarpelli Vidal e
Kátia Cristina Dantas, pela amizade e pelos bons momentos que
passamos juntos.
11
Aos colegas do Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses da
Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz: Lenice Elpídio de
Oliveira, Décio Fragata da Silva, Jarita de Oliveira Carvalho-Vivi e
Daniele de Lima Franco meu muito obrigada pelo apoio, amizade,
momentos de descontração e compreensão na execução deste
trabalho.
Aos funcionários da Seção de Imunologia, em especial a Sra. Irene
Mara Zamboni, Srta. Lúcia Cupertino Barreto, Sr. Vasco Gouveia, pela
amizade e valoroso auxílio. Obrigada por não ter medido esforços para
me ajudar...
Aos pesquisadores, estagiários e pós-graduandos da Seção de
Imunologia do Instituto Adolofo Lutz pelo apoio, amizade e momentos
de descontração.
Aos docentes, funcionários, estagiários e alunos, em especial do
Laboratório de Sorologia da Profa.. Dra.. Maria Aparecida Shikanai
Yasuda, Claúdia de Abreu Fonseca, Aya Sadahiro e Márcia Andréia
Ferreira.
Ao Almir Robson Ferreira e Maria Iranides Santana de Oliveira, setor de
Programação Visual, meu sincero agradecimento pela amizade e
disponibilidade.As funcionárias da Seção de Coleção de Culturas do Instituto Adolfo
Lutz: Lia Teixeira e Mônica Cândida Gear Gete Scola pelo inestimável
auxilio na liofilização dos antígenos de Histoplasma capsulatum,
obrigada pelo apoio e compreensão.
À Profa. Dra. Claudete Rodrigues de Paula do Instituto de Biociências
da Universidade de São Paulo, Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo da
Universidade Federal de São Paulo e Ricardo Bamman do Instituto de
Infectologia Emílio Ribas, pelas sugestões apresentadas no exame de
qualificação.
À Dra. Maria de Fátima Costa Pires, coordenadora do Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças da
Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, pela colaboração.
12
À Secretaria de Pós-Graduação da Área de Concentração Pesquisas
Laboratoriais em Saúde Pública do Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças em especial as
Sras. Tirces Francine e Liria Maria de Jesus Silva pelo atendimento
sempre carinhoso e colaboração.
A bibliotecária Sandra do Centro de Documentação da Coordenadoria
de Controle de Doenças-SES pelas informações e auxilio.
Ao Paulo César da Costa dos Santos, pelo inestimável auxílio na
análise estatística dos resultados.
A Beatriz Julieta Celeste, do Laboratório de Sorologia (LIM 48), pela
doação de soros de pacientes com leishmaniose.
Ao Instituto Adolfo Lutz, pelo auxílio financeiro, que viabilizou a
execução deste trabalho.
Aos pacientes que anônima e voluntariamente, entregam-se à ciência.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para o
desenvolvimento desse trabalho.
13
RESUMO
Doze amostras de H. capsulatum foram avaliadas quanto aos
aspectos fenotípicos e cinética de crescimento em ágar batata e ágar
Sabouraud-dextrose, a 27o C, durante 45 e 90 dias respectivamente.
Trinta e três porcento apresentaram textura velutínea e cotonosa,
saliência e/ou elevação central, sulcos radiais, faixas concêntricas e
pigmentos centrais e difusos. A microscopia óptica verificou-se hifas
hialinas, delgadas, septadas, micro e macroaleuroconídios
tuberculados; apresentando média de 47 dias para a fase estacionária.
67% eram cotonosas com tendência a ser plana, sendo 75% cotonosa
e branca, com hifas delgadas e septadas. Antígenos de H. capsulatum
foram obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), a partir das
amostras cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose a 27o C durante 15 e
33 dias. A extração dos determinantes antigênicos foi realizada,
cobrindo-se as culturas com solução de mertiolato-borato 1:5000 por
24 h, a temperatura ambiente. A imunoreatividade dos antígenos foi
avaliada por imunodifusão dupla (ID) e immunoblotting (IB) frente a
soros homólogos e heterólogos e anticorpos policlonais espécie-
específicos e heterólogos. Verificamos aumento na sensibilidade da
técnica de ID quando empregamos antígeno obtido das amostras 200 e
406, em ambos os tempos de cultivos e 20 vezes concentrado,
observando ainda que todos os antígenos avaliados apresentaram
100% de especificidade. Por IB, observamos intensa reatividade dos
soros de pacientes com HP doença e infecção frente às frações de 74
e 120 kDa. Concluímos que para a obtenção de antígenos com boa
especificidade e sensibilidade, a escolha da amostra fúngica bem como
o meio de cultura assume grande importância. Além disto, a
metodologia adotada para a obtenção dos mesmos mostrou-se uma
alternativa de baixo custo operacional, de fácil exeqüibilidade,
consumindo menor tempo para sua produção.
Palavras chaves: Histoplasma, histoplasmose/diagnóstico,
antígenos, testes sorológicos, imunoquímica.
14
ABSTRACT
Twelve H. capsulatum samples were cultivated at 27 ºC in potato
agar and in Sabouraud-dextrose agar during 33 and 90 days in order to
evaluate their phenotypical aspects as well as their growth curve. Thirty
three percent showed cottony texture, salience and/or semi-elevated
central surface, radial groove, concentric areas, and diffuse and central
pigments. By microscopic observation we verified septate, thin, hyaline
hyphae and microaleuroconidia and tuberculate macroaleuroconida;
showing 47 days to the stationary phase. 67% were cottony texture,
plane tendency and 75% were cottony white with septate, thin hyphae.
H. capsulatum antigens were obtained from isolates cultivated at 27º C
on Sabouraud-dextrose agar for 15 and 33 days. After incubation
mycelial cells were suspended in aqueous solution of thimerosal
(1:5,000) at room temperature for 24 h. The immunoreactivity pattern of
antigens were evaluated, using the immunodifusion (ID) and
immunoblotting (IB) assays against homologous and heterologous
serum and species-specific and heterologous polyclonal antibodies.
Through ID, it was verified that the best pattern of reactivity was
observed for antigens obtained with 33 days of culture from the isolates
200 and 406 and for the antigen 200 with 15 days of culture. By IB, it
was observed intense reactivity of the sera from patients with HP
(infection or illness) against epitopes with molecular mass from 74 to
119 kDa. It is noteworth that the antigen from sample 200, with 15 or 33
days of culture, presented the best pattern of recognition against the
homologous sera. The results suggest the employment of the soluble
antigen from sample 200 in the ID assay due to its good capacity to
discriminate both sera from patients with HP illness and HP infection,
besides its high specificity (100%) against heterologous sera.
Key words: H. capsulatum var. capsulatum, histoplasmosis,
antigens, imunodiagnosis.
15
LISTA DE ABREVIATURAS
mL Microlitro
mm Micrômetro
A. fumigatus Aspergillus fumigatus
A. nidulans Aspergillus nidulans
A. niger Aspergillus niger
Ag Antígeno
Ag Hc Antígeno de H. capsulatum
Ag Pb Antígeno de P. brasiliensis
Aids Acquired immunodeficiency syndrome
B. dermatitidis Blastomyces dermatitidis
BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyphosphate
BHI Brain heart infusion
Bp Pares de base
C. immitis Coccidioides immitis
C. neoformans Cryptococcus neoformans
CD Cluster de diferenciação
CDC Center for Diseases Control
CIE Contraimunoeletroforese
Da Daltons
cm Centímetro
ELISA Enzyme-liked immunosorbent assay
EUA Estados Unidos da América
FC Fixação de complemento
g Gramas
GG Gomori-Crocott
H Hora
H. capsulatum Histoplasma capsulatum
H. capsulatum var. duboisii Histoplasma capsulatum variedade duboisii
H. capsulatum var.
capsulatum
 Histoplasma capsulatum variedade
capsulatum
16
HE Hematoxilina-Eosina
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
HP Histoplasmose
HTT Hipersensibilidade do tipo tardio
IAL Instituto Adolfo Lutz
IB Immunoblotting
ID Imunodifusão dupla
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IL-12 Interleucina 12
INF-g Interferon gama
kDa Kilo Dalton
mA Miliamper
mg Miligramas
mL Mililitro
mM Milimolar
mm Milímetros
NBT Azul de nitrotetrazolio
NGTA Neopeptona Glicose Tiamina e Asparagina
ºC Graus Celsius
P. brasiliensis Paracoccidioides brasiliensis
P. marneffei Penicilium marneffei
p/v Peso/volume
PAS Ácido Periódico de Schiff
PBS Solução salina tamponada com fosfatos
PBS-T Solução salina tamponada com fosfato
acrescida de Tween 20
pH Concentração hidrogênio-iônica
PM
PMSF
Peso molecular
Fenil-metil-sulfonil-fluorato
RAPD Randon amplified polymorphic DNA
Rf Reference front
17
RIA Radioimmunoassay
SAB Ágar Sabouraud-dextrose
SDS Sódio Dodecil Sulfato
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com
sódio dodecil sulfato
Sida
STA
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
Sabouraud-tiamina-asparagina
TemedN,N, N,’- tetrametil-etilenodiamina
Th Linfócitos T helper
TNF-a Fator de necrose tumoral alfa
Tris Tris-(hidroxi-metil)-amino-metano
V Volts
v/v Volume/volume
Rpm Rotação por minuto
mm Milímetro
18
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Isolamento de Histoplasma capsulatum var. capsulatum de
solos brasileiros 36
Tabela 2. Microepidemias de HP no Brasil (1959-1978) 38
Tabela 3. Amostras de H. capsulatum var. capsulatum 80
Tabela 4. Aspectos morfológicos das culturas de H. capsulatum var.
capsulatum, cultivadas em ágar batata e ágar Sabouraud-dextrose, 27º
C, por 33 dias 95
Tabela 5. Aspectos micromorfológicos das culturas de H. capsulatum
var. capsulatum, cultivadas em ágar batata, segundo Ridell (1950),
27oC, por 45 dias 98
Tabela 6. Aspectos macromorfológicos das culturas de H. capsulatum
var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, por 90
dias. 106
Tabela 7. Dosagem protéica, segundo Bradford (1976), dos antígenos
de H. capsulatum var. capsulatum, 10 e 20 vezes concentrados,
cultivados em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, por 15 e 33 dias,
segundo Kaufman e Standard (1978) 107
Tabela 8. Screening dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum,
in natura, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar
Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias 112
Tabela 9. Screening dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum,
10 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978),
em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias 113
19
Tabela 10. Screening dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum,
20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978),
em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias 114
Tabela 11. Padrão de reatividade dos antígenos de H. capsulatum var.
capsulatum, 10, 20 e 30 vezes concentrados, obtidos segundo
Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C,
durante 15 dias 116
Tabela 12. Padrão de reatividade dos antígenos de H. capsulatum var.
capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e
Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias
frente a soros de pacientes com histoplasmose doença e
histoplasmose infecção, pela técnica de imunodifusão dupla 117
Tabela 13. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var.
capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e
Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar
Sabouraud-dextrose, 27o C, 15 dias frente a soros de pacientes com
histoplasmose doença e infecção 119
Tabela 14. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var.
capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e
Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar
Sabouraud-dextrose, 27o C, 33 dias frente a soros de pacientes com
histoplasmose doença e infecção 121
Tabela 15. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e
valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum,
obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200,
268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias,
20
avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose
doença 123
Tabela 15 a. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e
valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum,
obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200,
268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias,
avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose
infecção 124
Tabela 15 b. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e
valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum,
obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200,
268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 15 dias,
avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose
doença 124
Tabela 15 c. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e
valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum,
obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200,
268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 15 dias,
avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose
infecção 125
Tabela 16. Perfil eletroforético observado em SDS-PAGE a 10%, dos
antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 10 vezes concentrados,
obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-
dextrose, 27ºC, por 33 dias 126
21
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Macromorfologia das culturas 49 (A), 200 (B), 299 (C), 340
(D), 268 (E) e 406 (F) de H. capsulatum var. capsulatum cultivadas em
ágar batata, 27ºC, por 33 dias 96
Figura 2. Macromorfologia das culturas 49 (A), 212 (B), 361 (C), 406
(D), 2030 (E) e RP (F) de H. capsulatum var. capsulatum cultivadas em
ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias 96
Figura 3. Micromorfologia das culturas 49, 200, 212, 268, 299, 340,
361, 406, 584, 802, 2030 e RP de H. capsulatum var. capsulatum,
cultivadas em ágar batata, 27ºC, por 45 dias 97
Figura 4. Curva de crescimento das amostras 49 (A) e 200 (B) de H.
capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose,
27oC, durante 90 dias 99
Figura 5. Curva de crescimento das amostras 212 (A) e 268 (B) de H.
capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose,
27oC, durante 90 dias 100
Figura 6. Curva de crescimento das amostras 299 (A) e 340 (B) de H.
capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose,
27oC, durante 90 dias 101
Figura 7. Curva de crescimento das amostras 361 (A) e 406 (B) de H.
capsulatum var. capsultum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose,
27oC, durante 90 dias. 102
Figura 8. Curva de crescimento das amostras 584 (A) e 802 (B) de H.
capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose,
27oC, durante 90 dias 103
22
Figura 9. Curva de crescimento das amostras 2030 (A) e RP (B) de H.
capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose,
27oC, durante 90 dias 104
Figura 10. Anverso e verso das colôniasgigantes das amostras de H.
capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose,
27º C, durante 90 dias 105
Figura 11. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var.
capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e
Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 33 dias,
frente a anticorpo policlonal anti-antígeno de H. capsulatum. 115
Figura 12. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var.
capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e
Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 15 dias,
frente a soros de pacientes com histoplasmose doença 120
Figura 13. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var.
capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e
Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, 33 dias, frente a
soros de pacientes com histoplasmose doença 122
Figura 13 a. Reatividade dos exoantígenos de H. capsulatum var.
capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e
Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, 33 dias, frente a
soros de pacientes com histoplasmose infecção 122
Figura 14. Perfil eletroforético dos antígenos de H. capsulatum var.
capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar
Sabouraud-dextrose, 27oC, 33 dias. Linha 1: Padrão de Peso
Molecular; linha 2: Exoantígeno de Referência (Filtrado de Cultura de
H. capsulatum var. capsulatum- Faculdade de Farmácia da
23
Universidade Estadual Paulista de Araraquara); linha 3: Ag Hc 49, linha
4: Ag Hc 200; linha 5: Ag Hc 212, linha 6: Ag Hc 268; linha 7: Ag Hc
299; linha 8: Ag Hc 340; linha 9: Ag Hc 361; linha 10: Ag Hc 406; linha
11: Ag Hc 584; linha 12: Ag Hc 802; linha 13: Ag Hc 2030 e linha 14: Ag
Hc RP. Concentração dos Ag Hc aplicados nos slots 3 a 14: 10 vezes
concentrados. 127
Figura 15. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG
anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP
infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a
antígeno da amostra 49, 10 vezes concentrado,obtido segundo
Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose,
27ºC, por 33 dias 130
Figura 16. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG
anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP
infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a
antígeno da amostra 200, 10 vezes concentrado,obtido segundo
Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose,
27ºC, por 33 dias 130
Figura 17. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG
anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP
infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a
antígeno da amostra 268, 10 vezes concentrado,obtido segundo
Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose,
27ºC, por 33 dias 131
Figura 18. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG
anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP
infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a
antígeno da amostra 406, 10 vezes concentrado,obtido segundo
24
Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose,
27ºC, por 33 dias 131
Figura 19. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG
anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP
infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a
antígeno da amostra 200, 10 vezes concentrado,obtido segundo
Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose,
27ºC, por 15 dias 132
Figura 20. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG
anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP
infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a
antígeno da amostra 268, 10 vezes concentrado,obtido segundo
Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose,
27ºC, por 15 dias 132
Figura 21. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG
anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP
infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a
antígeno da amostra 406, 10 vezes concentrado,obtido segundo
Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose,
27º C, por 15 dias 133
Figura 22. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG
anti-H. capsulatum de soros de indivíduos pertencentes a um grupo de
espeleólogos (1 a 17), grupo de indivíduos que trabalham com fungos
(18 a 21), anticorpo policlonal anti-exoantígeno de H. capsulatum (22),
pool de soros de indivíduos com leishmaniose (23), pool de soro de
indivíduos saudáveis (24), frente a antígeno da amostra 200,10 vezes
concentrado, cultivada em ágar Sabouraud-dextrose a 27ºC, por 33
dias 135
25
Figura 23. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG
anti-P. brasiliensis frente a soros de indivíduos pertencentes a um
grupo de espeleólogos (1 a 17), grupo de indivíduos que trabalham
com fungos (18 a 21) e pool de soro de indivíduos saudáveis (22),
frente a exoantígeno da amostra 113 de P. brasiliensis cultivada em
caldo NGTA a 36ºC, por 20 dias 135
Figura 24. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG
anti-A. fumigatus frente a soros de indivíduos pertencentes a um grupo
de espeleólogos (1 a 17), grupo de indivíduos que trabalham com
fungos (18 a 21) e pool de soro de indivíduos saudáveis (22), frente a
exoantígeno de A. fumigatus (pool das amostras 354, 356 e 727), 10
vezes concentrado, cultivadas em caldo Sabouraud-dextrose, a 27º C,
por 30 dias 136
Figura 25. Estabilidade dos antígenos das amostras de H. capsulatum,
12 meses após obtenção, frente a anticorpo policlonal anti-exoantígeno
de H. capsulatum. Lâmina A: Antígenos das amostras 49, 200, 268 e
406, 20 vezes concentrado. Lâmina B: Antígenos das amostras 49,
200, 268 e 406, 10 vezes concentrado 137
26
INDICE
1.0. Introdução 30
1.1. Histórico da Histoplasmose 30
1.2. Etiologia do H. capsulatum 32
1.3. Distribuição Geográfica e Ecoepidemiologia 32
1.4. Aspectos Clínicos da Histoplasmose 39
1.4.1. Histoplasmose Infecção 40
1.4..2. Histoplasmose Doença 41
1.4.2.1. Histoplasmose Disseminada41
1.4.2.2. Histoplasmose Disseminada Aguda 42
1.4.2.3. Histoplasmose Disseminada Sub-aguda 43
1.4.2.4. Histoplasmose Disseminada Crônica 43
1.5. Resposta Imunológica 44
1.5.1. Resposta Imune Celular 44
1.5.2. Resposta Imune Humoral 46
1.6. Tratamento da Histoplasmose 47
1.7. Diagnóstico Laboratorial da Histoplasmose 48
1.7.1. Exame Direto 48
1.7.1.2. Isolamento 51
1.7.1.3. Técnicas Sorológicas 53
1.7.1.4. Técnicas Moleculares 57
1.8. Antígenos de Histoplasma capsulatum var. capsulatum 60
2.0. Relevância 68
27
3.0. Objetivos 71
4.0. Considerações Éticas 72
5.0. Delineamento Experimental 73
6.0 Materiais e Métodos 74
6.1. Amostras Fúngicas 74
6.1.1. Amostras de H. capsulatum var. capsulatum 74
6.1.2. Amostras de Paracoccidioides brasiliensis 74
6.1.3. Amostras de Aspergillus fumigatus 74
6.2. Animais 75
6.3. Soros 75
6.3.1. Soro Controle Positivo de Referência 77
6.3.2. Soros Hiperimunes Obtidos em Coelhos 77
6.4. Aspectos Morfológicos das Amostras de H. capsulatum var.
capsulatum 78
6.4.1. Cultivo das Células Fúngicas em Tubos 78
6.4.2. Cultivo das Células Fúngicas em Placas e Curva de Crescimento
 78
6.4.3. Cultivo em Lâminas 78
6.5. Meios de Cultura 82
6.6. Antígenos Fúngicos 82
6.6.1. Antígeno de H. capsulatum var. capsulatum 82
6.6.2. Exoantígeno de P. brasiliensis 83
6.6.3. Exoantígeno de A. fumigatus 83
6.6.4. Antígenos de Referência de H. capsulatum 84
28
6.7. Determinação da Viabilidade Fúngica dos Antígenos 84
6.8. Determinação da Esterilidade dos Antígenos 85
6.9. Determinação de Proteínas 85
6.10. Imunodifusão Dupla em Gel de Agarose 85
6.11. Análise do Perfil Eletroforético dos Anttígenos de H. capsulatum
var. capsulatum 87
6.11.1. SDS-PAGE 87
6.11.2.Immunoblotting 88
6.11.3. Detecção do Peso Molecular 90
6.12. Antissoros 90
6.12.1. Soro de Coelhos Anti- Antígeno de H. capsulatum var.
capsulatum 90
 6.12.2. Soro de Coelho Anti- Exoantígeno de P. brasiliensis e Anti-
Exoantígeno de A. fumigatus 91
6.13. Purificação de Imunoglobulinas 91
6.14. Titulação dos Antissoros 92
6.15. Análise Estatística 92
7.0. Resultados 94
7.1. Aspectos Morfológicos das Amostras de H. capsulatum 94
7.2. Curva de Crescimento das Células Micelianas de H. capsulatum
var. capsulatum e Aspectos Fenotípicos das Colônias Fúngicas 94
7.3. Dosagem Protéica dos Antígenos de H. capsulatum var.
capsulatum 107
7.4. Screening dos Antígenos de H. capsulatum 108
29
7.5. Análise do Padrão de Reatividade dos Antígenos de H. capsulatum
var. capsulatum 118
7.6. Perfil Eletroforético dos Antígenos de H. capsulatum var.
capsulatum 125
7.7. Immunoblotting para Detecção da Reatividade de Anticorpos anti-
H. capsulatum em Soros de Pacientes com HP doença e infecção 128
7.8. Estudo da Estabilidade dos Antígenos de H. capsulatum 137
8.0. Discussão 138
9.0. Conclusões 152
10.0. Referências Bibliográficas 154
Anexos 174
30
1.0. INTRODUÇÃO
1.1. Histórico da Histoplasmose
O primeiro caso de histoplasmose (HP) foi estudado no Panamá,
por Samuel Darling (1905), ao necropsiar um negro no Ancon Hospital,
encontrando numerosos parasitos, redondos ou ovais, sendo na sua maioria
fagocitados, observado em microscopia óptica de tecido dos pulmões, baço
e fígado. Em 1906, em nova necropsia realizada na Martinica encontrou
outro caso apresentando os mesmos caracteres anátomo-patológicos, ainda
no mesmo ano, observou um terceiro caso, em nativo do Cantão que residia
há alguns meses, no Panamá. A partir dos achados destas três necropsias,
Darling individualizou esta nova doença que se caracterizava
particularmente por febre irregular, com hepato-esplenomegalia acentuada e
leucopenia. Do ponto de vista anatomo-patológico, a doença manifestava-se
com aumento de elementos retículo-histiocitários e presença de numerosos
parasitos, redondos ou ovais, muito semelhantes a leishmanias, no interior
dos histiócitos, que foram considerados por Darling como protozoários. Ele
procurava, nas autopsias que realizava, casos suspeitos de calazar ou
leishmaniose visceral e por isso selecionava os doentes falecidos que
apresentassem quadro clínico com manifestações de leucopenia, febre
irregular e hepato-esplenomegalia.Ao encontrar nos tecidos lesados o
microrganismo pensou, inicialmente, que se tratasse de um novo
protozoário, denominando-o primeiramente de Histoplasma capsulata, a
seguir corrigindo para Histoplasma capsulatum (Alves, 1996; Lacaz et al.,
2002).
Após os relatos de Darling, numerosos casos de HP foram
registrados, contribuindo de forma expressiva para compreensão desta
patologia.
Comparando o material estudado por Darling (1906), com casos
de linfangite epizoótica causada por H. farciminosum e esfregaços de
31
sangue de casos de leihsmaniose, Rocha Lima (1912), verificou que o H.
capsulatum apresentava, morfologicamente, maior semelhança com
leveduras do que com protozoários. Neste estudo, o autor enfatizou as
propriedades de impregnação de corantes, a presença de formas em
brotamento e a ausência de formas flageladas descrita anteriormente por
Darling.
Dodd e Tompkins (1932), diagnosticaram o primeiro caso de HP
em esfregaços de sangue periférico de uma criança portadora de anemia
incomum, residente no Estado de Tennesse (EUA). Este material foi enviado
para De Monbreum (1934), que realizou com sucesso o primeiro isolamento
de H. capsulatum. O autor demonstrou também o dimorfismo desta espécie
fúngica, por meio da inoculação em animais de experimentação, concluindo
que formas saprofíticas do fungo provavelmente existiam livres na natureza,
causando doença, em humanos, com quadro não fatal mais freqüentemente
do que se supunha.
O primeiro caso de HP no Brasil foi diagnosticado através do
exame de fragmentos de fígado de uma criança, sendo encontrado células
retículo-endoteliais parasitadas pelo H. capsulatum (Villela e Madureira Pará,
1941).
Com o advento da Aids, em 1981, observou-se aumento do
número de casos de HP disseminada associada àquela patologia em zonas
endêmicas, sendo que esta associação pode ser desencadeada pelo
despertar de processos pulmonares quiescentes (Wheat et al., 1986) e
apresentando-se como a primeira infecção oportunística associada a outras
infecções e ou neoplasias em pacientes residentes ou procedentes de zonas
endêmicas, fato que levou o CDC-USA, em 1985, quando não havia provas
sorológicas e moleculares para a identificação do HIV, a incluir a HP
disseminada como infecção “marcadora” de Aids.
32
1.2. Etiologia do H. capsulatum
Anamorfo:Histoplasma capsulatum var. capsulatum. Darling (1906).
Histoplasma capsulatum var. duboisii. Ciferri (1960).
Teleomorfo: Emonsiella capsulata. Kwon-Chung (1972).
Ajellomyces capsulatus. McGinnis et Katz (1979).
A HP é infecção causada por três variedades de fungos
pertencentes ao gênero Histoplasma: H. capsulatum var. capsulatum; H.
capsulatum var. duboisii e H. capsulatum var. farciminosum. As duas
primeiras variedades causam infecção em humanos e animais e a var.
farcimonosum é o agente da linfangite epizoótica (Alves, 1996; Lacaz et al.,
1998, Lacaz et al., 2002).
O agente etiológico da HP clássica ou Doença de Darling é o H.
capsulatum var. capsulatum, sendo que o seu teleomorfo é o A. capsulatus.
Este microrganismo no estado anamorfo pertence ao reino Fungi, subdivisão
Deuteromycotina, classe Hyphomycetes, ordem Moniliales, família
Moniliaceae e gênero Histoplasma; enquanto o seu teleomorfo pertence à
subdivisão Ascomycotina, classe Ascomycetes, ordem Onygenales e gênero
Ajellomyces. A forma sexuada ou teleomorfa das duas primeiras variedades
de Histoplasma receberam, inicialmente, a denominação de Emonsiella
capsulata e posteriormente de Ajellomyces capsulatus (McGinnis e
Katz,1979; Kwon-Chung e Bennett, 1992; Lacaz et al., 1998; Lacaz et al.,
2002).
1.3. Distribuição Geográfica e Ecoepidemiologia
A HP é micose sistêmica que apresenta ampla distribuição
geográfica, sendo possível detectar casos autóctones em mais de 60 países
distribuídos nos diversos continentes, principalmente na área compreendida
33
entre 45° latitude ao norte e 30° latitude ao sul do Equador. No entanto,
apresenta nítida prevalência nos continentes Americano e Africano. Nas
Américas estende-se desde o sul do Canadá até as regiões centrais da
Argentina, sendo que as zonas endêmicas de maior importância se situam
em Ohio, Bacia do Rio Prata, Serra do Mar, Vales do Rio Mississipi e
Missouri (Zancopé-Oliveira e Wanke, 1987; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Silva
et al., 1999; Negroni, 2001; Panackal et al., 2002; Lacaz et al., 2002).
Casos da doença têm sido descritos nas regiões oeste e sudeste
da Europa, no oeste da Ásia e Austrália, contudo, estes se encontram
comumente limitados a um único ou a um número muito pequeno, não se
sabendo ao certo a fonte de infecção. Soma-se a isto, o fato de nenhum
surto epidêmico ter sido descrito até o momento fora do continente
americano (Panackal et al., 2002).
No Brasil, a ocorrência da HP tem sido descrita pela observação
de casos clínicos autóctones, seja sob a forma de casos isolados ou sob a
forma de microepidemias, bem como pela realização de inquéritos
epidemiológicos empregando o teste cutâneo da histoplasmina (Zancopé-
Oliveira e Wanke, 1987; Silva-Vergara e Martinez, 1998; Severo et al., 2001;
Cury et al., 2001).
H. capsulatum é habitualmente encontrado em regiões de clima
tropical ou temperado, com temperatura média anual entre 15 a 22o C,
índice pluviométrico anual de 1000 mm e umidade relativa do ar de 67 a 87
% (Negroni, 2001; Lacaz et al., 2002).
Acredita-se que alguns ou o conjunto de fatores descritos
anteriormente determinam a distribuição do H. capsulatum no meio
ambiente, geralmente havendo associação de seu isolamento com
microambientes fechados, como cavernas ou grutas, construções
abandonadas, galinheiros, celeiros, florestas ou qualquer local onde o solo
encontra-se enriquecido com excretas de aves e/ou morcegos (Zancopé-
34
Oliveira e Wanke, 1987; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Silva et al., 1999;
Negroni, 2001).
Determinadas características físico-químicas do solo como textura
e acidez, associadas ao enriquecimento do mesmo por dejetos de aves e
quirópteros, que atuariam como importante fonte de nitrogênio, têm sido
consideradas por diversos autores como meio de cultura adequado para o
crescimento, desenvolvimento e disseminação deste patógeno (Zancopé-
Oliveira, 1987; Silva et al., 1999; Negroni, 2001).
Segundo Kwon-Chung e Bennett (1992), locais onde existem
elevadas concentrações de aves ou morcegos podem dar origem a surtos
epidêmicos ou microepidêmicos que diferem em sua magnitude quando da
exposição simultânea de pessoas ao agente infectante.
Em publicação recente Panackal et al. (2002), relatam que na
América do Norte a HP tem sido considerada por diversos pesquisadores
como doença recreacional entre espeleólogos. Segundo os autores 60 a
64% dos indivíduos que possuem o hábito de freqüentar cavernas e ou
grutas apresentam teste cutâneo positivo à histoplasmina.
Recentemente, maio de 2001, um grupo de 15 estudantes do
Estado da Geórgia-EUA viajou para Nicarágua onde visitaram uma mina de
prata. Três dias após o retorno do grupo para os EUA, 12 (80%) indivíduos
apresentaram sinais clínicos compatíveis com HP aguda, confirmada
posteriormente por meio de provas sorológicas (Panackal et al., 2002).
Erkens et al. (2002), descrevem a presença de anticorpos
circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum, empregando a técnica de
immunoblotting, em cinco integrantes de um grupo de oito pesquisadores
alemães, que haviam passado dez dias em Cuba, estudando os hábitos de
morcegos. Registrou-se também, que duas pessoas do grupo que relataram
a utilização de máscaras faciais, não apresentaram nenhuma sintomatologia,
35
enfatizando assim, a necessidade e importância do uso de equipamentos de
proteção individual para pessoasque visitam cavernas.
H. capsulatum tem sido isolado de diferentes fontes ambientais
como ar, solo de cavernas e grutas, bem como de vísceras e fezes de
morcegos, ratos, cães e outros animais silvestres (Emmons, 1949; Silva e
Paula, 1956; Silva, 1961 apud Silva-Vergara et al., 2001; Araújo, 1970; Arias
et al., 1982; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Lacaz et al., 1998; Cury et al., 2001;
Lacaz et al., 2002).
Zancopé-Oliveira e Wanke (1986), realizaram a captura de 103
animais silvestres nativos no Município do Rio de Janeiro, isolando H.
capsulatum de vísceras de três animais (2,9%), aparentemente sadios;
sendo dois marsupiais (Metachirus opossum) e um rato (Rattus rattus).
Taylor et al. (1999), descreveram o isolamento de H. capsulatum
das vísceras (intestino, pulmão, fígado e baço) em 17, de um total de 208,
morcegos capturados nos Estados de Guerrero e Morelos, no México.
Silva-Vergara et al. (2001), demonstraram o isolamento de H.
capsulatum no Estado de Minas Gerais, a partir de cultura de vísceras de
Didelphis albiventris, uma espécie de marsupial encontrado no Brasil. Os
autores chamam a atenção para a ampla distribuição geográfica deste
mamífero pelo continente, a qual coincide com a distribuição da HP.
A Tabela 1 resume os isolamentos do H. capsulatum a partir de
amostras de solo de diferentes regiões do Brasil, a grande maioria obtida de
locais com elevada quantidade de excretas de galinhas e morcegos.
36
Tabela 1. Isolamento de H. capsulatum var. capsulatum de solos brasileiros.
Localidade Associação com
aves ou morcegos
Amostras
examinadas
Amostras
positivas
Referência
Jacobina (BA) Galinheiros 50 01 Silva,1956
Ubatuba/Caraguatatuba
(SP)
Fezes de Morcegos 01 01 Fava Netto,
1967
Lagoa Santa (MG) Galinheiro 02 01 Araújo,1970
Brasília (DF) Fezes de morcego 15 02 Schmidt ,1973
Humboldt (MT) Galinheiro 06 01 Moraes e
Almeida,1976
Angra dos Reis (RJ) Galinheiro 02 02 Wanke,1985
Angra dos Reis (RJ) Fezes de Morcego 04 02 Wanke,1985
São Gonçalo (RJ) Fezes de morcego 07 05 Wanke,1985
Petrópolis/Itaipava (RJ) Fezes de morcego 18 13 Wanke,1985
Niterói/Rio do Ouro (RJ) Fezes de morcego 05 03 Wanke,1985
General Câmara (RS) Galinheiro -------- -------- Severo, 1986
 Fonte: Zancopé-Oliveira, 1987.
O último relato de isolamento de H. capsulatum a partir de
amostras de solo realizado no Brasil foi o conduzido por Zancopé-Oliveira e
Wanke (1987). Neste estudo, os autores avaliaram o índice de contaminação
do solo pelo H. capsulatum na localidade de Rio da Prata (RJ), área
periurbana com características rurais. A análise de 111 amostras de solo
coletadas em diferentes locais revelou positividade em oito (7,2%). Todas as
amostras para análise foram colhidas de galinheiros, sendo que em um
destes foi observado a existência de guano de morcegos. Segundo os
pesquisadores, o elevado nível de contaminação do solo nesta região pode
ser comparado aos níveis observados em áreas endêmicas para esta
micose nos EUA.
37
Testes intradérmicos empregando a histoplasmina têm sido
realizados em cães, no rebanho bovino e eqüino, a fim de verificar a
incidência da HP infecção. Estes inquéritos epidemiológicos revelam que
50% dos cães e gatos abrigam esta espécie fúngica, sendo considerados,
portanto, como disseminadores desta enfermidade, sugerindo desta forma,
que a infecção primária possa acontecer primeiramente em hospedeiros
animais. Acredita-se que a transmissão ao homem possa estar associada à
presença de determinados vetores invertebrados, como os carrapatos;
estando assim relacionada tanto a ocupações rurais como urbanas (Alves,
1996; Lacaz et al., 2002).
Em 1945, importante estudo epidemiológico contribuiu para a
demonstração da reatividade cutânea à histoplasmina, correlacionando-a a
presença de calcificações pulmonares em indivíduos tuberculina negativos
(Christie e Peterson, 1945).
Palmer (1946), em estudo multicêntrico realizado nos EUA, onde
avaliou 10.580 enfermeiras, demonstrou a incidência de reagentes à
histoplasmina. O autor verificou que o Estado de Kansas apresentava o
maior índice de positividade (7,1%), encontrou, contudo, 58,1% de provas
duvidosas. A média dos casos positivos foi de 3,2% e casos duvidosos de
20,1%.
No Brasil, pelo fato da HP não ser doença de notificação
compulsória, fica extremamente difícil o mapeamento da real distribuição
deste processo infeccioso. A Tabela 2 resume as microepidemias ocorridas
em território nacional no período compreendido entre 1959 e 1987.
Tabela 2. Microepidemias de HP no Brasil (1959-1987).
38
Fontes de infecção Nº de casos Autor (es) e ano de
 publicação
1. Gruta com morcegos/Paraíba do Sul/RJ 13 Paula (1959)
2. Caixa d’agua/ Santa Teresa/RJ 07 Tufic Simão (1959)
3. Forro de casa/ Ubatuba/SP 08 Fava Netto et al. (1967)
4. Gruta com morcegos/ Vassouras/RJ 05 Paula & Pomp (1972)
5. Gruta com morcegos/ Brasília/DF 14 Schmidt et al. (1973)
6. Gruta com morcegos/ Rio de Janeiro/RJ 05 Rego et al. (1976)
7. Gruta com morcegos/ Ubatuba/SP 10 Fava Netto et al. (1976)
8. Gruta/ Angra dos Reis/RJ 08 Mello et al. (1976)
9. Gruta/ Rio do Ouro – Niterói /RJ 08 Peçanha et al. (1981)
10. Mina abandonada/ São Gonçalo/RJ 10 Wanke (1981)
11. Mina abandonada/ São Gonçalo/RJ 04 Wanke (1981)
12. Minas abandonadas/ Itaipava /RJ 10 Wanke (1981)
13. Minas abandonadas/ Itaipava /RJ 05 Wanke (1981
14. Minas abandonadas/ Niterói /RJ 05 Wanke (1982)
15. Gualinheiro/ Tinguá/RJ 10 Bethlem et al (1984)
16. Galeria de águas/ Pendotiba/RJ 10 Paula e Aidê (1979)
17. Bueiro/ Borborema/PB 06 Fernandes & Costa (1967)
Fonte: Aloysio de Paula (1988) apud Lacaz et al., 2002.
Wanke (1985), estudou a epidemiologia da HP, empregando
como antígeno a histoplasmina, avaliando população de 453 indivíduos, na
região hiper-endêmica de Praia Vermelha (Ilha Grande, Angra dos Reis, RJ),
encontrando 94,6% de positividade ao ensaio de HTT. O autor demonstrou
também, que minas abandonadas de caulim eram a fonte de infecção desta
microepidemia de HP aguda. Neste estudo o agente etiológico desta micose
foi isolado em rato-paca (Proechimys dimidiatus); roedor silvestre comum
naquela área.
39
Zancopé-Oliveira e Wanke (1986), realizaram em área periurbana
do Município do Rio de Janeiro (localidade de Rio da Prata) inquérito
epidemiológico com histoplasmina em 470 escolares, com faixa etária entre
5 a 14 anos, encontrando 19,6% de positividade. Neste mesmo trabalho, a
autora, realizou inquérito epidemiológico empregando paracoccidioidina em
455 crianças da mesma região. A leitura foi realizada em 433 crianças,
apresentando 9,2% de positividade (40 reações).
Severo et al. (2001), relataram a endemicidade da HP no Estado
do Rio Grande do Sul, particularmente na região do Vale do Rio Jacuí.
Segundo o autor, H. capsulatum tem sido isolado do solo e 89% da
população masculina jovem desta região apresenta positividade ao teste
cutâneo com histoplasmina.
Cury et al. (2002), descreveram casos de HP pulmonar aguda
desenvolvida por quatro indivíduos que freqüentavam cavernas habitadas
por morcegos, na cidade de Pedro Leopoldo, Estado de Minas Gerais.
1.4. Aspectos Clínicos da Histoplasmose
H. capsulatum não é regularmente um microrganismo oportunista,
contudo, nas últimas décadas o aumento de sua incidência tem sido
observado em pacientes imunocomprometidos,entre os quais podem-se
citar aqueles portadores de doenças hematológicas malignas, acometidos
pelo vírus da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (HIV/Aids), pacientes
transplantados ou indivíduos que receberam terapias citotóxicas ou
imunossupressoras (Wu-Hsieh e Howard, 1989; Alves, 1996; Lacaz et al.,
1998; Marques et al., 2000; Cury et al., 2001; Negroni, 2001; Lacaz et al.,
2002).
A HP é uma infecção fúngica caracterizada por determinar
variadas manifestações clínicas no hospedeiro, desde infecção
40
assintomática até doença disseminada (Silva et al., 1999; Marques et al.,
2000; Lacaz et al., 2002).
Acredita-se que o mecanismo de infecção do hospedeiro
vertebrado se faça pela via aérea superior, por meio da inalação de
propágulos fúngicos infectantes conhecidos como conídios, que se
instalariam primeiramente nos alvéolos pulmonares, invadindo
posteriormente os linfonodos hilo-mediastinais e finalmente disseminando-se
pela corrente sanguínea. Essa fungemia é assintomática e permite que o
agente etiológico parasite todos os tecidos do sistema monocítico-
histiocitário, tais como pulmões, fígado, baço, linfonodos e estruturas
linfáticas do tubo digestivo. A partir daí, a resposta tissular do hospedeiro
contra o processo infeccioso vai determinar a extensão da doença. (Silva et
al., 1999 ; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Marques et al., 2000; Lacaz et al.,
2002).
A HP clássica, ou seja, a causada pelo H. capsulatum var.
capsulatum pode se manifestar como: HP infecção e HP doença (Eissenberg
e Goldman, 1991; Lacaz et al., 2002).
1.4.1. Histoplasmose Infecção
A gravidade da doença em indivíduos imunocompetentes parece
estar relacionada ao número de microaleuroconídios inalados. Nestes
indivíduos, o processo infeccioso se estabelece após o microrganismo
conseguir escapar do sistema de defesa inato imposto pelo tecido
hospedeiro. Estima-se que cerca de 90 a 95% dos indivíduos que inalaram
microaleuroconídios desta espécie fúngica não desenvolvem a doença (Wu-
Hsieh e Howard, 1989; Eissenberg e Goldman, 1991; Lacaz et al., 2002).
41
Pode ser dividida em: primo infecção assintomática e infecção
pulmonar aguda.
A primo infecção assintomática, representa a maior parte das
infecções primárias. Neste caso, o contato do indivíduo com o agente
etiológico é evidenciado apenas com a realização de inquéritos
epidemiológicos havendo conversão da reatividade de negativa para positiva
em teste cutâneo, frente a histoplasmima ou aparecimento de calcificações
pulmonares (Eissenberg e Goldman, 1991; Lacaz et al., 2002).
A infecção pulmonar aguda corresponde a primo-infecção
sintomática. É caracterizada por apresentar um amplo espectro de
manifestações clínicas, desde casos que simulam gripe até pneumopatias
agudas graves, com insuficiência respiratória. A tosse é o sintoma
freqüentemente observado na maioria dos casos. Febre com duração maior
que uma semana, astenia, anorexia, dor torácica, cefaléia e mialgias fazem
parte do quadro clínico. Radiologicamente observam-se infiltrados
intersticiais pulmonares difusos, uni ou bi laterais, pode-se também
encontrar nódulos, únicos ou múltiplos, disseminados em ambos pulmões
com adenomegalia hilar e/ou mediastinal. Essa forma clínica é autolimitada e
a involução das lesões ocorre de um até três meses, deixando como
seqüelas calcificações pulmonares e extra- pulmonares (Eissenberg e
Goldman, 1991; Alves, 1996).
1.4.2. Histoplasmose Doença
1.4.2.1. Histoplasmose Disseminada
A HP disseminada é uma doença rara que apresenta evolução
potencialmente fatal decorrente da deficiência da imunidade celular do
42
hospedeiro, devendo ser relacionada a infecções oportunistas. São descritos
três grupos de possíveis hospedeiros: as crianças com imaturidade
imunológica, imunossuprimidos e um grupo sem deficiência imune
mensurável pelos métodos atuais (Lacaz et al., 1999; Silva et al., 1999).
A presença do fungo observado em exame de sangue periférico
ou anátomo-patológico e seu desenvolvimento em cultura desempenha
papel fundamental para o diagnóstico dessa forma da doença (Silva et al.,
1999; Lacaz et al. 2002).
1.4.2.2. Histoplasmose Disseminada Aguda
Observa-se essa forma na primeira infância, em algumas áreas
de alta endemicidade e em pacientes com comprometimento da imunidade
celular, especialmente naqueles indivíduos acometidos por leucose, linfomas
e Aids. Clinicamente predominam as manifestações gerais de um processo
infeccioso severo: febre elevada, perda ponderal, astenia, diarréia, vômitos,
hepatoesplenomegalia, adenomegalias generalizadas e lesões cutâneas,
com meningoencefalite em 20% dos casos. Em crianças e pacientes com
Aids, pode ocorrer coagulação intravascular disseminada. A evolução para
óbito ocorre na totalidade dos casos, em um período de dois a seis meses
(Silva et al., 1999; Alves, 1996; Lacaz et al., 2002; Wheat et al.,2004).
A HP quando está associada a Aids pode apresentar quadro
clínico benigno, moderadamente grave ou grave. Alves (1996), analisou do
ponto de vista clínico e laboratorial, 27 casos de HP disseminada associados
a Aids. Febre, perda de peso, dispnéia, lesões cutâneas disseminadas,
adenomegalia, hepato e esplenomegalia foram evidentes, bem como
infiltrado intersticial difuso dos pulmões. O tratamento, nesses casos, com
drogas antifúngicas podem conduzir a uma cura clínica e micológica.
43
A Aids contribuiu de maneira decisiva para o aumento da
incidência da HP disseminada. Em zonas endêmicas acomete de dois a
cinco porcento dos pacientes com Aids, atingindo nas cidades de grandes
endemias até 25%. O Estado de São Paulo não é considerado zona
endêmica de HP disseminada, entretanto em pacientes com Aids, esta forma
clínica da doença, apresenta elevada letalidade, com grande incidência de
lesões mucocutâneas, podendo apresentar quadro clínico semelhante à
tuberculose miliar, patologia de alta freqüência no país, induzindo os
médicos a pensarem nesta última infecção, não considerando a HP
disseminada no diagnóstico diferencial, conseqüentemente promovendo
prejuízo na instauração do tratamento antifúngico adequado (Alves, 1994;
Lacaz et al., 2002).
1.4.2.3. Histoplasmose Disseminada Sub-aguda
Forma clínica semelhante à aguda, diferenciando-se apenas por
apresentar evolução mais prolongada e deterioração mais lenta do estado
geral do paciente (Wheat et al.,2004).
1.4.2.4. Histoplasmose Disseminada Crônica
É observada com maior freqüência em indivíduos do sexo
masculino, com idade superior a 40 anos, apresentando relação de 12:1 de
incidência/prevalência entre indivíduos do sexo masculino em relação ao
feminino. Geralmente os pacientes apresentam deficiências imunes leves,
produzidas por diferentes fatores, associados ou não, como idade avançada,
alcoolismo crônico, diabetes, tumores sólidos, corticoterapia e linfomas. Os
sinais clínicos mais importantes são astenia, perda de peso e presença de
lesões cutâneas e/ou mucosas.
44
As lesões mucosas são observadas em aproximadamente 90%
dos casos, sendo polimorfas, ulceradas ou úlcero-vegetantes e se situam na
língua, na mucosa oral, na faringe, no septo nasal e na laringe. As lesões
cutâneas são menos freqüentes que as anteriores, sendo descritas em
apenas 10% dos casos. Apresentam-se como úlceras de bordas nítidas,
profundas, com fundo granuloso e pápulas acneiformes, com ápice ulcerado,
pustuloso ou nodoso (Silva et al., 1999; Alves, 1996; Lacaz et al., 2002;
Wheat et al.,2004).
1.5. Resposta Imunológica
1.5.1. Resposta Imune Celular
A resposta imune celular mediada por células T é pré-requisito
indispensável para que o tecido hospedeiro resista ao processo infeccioso
causado por H. capsulatum (Allendoerfer e Deepe,1998).Segundo os
autores, a importância das células T para o hospedeiro humano, pode ser
evidenciada pelo aumento expressivo da susceptibilidade a HP disseminada
observada entre indivíduos HIV positivos ou por aqueles cuja imunidade
celular foi deprimida pelo uso prolongado de agentes supressores.
Willians et al. (1978) apud Allendoerfer e Deepe (1998),
demonstraram que camundongos congenitamente deficientes de células T
são mais susceptíveis a HP. Em adição, Allendoerfer (1998), relata que
camundongos depletados de receptor ab de célula T (TCR+) sucumbiram à
infecção primária e secundária causada por H. capsulatum.
Sabe-se que os dois maiores fenótipos de células T, CD4+ e
CD8+, desempenham funções distintas durante o processo infeccioso.
Allendoerfer et al. (1998), demonstraram que a depleção de linfócitos T
CD4+ em camundongos infectados experimentalmente com células de H.
45
capsulatum promoveu aumento expressivo da taxa de mortalidade destes
animais. Por outro lado, o mesmo autor observou que a transferência de
clones de células T CD4+ foi capaz de conferir proteção a animais naive
desafiados com leveduras de H. capsulatum.
Deepe (1994), relatou que camundongos knockout para b-2
microglobulina ou camundongos depletados de células T CD8+
demonstraram nítido clearance de células fúngicas. Baseado no exposto
pode-se dizer que linfócitos T CD4+ são cruciais para a sobrevivência de
hospedeiros infectados por H. capsulatum, enquanto células CD8+ são
necessárias para o clearence dos fungos.
O principal mecanismo pelo qual, células T contribuem para a
resposta imune protetora se dá pela liberação de citocinas, responsáveis
pela ativação dos macrófagos. Das diferentes citocinas secretadas, o IFN-g
desempenha papel primordial, uma vez que atua inibindo o crescimento
intracelular das células fúngicas, pela limitação do ferro existente no interior
da célula, decorrente provavelmente da síntese do óxido nítrico (Allendoerfer
e Deepe, 1998).
Zhou et al. (1998), demonstraram que a neutralização de IFN-g
resultou em aumento da taxa de mortalidade de camundongos infectados
por via endovenosa com células de H. capsulatum.
Allendoerfer e Deepe (1997 e 1998), observaram que
camundongos naive que apresentaram falha na expressão do gene para
IFN-g, não foram capazes de controlar a infecção pulmonar provocada por H.
capsulatum.
O papel da IL-12 no mecanismo de proteção contra o processo
infeccioso causado por H. capsulatum, foi estudado por Allendoerfer et al.
(1998), que demonstraram que a neutralização de IL-12 endógena esta
46
associada com o aumento de unidades formadoras de colônias e com a
aceleração do tempo de mortalidade durante a infecção primária.
Allendoerfer et al. (1998), descreveram que a neutralização de
TNF-a, por anticorpo policlonal ou monoclonal anti- TNF-a aumenta a
susceptibilidade da infecção primária e secundária causada pelo H.
capsulatum, promovendo uma aceleração no tempo de mortalidade. O autor
observou também, que a carga fúngica aparece aumentada em
camundongos depletados de TNF-a.
Em resumo, a efetividade da resposta imune celular contra o
processo infeccioso causado pelo fungo H. capsulatum depende da
interação de diferentes tipos de citocinas com diferentes componentes
celulares em estágios distintos da infecção.
1.5.2. Resposta Imune Humoral
Pouco se sabe sobre a influência das células B no mecanismo de
proteção do tecido hospedeiro contra o H. capsulatum (Wu-Hsieh e Howard,
1989).
Alguns estudos têm indicado que a transferência de soro
hiperimune não altera o processo infeccioso, Saslow (1956) apud
Allendoerfer e Deepe (1998). Em linha de pesquisa semelhante, Newman et
al. (1990), demonstraram que a opsonização de leveduras com anticorpos
e/ou complemento não promoveu aumento expressivo no mecanismo de
fagocitose.
47
1.6. Tratamento da Histoplasmose
O tratamento das primos-infecções sintomáticas é realizado
empregando-se apenas medidas de suporte ventilatório em indivíduos que
apresentem casos mais graves, visto que o processo infeccioso involue
espontaneamente (Kauffman, 2000).
Segundo Goldman (1994), o emprego de terapia antifúngica só se
justifica, neste grupo, quando os sintomas não regridem após uma a três
semanas de acompanhamento ou quando o paciente necessita de
hospitalização.
O tratamento específico só é indicado em pacientes
imunodeprimidos, visando principalmente evitar a progressão da doença.
Nestes casos, aplica-se uma série curta de anfotericina B, até completar
dose total de 500 mg, ou cetoconazol, em dose de 400 mg/dia, por seis
meses, ou itraconazol 100 mg/dia, por igual período (Kauffman, 2000).
Nas formas pulmonares crônicas ou disseminadas crônicas, pode-
se indicar derivados imidazólicos, com dose diária em prazos iguais aos
citados anteriormente. Mediante falha terapêutica, com esses derivados, ou
em casos associados à tuberculose ativa, usa-se a anfotericina B, na dose
de 0,7 a 0,8 mg/kg, chegando à dose total/dia de 35 mg/Kg (Kauffman,
2000).
Negroni et al. (1980), utilizaram o cetoconazol no tratamento da
HP, na dosagem de 400 mg diariamente, obtendo bons resultados em 78,5%
(grupo de 13 pacientes).
O tratamento com cetoconazol em pacientes imunocompetentes
com HP pulmonar crônica mostrou-se eficiente em 85% ou com taxa de cura
de 72% (Dismukes, 1995); no entanto quando usada em paciente
48
imunodeprimido, inclusive pacientes com Aids, esta terapia apresentou taxa
de falência em mais de 90% (Wheat et al., 1990).
Nas formas disseminadas agudas, indica-se o itraconazol, na
dose de 200 a 400 mg/dia, por 12 meses, ou anfotericina B, com dose total
de 400 mg/kg (Kauffman, 2000).
Negroni et al (1986), trataram com itraconazol por via oral, 18
pacientes com HP na dosagem de 100 mg/dia durante seis meses e após a
cura clínica na dosagem de 50 mg/dia. Em dois casos com recidivas
anteriores, a medicação foi prolongada por um ano. Ao término do
tratamento, 16 pacientes encontravam-se clinicamente curados, e os dois
restantes exibiam sensível melhora.
Ao se referir ao uso do itraconazol, Wheat (1994), discutiu um
problema de extrema importância, ou seja, a interação medicamentosa entre
este antifúngico e as medicações que aceleram seu metabolismo hepático,
inibindo seletivamente as enzimas P-450 do fígado, provocando falhas no
tratamento, não se alcançando concentrações sanguíneas terapêuticas.
Nos casos associados a Aids, é aconselhável profilaxia
secundária com 100 mg/dia de itraconazol, durante um ano (Kauffman,
2000).
1.7. Diagnóstico Laboratorial da Histoplasmose
1.7.1. Exame Direto
O exame direto para a observação, em microscopia óptica, de
células leveduriformes de H. capsulatum é realizado em material biológico
49
(secreções do trato respiratório, aspirado de medula óssea, esfregaços
sanguíneos periféricos, úlceras bucais, raspados cutâneos, líquor, linfonodo
e urina) fixado em lâminas, por meio de esfregaços e imprints, empregando-
se as técnicas de colorações de May-Grünwald-Giensa, Wright ou Leishman.
A visualização destas formas fúngicas pode também ser observada em
cortes histológicos, geralmente corada pelas técnicas de Hematoxilina-
Eosina (HE), PAS (Ácido periódico de Schiff) ou Gomori-Grocott (Lacaz et
al., 1984; Rincon, 1989; Lacaz et al.,1998; Sidrim e Oliveira, 1999; Kwon-
Chung e Bennett, 1992; Mendes-Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al.,
2002; Artal, 2004).
Nos cortes histológicos corados pela HE, observam-se células de
H. capsulatum var. capsulatum esféricas ou ovais ligeiramente basofílicas,
com 2 a 4 mm de diâmetro, com halo envolvente devido à retração do
citoplasma. Geralmente estas leveduras podem ser encontradas no interior
das célulasdo sistema retículo endotelial ou liberadas, nesse tecido, após
ruptura do citoplasma das mesmas. Raramente encontram-se brotamentos,
mas quando presentes são unipolares (Kwon-Chung e Bennett, 1992; Lacaz
et al.,1998; Mendes-Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Artal,
2004).
Apesar de fornecer diagnóstico precoce, o exame histopatológico
possui menor sensibilidade quando comparado a cultura. Soma-se a este
fato a dificuldade na visualização das leveduras, freqüentemente observada
nos locais onde os laboratoristas têm pouca experiência em identificar o H.
capsulatum, além disto, o estudo morfológico do H. capsulatum nos tecidos
não determina sua identidade, sendo considerado apenas um parâmetro
sugestivo da doença (Almeida e Lacaz, 1947).
Embora as leveduras de H. capsulatum var. capsulatum sejam
visíveis em médio aumento quando coradas pela HE, recomenda-se a
utilização de objetiva de imersão visando o diagnóstico do patógeno,
50
diferenciando-o de protozoários como Leishmania donovani e Toxoplasma
gondii, que apresentam formas intracelulares semelhantes ao H. capsulatum
(Mendes-Giannini e Melhem, 2001, Lacaz et al., 2002; Artal, 2004).
O diagnóstico diferencial do H. capsulatum var. capsulatum é
realizado pelo fato das amastigotas de L. donovani, quando coradas pelo
Giemsa, apresentarem cinetoplasto em forma de bastonete, não sendo
observada esta característica quando submetidas à coloração de HE
(Mendes-Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Artal, 2004). Os cistos
de T. gondii diferenciam-se das células fúngicas de H. capsulatum, por
apresentarem células menores e sem halo claro envolvente, quando coradas
pela HE (Lacaz et al., 2002). Observou-se que estes protozoários não se
coram com corantes específicos (Gridley, PAS, GG) para fungos (Mendes-
Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Artal, 2004).
A análise microscópica das hifas revela estruturas finas e
septadas, das quais se originam lateralmente conidióforos curtos, que
raramente se desenvolvem e em algumas culturas estão ausentes. Os
conídios são de dois tipos: microaleuroconídios e macroaleuroconídios. Os
microaleuroconídios aparecem primeiro, sendo redondos a piriformes,
hialinos (2 a 4 µm), apresentando parede celular lisa e finamente rugosa.
Eles originam-se dos conidióforos ou diretamente da parede de hifas. Os
macroaleuroconídios são redondos podendo ocasionalmente ser oblongos e
ou piriformes (7 a 15 µm), com parede celular espessa, que com o
amadurecimento desenvolvem espículas ou finas projeções na sua
superfície, sendo conhecidos como macroaleuroconídios tuberculados.
Verificou-se que nas amostras de H. capsulatum cultivadas em condições de
anaerobiose, à 27ºC, os macroaleuroconídios tuberculados formam-se em
abundância. (Rincon, 1989; Sidrim e Oliveira, 1999; Lacaz et al., 1998;
Lacaz et al., 2002).
51
1.7.1.2. Isolamento
Em alguns casos é extremamente difícil diferenciar células de H.
capsulatum var. capsulatum em tecidos, de células de Candida glabrata,
Penicilium marneffei, H. capsulatum var. farciminosum e formas diminutas
de Blastomyces dermatitidis (Mendes-Giannini e Melhem, 2001).
A cultura é o método definitivo no diagnóstico da HP (Kwon-
Chung e Bennett, 1992; Yeo e Wong, 2002; Lacaz et al., 2002).
O isolamento do H. capsulatum ocorre à temperatura ambiente
(27º C), em ágar Sabouraud-dextrose, ágar batata ou ágar infusão cérebro
coração (BHI) suplementado com cinco porcento de hemácea de carneiro,
produzindo micélios aéreos brancos com aspecto algodonoso; formando
colônias branco-creme a ocre-marrom, produzindo abundantes
macroconídios. A esporulação geralmente está associada com esta
coloração. Estes micélios desenvolvem-se lentamente, requerendo de 10 a
14 dias de incubação para iniciar crescimento, sendo que após varias
semanas de incubação a superfície inteira da base estará recoberta com a
colônia. Com a realização de repiques sucessivos as mesmas tornam-se
brancas, de forma irreversível, não produzindo mais estas estruturas
(Rincon, 1989; Sidrim e Oliveira, 1999; Lacaz et al., 1998; Lacaz et al.,
2002).
A reversão de micélio para levedura é observada em ágar BHI
suplementado com 5 a 10% de sangue ou com soro bovino fetal ou L-
cisteina. Neste caso, observa-se macroscopicamente a presença de colônias
sulcadas apresentando tonalidade creme a bege, que pode tornar-se
acinzentada com o tempo de cultura (Fressatti et al., 1992; Alves, 1996;
Lacaz et al., 1998; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Lacaz, et al., 2002).
52
Entre as dificuldades de isolamento do H. capsulatum pode-se
citar:
a) o tempo prolongado (duas a seis semanas) necessário para o
isolamento e identificação do agente etiológico, fato este que além de
provocar atraso na liberação do resultado pode ocasionar atraso na
introdução da medida terapêutica específica;
b) prejuízo no isolamento e identificação do fungo, por métodos
tradicionais, a partir de hemocultura, devido estes possuirem pouca
sensibilidade. Para sanar este problema, diversas modificações técnicas
foram introduzidas, visando melhorar a sensibilidade e/ou reduzir o tempo da
cultura. Entre estes se destacam: o meio bifásico (Kiehn et al., 1981), que
elevou a freqüência de isolamento de fungos a partir de sangue de pacientes
infectados; lise-centrifugação (Gill et al.,1984), introduzido no mercado como
DuPont Isolator® System, no qual o microrganismo é liberado a partir de
leucócitos sanguíneos, inativando fatores séricos inibitórios e agentes
microbianos, gerando em conseqüência maior rapidez e sensibilidade na
identificação de fungemias. Além destes, existe a monitoração automatizada
usando o BacT/Alert® System ou o BACTEC® System (Munoz et al, 1990).
A fibrobroncoscopia é um procedimento útil no diagnóstico da HP,
quando o material clínico é processado adequadamente. Unis et al. (2004),
relataram a utilização da fibrobroncoscopia para a obtenção de material
clínico de dez pacientes do sexo masculino, com idade entre 29 e 57 anos,
procedentes do Rio Grande do Sul, com HP disseminada e Aids. A avaliação
micológica foi realizada semeando-se a amostras nos meios Mycosel e ágar-
Sabouraud-dextrose acrescido de 0,01% de cloranfenicol. Segundo os
autores, a positividade do cultivo para material biológico cultivado em
Mycosel foi 60%, enquanto no ágar-Sabouraud-dextrose-cloranfenicol foi de
apenas 20%, evidenciando a importância do meio seletivo no isolamento do
H. capsulatum de espécimes clínicos potencialmente contaminados,
53
salientando também, a importância das informações clínicas para o
laboratório.
1.7.1.3. Técnicas Sorológicas
O emprego de ensaios sorológicos é de extrema importância no
diagnóstico confirmatório da HP, visto que a demonstração em exame direto
bem como o isolamento e identificação do H. capsulatum muitas vezes
apresenta resultados negativos, principalmente em formas autolimitadas da
doença. Além disso, as provas sorológicas propiciam a obtenção de
resultados em menor tempo quando comparadas as micológicas (Hopwood
e Evans, 1991; Kwon-Chung e Bennett, 1992; Hamilton, 1998; Mendes-
Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Wheat , 2003).
Entre os diferentes ensaios sorológicos existentes, testes como
imunodifusão dupla (Heiner, 1958; Kaufman, 1970; Wheat et al., 1986;
Kwon-Chung e Bennett, 1992; Hamilton, 1998; Hamilton e Gómez, 1998;
Lacaz et al., 2002; Yeo e Wong, 2002; Wheat, 2003)
contraimunoeletroforese (Kleger e Kaufman, 1973; Wheat et al., 1986; Lacaz
et al., 2002), fixação de complemento (Hopwood e Evans, 1991; Lacaz et al.,
2002) são freqüentemente utilizados para a pesquisa de anticorpos
circulantes anti - H. capsulatum.
Em 1958, Heiner detectou seis faixas de precipitação

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