Espectrofotometria - FARMACOGNOSIA

Prévia do material em texto

ESPECTROFOTOMETRIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE FARMÁCIA,	
  ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
DISCIPLINA DE FARMACOGNOSIA I
Bianca	
  Oliveira	
  Louchard
Pós-­‐Doutaranda em	
  Ciências	
  Farmacêuticas	
  – UFC
Aula	
  ref.	
  Ms.	
  Thiala Josino
PLANO DE AULA -­‐ OBJETIVOS
1. Fundamentos da espectrofotometria ;
2. Caracterizar a reação com reagente de Folin-­‐Ciocalteau;
3. Apresentar aplicações;
4. Exercícios.
O	
  princípio	
  da	
  técnica....
• Observação do espectro
solar feita por Sir Isaac
Newton em 1672.
Ele percebeu que a luz branca,
proveniente do Sol, ao incidir sobre
um prisma polido, se dispersava em
feixes coloridos e a esse conjunto
de cores chamou spectrum.”
Esta descoberta cativou físicos e químicos do
mundo todo e o estudo do espectro solar se
transformou em uma disciplina:
A ESPECTROSCOPIA
• Em	
  1802,	
  o	
  químico	
  inglês	
  William	
  Wollaston	
  notou	
  
algo	
  estranho:
O	
  princípio	
  da	
  técnica....
• Anos mais tarde Joseph von Fraunhofer inventou um
dispositivo chamado espectroscópio para estudar o
espectro solar em detalhes. Fraunhofer notou o mesmo
efeito: o espectro solar apresentava linhas escuras
Interpretando	
  a	
  luz	
  como	
  uma	
  onda,	
  as	
  diferentes	
  cores	
  
da	
  luz	
  são	
  uma	
  manifestação	
  do	
  tamanho	
  da	
  onda,	
  que	
  
se	
  caracteriza	
  pelo	
  chamado	
  comprimento	
  de	
  onda.
Fraunhofer dedicou-­‐se a estudar essas misteriosas linhas do
espectro solar, catalogando centenas delas e identificando o
comprimento de onda ao qual elas apareceram.
espectro	
  de	
  absorción o espectro	
  con	
  líneas	
  de	
  absorción.
Outro tipo de espectro também foi observado, em que, ao
contrário das linhas escuras, foram observadas linhas coloridas
em certas regiões do espectro de gases quentes, que foram
chamados de espectros de emissão ou linhas de emissão.
Entre 1859 e 1860, Bunsen e Kirchhoff observaram que diferentes
elementos poderiam produzir diferentes cores de chamas e gerar
espectros que exibiam diferentes bandas coloridas ou linhas.
Ambos são considerados os descobridores do uso da espectroscopia
para análise química incluindo para a descoberta de novos
elementos.
• Os	
  métodos	
  espectroscópicos	
  de	
  análises	
  baseiam-­‐
se	
  na	
  medida	
  da	
  radiação	
  emitida	
  ou	
  absorvida	
  
pela	
  espécie	
  de	
  interesse,	
  sendo	
  estes	
  classificados	
  
de	
  acordo	
  com	
  a	
  região	
  espectral	
  envolvida	
  na	
  
medida.	
  
ESPECTRO	
  ELETROMAGNETICO
• Dentre as técnicas analíticas que utilizam a
interação da matéria com a luz destacam-­‐se as
técnicas espectrofotométricas nas regiões do
ultravioleta (UV), Visível e Infravermelho, que
amplamente aplicadas em analises qualitativas e
quantitativas de princípios ativos em diversos
produtos farmacêuticos
ENTENDENDO UM POUCO SOBRE A RADIAÇÃO
ELETROMAGNÉTICA
Forma de energia que se transmite no universo em enormes velocidades.
Possui naturezas ondulatórias e corpuscular (ou seja: consiste em um
campo elétrico e um campo magnético oscilante que transportam
energia pelo espaço à velocidade da luz)
Velocidade	
  da	
  	
  luz	
  no	
  vácuo:	
  	
  300.000	
  km/s
RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA
RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA
ü Fluxo de partículas denominadas fótons (ou quanta) à Cada fóton
contém determinada energia cuja magnitude é proporcional à
frequência e inversamente proporcional ao comprimento de onda.
TÉCNICAS	
  ESPECTROFOTOMÉTRICAS:
FUNDAMENTOS
As técnicas espectrofotométricas estão fundamentadas
na absorção da energia eletromagnética por moléculas
que depende tanto da concentração quanto da estrutura
das mesmas.
ü ANALISES QUALITATIVAS
ü ANALISES QUANTITATIVAS
A intensidade de absorção nos diferentes comprimentos de onda na faixa
do microondas e no infravermelho dá informações sobre a estrutura
molecular (quem está ligado com quem e com que tipo de ligação
química).
O visível não é tão rico em informações estruturais, mas pode dar valiosas
informações quantitativas.
Do ultravioleta em diante, podemos
obter informações sobre a
composição elementar (pois são as
camadas internas do átomo, não-­‐
ligadas, que absorvem).
ABSORÇÃO DA LUZ
Moléculas que apresentam elétrons que podem ser promovidos a níveis
de energia mais elevados mediante a absorção de energiaà TRANSIÇÕES
ELETRÔNICAS.
ABSORÇÃO DA LUZ
Como	
  a	
  transmitância	
  varia?
• ESPESSURA
• CONCENTRACAO	
  
• PORQUE?
• O	
  aumento	
  da	
  concentração	
  diminui	
  a	
  quantidade	
  de	
  luz	
  q	
  
atravessa	
  a	
  amostra...
Espectrofotômetro
• Instrumento	
  que	
  registra	
  dados	
  de	
  
absorbância	
  em	
  função	
  do	
  
comprimento	
  de	
  onda	
  (λ).	
  
• A	
  característica	
  mais	
  importante	
  
do	
  espectrofotômetro	
  é	
  a	
  seleção	
  
de	
  radiações	
  monocromáticas.
• O	
  espectro	
  de	
  absorção	
  é	
  
característico	
  para	
  cada	
  espécie	
  
química,	
  sendo	
  possível	
  a	
  
identificação	
  de	
  uma	
  espécie	
  
química	
  através	
  do	
  seu	
  espectro	
  
de	
  absorção.
Esquema	
  dos	
  principais	
  componentes	
  de	
  um	
  
espectrofotômetro
• A	
  amostra	
  deve	
  estar	
  em	
  um	
  recipiente	
  (cubeta)	
  de	
  quartzo	
  
quando	
  a	
  radiação	
  for	
  na	
  região	
  espectral	
  do	
  ultravioleta.	
  
Quando	
  for	
  na	
  região	
  da	
  luz	
  visível	
  usa-­‐se	
  os	
  de	
  vidro	
  por	
  ter	
  
uma	
  melhor	
  dispersão.
• Os	
  detectores	
  devem	
  ser	
  altamente	
  sensíveis.
• Os	
  dados	
  obtidos	
  pelo	
  detector	
  são	
  enviados	
  para	
  um	
  
dispositivo	
  de	
  processamento	
  de	
  dados.
ABSORÇÃO DA LUZ
O	
  que	
  faz	
  a	
  absorção	
  da	
  luz	
  ser	
  diferente	
  	
  nas	
  
substancias	
  ?
SÃO OS GRUPOS CROMÓFOROS...
As	
  substâncias	
  absorvem	
  radiação	
  devido	
  a	
  presença	
  de	
  “Grupos	
  
Cromóforos”	
  !!!!
São	
  os	
  grupos	
  funcionais	
  com	
  absorção	
  característica	
  na	
  região	
  do	
  
ultra-­‐violeta	
  ou	
  do	
  visível
Ex:	
  Carboxila (-­‐ COOH):	
  200	
  – 210	
  nm
à Absorve em vários comprimentos
de onda comprimentos de onda
diferentes (vários grupos funcionais)
As	
  substâncias	
  absorvem	
  radiação	
  por	
  causa	
  dos	
  
“Grupos	
  Cromóforos”	
  !!!!
ESPECTROS DE ABSORÇÃO
Um espectro de absorção é um gráfico que
mostra a variação da absorção da
substancia conforme o comprimento de
onda.
ESPECTROS DE ABSORÇÃO
Possibilitam:
ü Identificar substâncias: as curvas de absorção são uma espécie de
“impressão digital” das substâncias e caracterizam a presença desses
compostos.
ü Identificar grupamentos químicos.
ü Indicar os comprimentos de onda para a dosagem das substâncias.
Em um raciocínio intuitivo, a concentração de uma
substância colorida, dissolvida em um solvente incolor
(como a água), é proporcional à intensidade de cor da
solução. Desse modo, a intensidade de cor é uma
medida da concentração da solução.
COLORIMETRIA
COLORIMETRIA
As substâncias são coloridas porque absorvem luz visível. Desse modo, a
luz que emerge de uma substância só vai ter os comprimentos de onda
(freqüências) que ela não absorveu.
Cada substância, pela sua estrutura molecular, absorve um padrão de
cores específico. Desse modo, o padrão de cores refletido e absorvido
determinará a cor finalda substância.
Pode-­‐se concluir que a cor da substância é a luz que ela NÃO absorveu. A
luz que interage e que tem relação com a estrutura eletrônica é a cor que
NÃO se vê.
COLORIMETRIA
CORES	
  COMPLEMENTARES
“COR	
  REMOVIDA”“COR	
  TRANSMITIDA”
COLORIMETRIA
Exercício 1: O íon Cr(II) em água, [Cr(H2O)6]2+, absorve luz com
comprimento de onda de 700 nm. Qual a cor da solução? Justifique.
(Absorvida)(Transmitida)
ESPECTROS DE ABSORÇÃO
Exercício 2: Uma solução padrão de determinado composto orgânico exibe
o espectro de absorção a seguir.
a) Considere a análise quantitativa deste composto, por
espectrofotometria e especifique em que comprimento de onda você
realizaria tal análise. Justifique sua resposta.
b) Especifique a cor predominante da luz absorvida e a cor da luz
transmitida pela solução em questão. Justifique sua resposta.
(Absorvida)(Transmitida)
COLORIMETRIA
A base de uma análise colorimétrica é a variação de cor da solução em
função da concentração do analito;
A cor da solução é, usualmente, devido à formação de um composto
colorido pela adição de um reagente apropriado ou é inerente ao
constituinte que se deseja analisar;
A intensidade da cor é comparada com a intensidade da cor que se obtém
com o mesmo procedimento pelo tratamento de uma amostra cuja
quantidade e concentração são conhecidas.
COLORIMETRIA
v Comparação	
  de	
  cor
LEI DE LAMBERT-­‐BEER
Quanto menor a	
  transmitância,
maior a	
  absorbância	
  
A=	
  -­‐ log	
  T
LEI DE LAMBERT-­‐BEER
A absorbância é muito importante porque ela é diretamente proporcional à
concentração, c, de espécies absorventes de luz na amostra.
LEI DE LAMBERT-­‐BEER
indica	
  a	
  quantidade	
  de	
  luz	
  absorvida	
  
num	
  determinado	
  comprimento	
  de	
  onda
LEI DE LAMBERT-­‐BEER
ESPECTROFOTOMETRIA – PONTOS FORTES
v Método fácil de aplicar, barato e robusto com boa precisão para análise
quantitativa de fármacos em medicamentos;
v Método de rotina para determinação de parâmetros físico-­‐químicos de
fármacos;
ESPECTROFOTOMETRIA -­‐ LIMITAÇÕES
v Moderadamente seletivo. A seletividade do método depende do
cromóforo de cada fármaco;
v Não prontamente aplicável à análise de misturas. Pode haver
necessidade de associar a técnicas cromatográficas.
ESPECTROFOTOMETRIA -­‐ APLICAÇÕES
1. Análise de conservantes (ácidos benzóico e sórbico);
2. Caracterização de óleos e gorduras;
3. Grau de oxidação de óleos e gorduras;
4. Análise de micotoxinas (Aflatoxinas);
5. Análise de clorofila e pigmentos naturais;
6. Análise de corantes;
7. Análise de carboidratos;
8. Análise de metais: Ferro (II) e Cobre (I) com reação com a 1,1 Fenantrolina
9. Determinação de fluoreto em água pelo método colorimétrico;
10. Análise de aldeído em solventes orgânicos;
11. Identificação de substâncias.
COMPONENTES DE INSTRUMENTAÇÃO
COMPONENTES DE INSTRUMENTAÇÃO
COMPONENTES DE INSTRUMENTAÇÃO
COMPONENTES DE INSTRUMENTAÇÃO
COMPONENTES DE INSTRUMENTAÇÃO
COMPONENTES DE INSTRUMENTAÇÃO
COMPONENTES DE INSTRUMENTAÇÃO
COMPONENTES DE INSTRUMENTAÇÃO
àMede	
  e	
  registra	
  a	
  intensidade	
  da	
  radiação
Co
nv
er
te
	
  lu
z	
  p
ar
a	
  
o	
  
do
m
ín
io
	
  e
lé
tr
ico
COMPONENTES DE INSTRUMENTAÇÃO
5. PROCESSADORES (converte o sinal do elemento em um número)
ü Registradores gráficos: permitem a obtenção de espectros de absorçãoà
importante para fins de caracterização da substância a partir da obtenção
dos ƛ onde se obtém as maiores absorvâncias (ƛ máximo).
ü Conexão a um microcomputador e programa apropriado à permitem a
obtenção dos espectros de absorção das substâncias em meio digital.
REAÇÃO DE FOLIN-­‐CIOCALTEAU
O reagente de Folin-­‐Ciocalteau é uma mistura de dois ácidos, o fosfomolibdico e
fosfotunguístico, os quais possuem, respectivamente, o molibdênio e o
tungstênio no estado de oxidação 6+. Estes dois compostos quando estão na
presença de agentes redutores, como polifenóis, mudam de estado oxidativo,
levando a formação de coloração azul, cuja intensidade é medida por
espectrofotometria.
REAÇÃO DE FOLIN-­‐CIOCALTEAU
O ácido gálico é geralmente empregado como padrão de referência e os
resultados expressos em equivalentes de ácido gálico.
REAÇÃO DE FOLIN-­‐CIOCALTEAU
COMPOSTOS	
  FENÓLICOS
REAÇÃO DE FOLIN-­‐CIOCALTEAU
ABSORBÂNCIA	
  715nm+ +
Esperar	
  60	
  min
Proteger	
  da	
  luz
100	
  µL	
  
Amostra
500	
  µL	
  
Reagente	
  
Folin	
  
Ciocalteu	
  
500	
  µL	
  
Na2CO3	
  
10	
  %
Curva de	
  calibração –
Pd.	
  ácido gálico
(0,83 -­‐6,67	
  μg/mL)
FOGLIANO,	
  V	
  et	
  al.,	
  1999
+
400	
  µL	
  
água
Exemplo	
  de	
  método
REAÇÃO DE FOLIN-­‐CIOCALTEAU
Exemplo	
  de	
  aplicação
ABS
0,121
0,227
0,431
0,671
0,889
Concentração
CONCENT
0,8583
1,7167
3,4333
5,1500
6,8667
y	
  =	
  ax	
  +	
  b
Intercepto	
  (b),	
  coeficiente	
  angular	
  (a)	
  e	
  coeficiente	
  de	
  determinação	
  (r²)
Perguntas:	
  marque	
  V	
  ou	
  F
1-­‐ Qualquer técnica que utilize luz para medir concentrações de espécies
químicas pode ser chamada de espectrofotometria.
2-­‐ Os procedimentos espectrofotométricos são empregados para
determinar a concentração das substâncias em condições bem definidas,
por meio da razão entre a radiação incidente e a radiação transmitida.
3-­‐ Na tecnica de espectrofotometroa UV/VIS, a radiação absorvida pela
amostra nunca pode ser comparada com a radiação absorvida por uma
substância com concentração conhecida.
Obrigada!!!!
josinothiala@gmail.com