Controle de qualidade - HPLC (1)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CURSO DE FARMÁCIA
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
INTRODUÇÃO A CROMATOGRAFIA 
LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA 
(CLAE): DETECTOR 
ESPECTROFOTOMÉTRICO
CROMATOGRAFIA
Método de separação de compostos que utiliza 
processos físicos ou químicos.
FASE	
  
ESTACIONÁRIA
FASE	
  
MÓVEL
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
A cromatografia fundamenta-se na migração diferencial dos 
componentes de uma mistura, o que ocorre devido a 
diferentes interações entre duas fases imiscíveis, sendo uma 
fase fixa que tem uma grande área superficial chamada fase 
estacionária, e a outra um fluido que se move através da fase 
estacionária sendo chamada de fase móvel. Na cromatografia 
líquida a fase móvel é líquida! (LANÇAS, 1993; DEGANI; CASS; 
VIEIRA, 1998).
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA PODE SER 
USADA PARA:
• Identificação de compostos;
• Purificação de compostos;
• Separação dos componentes 
de uma mistura.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
PLANAR COLUNA
CCD CP CLAE CONVENCIONAL
ADSORÇÃO PARTIÇÃO IÔNICA EXCLUSÃO
CROMATOGRAFIA 
CONVENCIONAL:
• TEMPO LONGO
• MONITORIZAÇÃO 
VISUAL
CROMATOGRAFI LÍQUIDA DE ALTA 
EFICIÊNCIA (CLAE = HPLC)
• HPLC – É uma abreviação do nome em inglês : High Performance (Pressure) 
Liquid Cromatography.
• Historia da HPLC: 
- Década de 60 : O começo da HPLC como High pressure LC! 
- Década de 70 : Com a melhora do material da coluna e da instrumentação, 
HPLC passa a ser High Performance LC!
- Década de 80: A partir dessa década houve um “boom” do HPLC 
- 2006- Evolução da técnica: UPLC, RRLC, UFLC...
CARACTERÍSTICAS DA HPLC
• Fase móvel líquida.
• Fase estacionária finamente 
dividida.
• Pressões elevadas.
• Alta pressão = Alto desempenho
• Seu diferencial: melhor 
desempenho cromatográfico.
VANTAGENS DA HPLC
FE é utilizada inúmeras vezes.
Versatilidade: Único requisito é a solubilidade na FM.
Tempo reduzido de análise.
Alta resolução.
Análise qualitativa: tR , espectro de absorção no UV.
Análise quantitativa: desvios menores do que 5%.
Boa detectabilidade.
Automatização.
LIMITAÇÕES DA HPLC
Alto custo do instrumento.
Alto custo de manutenção.
Alto custo de operação.
Falta de detector universal sensível.
Necessidade de experiência no seu manuseio.
COMPONENTES DA HPLC
1. RESERVATÓRIOS DA FASE MÓVEL
2. SISTEMA DE BOMBEAMENTO
3. SISTEMA DE INJEÇÃO DE AMOSTRAS
4. COLUNA
5. DETECTOR
COMPONENTES DA HPLC
1. RESERVATÓRIOS DA FASE MÓVEL
üFrascos para armazenamento de fase 
móvel de vidros (1 – 3L).
üFiltros do reservatório de aço 
inoxidável (10 a 40 um): Captar a 
fase móvel e evitar que partículas 
suspensas na FM obstruam os 
capilares ou contaminem a bomba.
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DA 
FASE MÓVEL
ü Ser de alto grau de pureza ou fácil purificação.
ü Dissolver a amostra sem decompor seus componentes.
ü Não decompor ou dissolver a fase estacionária.
ü Ter baixa viscosidade.
ü Compatível com o tipo de detector.
ü Polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da amostra.
COMPONENTES DA HPLC
2. SISTEMA DE BOMBEAMENTO
“Têm por finalidade enviar um fluxo constante e reprodutível 
de FM para o sistema cromatográfico”
CARACTERÍSTICAS:
1. Ser de material inerte
2. Pressões de até 500 atm
3. Vazão contínua
4. Vazões de 0,1 a 10 ml/min 
2. SISTEMA DE BOMBEAMENTO
BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO:
A composição da fase móvel 
permanece constante ao longo da 
análise;
Capaz de separar um número limitado 
de analitos;
Toma muito tempo;
A forma dos picos nem sempre são 
desejáveis.
BOMBEAMENTO POR GRADIENTE:
A composição da fase móvel muda;
Vantagens:
Analises Rápidas;
Melhora as Separações;
Maior Simetria dos Picos;
Desvantagens:
Tem-se que regenerar a coluna;
Incompatibilidade com alguns detectores
COMPONENTES DA HPLC
3. SISTEMA DE INJEÇÃO DE AMOSTRAS
INJEÇÃO MANUAL 
- As amostras são introduzidas com seringas. 
AMOSTRADOR AUTOMÁTICO 
- As amostras são postas em um frasco 
localizado dentro do amostrador (Mede o 
volume correto para injeção). 
INJEÇÃO 
DE AMOSTRAS
COMPONENTES DA HPLC
4. COLUNAS
COLUNAS
Aço Inoxidável;
Vidro reforçado;
PEEK polímero.
ANALÍTICAS
• Utiliza poucas quantidades.
• Para fins de identificação.
• Curtas e os tubos com paredes espessas, a fim de se evitar 
deformações internas da fase estacionária.
PREPARATIVAS
• Possuem diâmetros e vazões de operação muito maiores.
• Aplicações:
1. preparação e isolamento de compostos para fins de 
identificação;
2. preparação de padrões puros;
3. materiais de alto valor e de difícil purificação por outros 
métodos.
4. COLUNAS
PRÉ-COLUNAS
• Colunas de 2 a 5 cm.
• Mesma FE da coluna.
• É utilizada para proteger a coluna analítica.
4. COLUNAS
As colunas são a fase estacionária.
As colunas são “recheadas” com partículas 
porosas com diâmetro de 1,8 – 5 µm. 
Estas partículas porosas na coluna têm 
geralmente uma fase ligada quimicamente 
sobre a sua superfície, que interage com os 
componentes da
amostra para separá-los um do outro.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
PLANAR COLUNA
CCD CP CLAE CONVENCIONAL
ADSORÇÃO PARTIÇÃO IÔNICA EXCLUSÃO
CLAE
ADSORÇÃO PARTIÇÃO IÔNICA EXCLUSÃO
POLARIDADE:
competição entre 
moléculas da amostra 
e da fase móvel em 
ocupar os sítios 
ativos da fase 
estacionária, sólido 
(sílica).
AFINIDADE EM 
FASES LÍQUIDAS: 
baseia-se nas diferentes
solubilidades que 
apresentam os 
componentes da 
amostra na fase
móvel e na fase 
estacionária (sílica 
purificada).
CARGA IÔNICA:
A fase estacionária é 
uma resina de 
poliestireno e
divinilbenzeno, a 
qual são ligados 
grupos iônicos (SO-3, 
CO-2, NR+3, 
NH2R+).
TAMANHO:
A coluna é recheada 
com matéria inerte 
cujos poros têm 
tamanho
Controlado.
FASE NORMAL FASE REVERSA
• fase estacionária polar;
• fase móvel apolar (n-alcanos, clorofórmio, 
acetato de etila);
• solutos neutros;
• ↑polaridade soluto ↑ t. retenção;
• mecanismo retenção: ADSORÇÃO.
• fase estacionária apolar;
• fase móvel polar (tampões, água, metanol, 
acetonitrila, THF);
• solutos apolares, não-iônicos;
• ↑ polaridade f. móvel ↑ t. retenção;
• mecanismo retenção: interações apolares 
com radicais da coluna (PARTIÇÃO).
FASE NORMAL FASE REVERSA
COMPONENTES DA HPLC
5. DETECTOR
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS:
• Sensibilidade e seletividade adequada
• Ampla faixa linear
• Baixo volume interno
• Resposta Rápida
• Boa estabilidade e reprodutibilidade
• Não destruir a amostra
O detector é o “olho” do sistema cromatográfico, ele 
mede as mudanças de concentração ou a massa dos 
compostos da amostra que está deixando a coluna.
DETECTORES USADOS:
• Absorvância no UV e no visível 
(fotométrico, espectrofotômetro, arranjo 
de diodo);
• Fluorescência;
• Índice de refração;
• Eletroquímico;
• Condutividade elétrica.
DETECTOR POR 
ESPECTROFOTOMETRIA UV-VISÍVEL
Um feixe de luz é dirigido através de uma célula de fluxo e um sensor mede a luz que passa 
através da célula.
Quando um composto que absorve a energia da luz elui da coluna, ocorrerá uma
alteração na quantidade de energia que incide sobre o sensor.
Essa alteração da quantidade de energia é amplificada e dirigida para um
sistema de registro de dados.
Como resposta, um espectro de UV é obtido, o que pode ajudar na identificação
de alguns compostos.
DETECTOR POR 
ESPECTROFOTOMETRIA UV-VISÍVEL
DETECTOR POR 
ESPECTROFOTOMETRIA UV-VISÍVEL
DETECTOR POR 
ESPECTROFOTOMETRIA UV-VISÍVEL
COMPONENTES DA HPLC
SISTEMA DE AQUISIÇÃO DE DADOS
- Processar os dados obtidos pelo detector. 
- Monitoramento continuo dos parâmetros da separação edetecção de possíveis problemas.
- Registro de:
composição da fase móvel;
vazão da bomba;
injeção da amostra;
temperatura da coluna.
-­‐ SKOOG,	
  D.	
  A.,	
  HOLLER,	
  F.	
  J.,	
  NIEMAN,	
  T.	
  A.	
  Princípios	
  de	
  análise	
  instrumental.	
  5ª.	
  Ed.,	
  2002.
-­‐ COLLINS,	
  C.	
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  BRAGA,	
  G.	
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  BONATO,	
  P.	
  S.	
  Introdução	
  a	
  métodos	
  cromatográficos.
-­‐ WESTON,	
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  BROWN,	
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  HPLC	
  and CE	
  – principles and practice.	
  1997.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS