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LABORATÓRIO CLÍNICO VETERINÁRIO INTRODUÇÃO “Laboratório Clínico Veterinário” é o conjunto de exames realizados em laboratório, utilizando algum tipo de amostra biológica de um animal como sangue, fezes, urina, soro, plasma e outras. Por isso, o termo “Laboratório Clínico Veterinário” também pode ser substituído por “Patologia Clínica Veterinária” ou “Análises Clínicas Veterinárias”. Historicamente a Patologia Clínica Veterinária passou a fazer parte do currículo de graduação em Medicina Veterinária no Brasil, no final da década de 60 e início da década de 70. Muitos exames foram adaptados daqueles que eram realizados na Medicina Humana. Porém, é importante lembrarmos que quase todas as técnicas, antes de serem aplicadas em humanos, são experimentadas em animais. Sendo assim, o que teria feito com que esses exames demorassem tanto para serem utilizados pela Medicina Veterinária? São muitas as possíveis explicações: uma delas se refere à obtenção dos valores de referências para comparação com aqueles resultados nos exames dos pacientes. Para se ter esses valores de referências, vários estudos populacionais foram necessários para se conhecer, o que é o normal, em cada espécie tratada na Medicina Veterinária. Logo, para se iniciar a interpretação de qualquer resultado de exame laboratorial, é necessário termos valores de referências para compararmos. Nem sempre essas referências são números. Muitas vezes o resultado de um exame é representado por uma morfologia, uma cor ou mesmo uma palavra que expressa quantidade (p. ex: raro, pouco, freqüente, muito) ou outras características que não são números. Mesmo assim, esses resultados têm que ter referências para comparação, de maneira que possamos saber se é normal ou não para aquela espécie em questão. Quando pegamos um resultado para ler e interpretar, temos que considerar, em primeiro lugar, qual a espécie que está sendo analisada, para podermos usar os valores de referências corretos. Caso utilizemos valores de referências de uma espécie diferente, poderemos estar cometendo um erro gravíssimo. Pois esse erro pode comprometer a vida do paciente cujo exame está sendo interpretado. Esses resultados podem representar o funcionamento geral do corpo do animal ou de um ou mais órgãos e o estado em que se encontra esse funcionamento: doente ou não. A realização dos exames laboratoriais requer treinamento prático, para que não haja erros nos resultados, por causa de procedimentos executados de maneira errada. O conhecimento das técnicas e, mais importante ainda, dos fundamentos teóricos em que estão baseadas essas técnicas, é importante para realização dos exames corretamente Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 2 no laboratório. Esse conhecimento é importante na orientação da escolha da amostra biológica que é colhida para ser processada no laboratório, e também pode auxiliar na interpretação dos resultados dos exames, o que faz com que seja sempre necessário um contato contínuo entre os profissionais do laboratório e os profissionais da clínica médica. Uma etapa muito importante para que os resultados dos exames sejam corretos é a coleta adequada da amostra. Um erro nesta etapa pode comprometer, além do resultado do exame laboratorial, a interpretação que leva a conclusão de existência ou não de doença e o possível tratamento. Por isso, essa etapa que, em Medicina Veterinária, muitas vezes não é feita no laboratório e sim no consultório clínico, deve ser feita com muita atenção. Na dúvida, deve ser solicitada orientação do profissional de Laboratório Clínico Veterinário, para que o animal não seja submetido à outra coleta por causa de erros na obtenção de sua amostra (sangue, urina, fezes, raspado de pele e outras). Alguns exames são considerados inespecíficos. São aqueles que mostram se o animal está doente ou não, mas não mostra qual o órgão (por ex.: fígado, rins, pulmão ou outro) mais afetado. É o caso do hemograma, por exemplo. Esse exame é bem sensível em mostrar se existe ou não existe doença no animal e a forma (ou evolução) como este responde à doença. Porém o hemograma não mostra qual o órgão exato é o afetado pela doença. Outros exames são mais específicos, como algumas dosagens de substâncias bioquímicas do sangue. Muitas dessas substâncias dosadas no sangue representam se um órgão está funcionando perfeitamente ou não. É o caso, por exemplo, da creatinina que representa o funcionamento renal. Se o seu valor é acima do normal para espécie estudada, significa que os rins não estão com a função de filtração adequada. Veja bem, os rins não estão filtrando o sangue adequadamente, mas não podemos, só com esse resultado, saber o “porque” dessa falha na filtração. O que devemos fazer nesse caso? Já sabemos qual é o órgão doente, mas não sabemos qual é a doença que causou isso. Devemos aprofundar nossa análise sobre esse órgão. Outros exames de laboratório podem ser feitos, ainda para avaliar esse órgão. Outros, mesmo de outra natureza, como os exames que avaliam a imagem do órgão, podem complementar os resultados dos exames laboratoriais. Para terminarmos a apresentação da Patologia Clínica Veterinária, destacamos a importância do exame clínico semiológico detalhado de cada paciente, para obtermos sinais e sintomas que são fundamentais, tanto para que sejam escolhidos os exames adequados para serem realizados pelo laboratório, como para coleta das amostras Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 3 biológicas corretas para esses exames. Para interpretação dos resultados dos exames laboratoriais esses dados clínicos são imprescindíveis, ou seja, não se pode iniciar a interpretação desses resultados sem antes termos examinado minuciosamente o animal, através dos meios de exames clínicos, como palpação, percussão, aferição da temperatura, histórico e anamnese, para verificar se, as respostas do organismo e os órgãos afetados, correspondem à suspeita pelos resultados do exame clínico. Concluindo, para interpretar resultados de exames laboratoriais são imprescindíveis três etapas: primeiro conhecimento da espécie em questão; segundo os valores de referência para essa espécie, se possível diferenciados por raça e idade e, terceiro os resultados de um profundo e detalhado exame clínico. PRINCIPAIS EXAMES NA ROTINA VETERINÁRIA Quando selecionamos, um ou mais exames laboratoriais, para serem realizados para um paciente, procuramos direcioná-los a partir dos resultados dos sinais e sintomas observados no exame clínico, ou mesmo a partir do histórico e anamnese desse paciente. Nunca devemos escolher qualquer exame laboratorial, sem saber o que os possíveis resultados desse exame, podem significar para o paciente em questão. Sempre temos que ter uma suspeita clínica antes de escolhermos os exames laboratoriais. Caso contrário, será como um “tiro no escuro”, pois o resultado poderá esclarecer ou confundir mais ainda. Normalmente os exames mais usados na veterinária são: I – Exames Hematológicos 1. Hemograma – pois como dito anteriormente, é um exame sensível para indicar se existe ou não doença no corpo do animal, embora não mostre exatamente qual órgão está com a doença. Além de mostrar se existe ou não alguma doença, o Hemograma também é eficaz em mostrar se o sistema de defesa desse animal está respondendo e como é essa resposta (Adequada para combater a doença? Insuficiente para combater a doença?). Por causa dessas características (mostrar se há ou não doença e qual o tipo de resposta do paciente), o Hemograma é usado como exame de triagem e acompanhamento de evolução das doenças. Ou seja, Hemogramas vão sendo feitos sucessivamente, durante o acompanhamento da doença do animal, para saberse ele Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 4 evolui para a cura ou não. O hemograma também mostra se as células sanguíneas estão sendo produzidas em quantidade normal e se essas células têm morfologias e funções normais. Por isso, os valores de referências para os exames do hemograma, são compostos de números e também de palavras para expressar morfologias e funções normais. Muitos laboratórios incluem no Hemograma a concentração de proteínas plasmáticas, embora não seja um exame hematológico e sim bioquímico. Isso é feito, pela facilidade do método e aproveitamento da amostra, como é explicado na Apostila de Técnicas Manuais para Realização do Hemograma e Exames Complementares. 2. Contagem do número de plaquetas – também é chamado de “plaquetometria”. Esse exame mostra de maneira parcial, a capacidade de coagulação do sangue. É um exame importante em um pré-operatório, pois o animal passará por incisões (cortes) durante a cirurgia e precisará ter capacidade de coagulação perfeita. Por ser feito na mesma amostra de sangue usada para o hemograma, alguns laboratórios, já incluem nesse exame. Associado com os resultados do hemograma pode mostrar se a medula óssea está produzindo glóbulos sanguíneos em quantidade, morfologias e funções normais. Para avaliar a coagulação de maneira mais completa, serão necessários pelo menos mais dois exames laboratoriais que não são de rotina veterinária. Esses exames são o Tempo de Protrombina e o Tempo de Tromboplastina parcial Ativada que são mostrados, discutidos e interpretados na Apostila de Interpretação do Plaquetograma e do Coagulograma. 3. Contagem de reticulócitos – É a contagem de hemácias imaturas no sangue. Também é feita na mesma amostra do hemograma, no entanto só é realizada se for solicitada pelo clínico, após interpretar os resultados do hemograma e concluir que é necessária. Como pode ser feita em sangue colhido até 24 horas pode ser feito depois que já foi feito todo hemograma. 4. Pesquisa de Hemoparasitas – também chamado de “Pesquisa de Hemocitozoários” ou “Pesquisa de Hematozoários”. Esse exame é a procura de parasitos sanguíneos de diferentes tipos, como: Ehrlichia sp., Babesia sp., Hepatozoon sp., Hemoplasmas, microfilárias e outros parasitas. Esses exames são realizados no mesmo material colhido Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 5 e enviados para o laboratório realizar o hemograma, por isso, será mostrado na Apostila de Técnicas Manuais para Realização do Hemograma. II – Exames Bioquímicos Séricos Esses exames são dosagens de substâncias que estão no sangue e têm diferentes significados, dependendo da substância dosada. Normalmente são disponibilizados pelos laboratórios de Veterinários como “Perfil do órgão” que se associa às substâncias dosadas. Por exemplo: “Perfil Hepático”, “Perfil renal”, “Perfil Pancreático” e outros “Perfis”. As substâncias mais dosadas em Medicina Veterinária e os órgãos com os quais estão associados são: 1. Uréia – avalia a capacidade de filtração glomerular; 2. Creatinina – também avalia a capacidade de filtração glomerular; 3. Transaminase Alanina Aminotransferase, chamada de ALT ou TGP (Transaminase Glutâmica Pirúvica) – avalia função metabólica hepática, em carnívoros (cães e gatos). 4. Transaminase Aspartato Aminotransferase, chamada de AST ou TGO (Transaminase Glutâmica Oxalacética) – avalia função hepática em herbívoros (eqüinos e ruminantes), mas também é importante em carnívoros em casos de suspeita de necrose de células hepáticas. 5. Fosfatase Alcalina – também avalia função hepática em todas as espécies. Mas também está relacionada com função óssea em todas as espécies e com função endócrina de glândula adrenal em cães. 6. Proteínas Totais – estão associadas com vários órgãos e sistemas. 7. Albumina – proteína que faz parte das “Proteínas Totais” e avalia a capacidade de síntese hepática, mas também tem outros significados quando associada a outros exames laboratoriais, como por exemplo, a ”Urinálise” que detecta presença ou não desta proteína na urina. 8 – Globulinas – Também faz parte da “Proteínas Totais” e avalia a produção de proteínas que participam dos mecanismos de defesa do animal, como por exemplo, as imunoglobulinas (anticorpos) produzidas pelos linfócitos diferenciados em plasmócitos, após ativação do sistema imune. Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 6 Normalmente os laboratórios se referem aos três exames anteriores como: “Proteínas Totais e Frações”. 9. Amilase – avalia função pancreática, embora não seja muito específico, devido ao fato de ser produzida também em outros órgãos e ter tempo de permanência no sangue relativamente curto, após lesão pancreática. 10. Lípase – também avalia função pancreática e é um pouco mais específico que a Amilase, embora também seja produzida por outros órgãos, e ter o tempo de permanência no sangue, após lesão pancreática, um pouco maior que a Amilase. 11. Creatina quinase ou creatinofosfoquinase (CK ou CPK) – avalia função neurológica e muscular, mas têm isoenzimas específicas para músculo esqulético e cardíaco. A discussão da interpretação de cada um desses exames será feita na Disciplina de Laboratório Clínico Veterinário II. III – Exames Urinários 1. Urinálise – também chamado de EAS, ou seja, pesquisa dos Elementos Anormais e Sedimentoscopia urinária. Na urina são encontradas substâncias resultantes do metabolismo normal do corpo. Por isso, as alterações nas quantidades dessas substâncias podem ter diferentes significados. Não devemos pensar que os exames da urina se referem apenas às funções renais. Podem estar relacionados também com o fígado, pâncreas, sistema endócrino, metabolismo e catabolismo eritrocitário e outros. A urinálise normalmente não apresenta quantificação exata das substâncias dosadas e das estruturas observadas no sedimento, mas mostra um resultado expresso em cruzes ou palavras para ser comparado com os referenciais. A discussão da interpretação de cada um desses exames é feita na Disciplina de Laboratório Clínico Veterinário II. 2. Cultura microbiológica da urina e Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA) – esses exames são realizados quando tem resultados suspeitos de infecção urinária no exame da Urinálise, como muitos piócitos no sedimento urinário ou muitas bactérias ou fungos e, a coleta da urina, não teve contaminação externa ao corpo do animal. A partir do resultado da urinálise é que se observa a necessidade de realização da cultura microbiana e, depois da cultura, é que se solicita o TSA, para pesquisar a melhor substância capaz de eliminar, ao máximo, o microrganismo que está proliferando no sistema urinário e então, efetuar o tratamento do paciente com antibiótico específico. Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 7 3. Dosagens Bioquímicas - Atualmente podem ser encontrados laboratórios que dosam vários metabólitos, medicamentos, hormônios e outras substâncias na urina, mas não são dosagens de rotina clínica veterinária. IV – Exames Coproparasitológicos e Ectoparasitológicos Esses exames são pesquisas de parasitos em fezes (coproparasitológicos) e em raspado ou biópsia de pele (ectoparasitológicos). Talvez sejam mais comuns do que todos os exames anteriores e muitas vezes feitos no próprio consultório clínico, pois os parasitos adultos podem ser observados e identificados com auxílio de uma lupa que é um equipamento também utilizado no exame clínico. No entanto, algumas espécies adultas e fases mais jovens desses parasitos (larvas e ovos) só são observadase identificadas com auxílio do microscópio e, por isso, o exame deve ser feito no Laboratório Clínico Veterinário. Existem outros exames laboratoriais que não são muito solicitados na rotina Médica Veterinária, mas que vêm sendo cada vez mais usados, porque são complementares aos de rotina, descritos anteriormente e estão relacionados com: A. aprofundamento da interpretação de algum dos exames anteriores; B. especificação maior de diagnóstico, para procurar melhor o órgão afetado pela doença; C. pesquisar o agente etiológico da doença, ou seja, o fator desencadeador da doença. A. Em relação a exames que podem aprofundar a interpretação dos exames anteriores podem ser exemplificados: 1. Contagem de reticulócitos, punção de medula óssea e biópsia de medula óssea – esses três exames complementam o Hemograma e a Contagem de Plaquetas, principalmente quando esses exames estão sendo usados para avaliar a capacidade de produção dos glóbulos sanguíneos. 2. Teste de Sensibilidade Antimicrobiana (TSA) a partir da cultura microbiológica. Esse teste serve para procurar qual a substância farmacológica consegue controlar o crescimento do microrganismo presente na amostra biológica. Deve ser realizado logo após a Cultura Microbiana a partir de qualquer amostra biológica, supostamente com o agente infeccioso (bactérias ou fungos). Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 8 B. Para especificação maior de diagnóstico, para procurar melhor o órgão afetado pela doença: 1. Outras substâncias podem ser acrescentadas nos “Perfis” bioquímicos de cada órgão, por exemplo, Gama glutamil transferase (GGT) pode aumentar o “Perfil Hepático”. As transaminases que avaliam o fígado (ALT e AST) podem ter isoenzimas associadas a outros tecidos, como por exemplo, a AST pode avaliar função muscular. Da mesma forma a Fosfatase Alcalina, com suas isoenzimas óssea e de glândulas adrenais (cães). Muitas vezes esses exames não são solicitados por causa do custo para o cliente ou porque alguns laboratórios não disponibilizam. C. Para pesquisar o agente etiológico da doença, vários exames podem ser realizados. 1. Os mais simples são: a Pesquisa de Hemoparasitas e os exames Copro e Ectoparasitológicos, citados anteriormente. Mas existem testes muito mais sensíveis e específicos do que a procura direta desses parasitos no sangue, nas fezes ou raspados de pele. Além disso, outros agentes etiológicos causadores de doenças que não são vistos no sangue, fezes e pele (ou outras amostras biológicas) também são importantes, como muitas bactérias (Leptospira sp., Staphylococcus sp., Escherichia sp. e outras), vírus (raiva, pavovirose e outros) fungos e protozoários que dependem de outros métodos para serem diagnosticados. 2. Cultura microbiológica – pode complementar vários exames, por exemplo, o exame de urina, como comentado anteriormente, quando se lê no resultado deste exame, muita presença de bactérias e é descartada a possibilidade de contaminação da amostra ou, é lido no resultado: muitos piócitos. A cultura microbiana também pode ser feita em várias outras amostras biológicas: secreções, líquidos cavitários (articular, céfaloraquidiano, ascítico, torácico e outros), sangue, fezes e outras. A cultura pode ser direcionada para bactérias ou fungos, através da seleção do meio de cultura usado para o crescimento do microrganismo. A cultura para outros tipos de microrganismos, como vírus, rickétsias e outros de crescimento mais complexo, é possível, mas são menos freqüentes no diagnóstico de doenças em Medicina Veterinária. 3. Existem testes sorológicos (imunológicos) que pesquisam a existência de anticorpos contra agentes infecciosos. Nesse caso devemos lembrar que, por causa da memória imunológica, nem sempre um animal com anticorpos para uma determinada doença ainda está com essa doença. Isso pode significar apenas que o paciente teve Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 9 contato com a doença, mas pode estar apenas com anticorpos resultantes da estimulação e memória imunológica. 4. Atualmente os testes moleculares (pesquisam o DNA do parasito) são mais precisos em mostrar se o animal tem ou não o parasita. Através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) o DNA do microrganismo é amplificado e posteriormente detectado. No entanto, se a quantidade de DNA, do agente causador da doença, na amostra pesquisada estiver muito baixa, o teste também pode ser falsamente negativo. Mas ainda assim esses testes são muito sensíveis. A maior dificuldade para esses exames fazerem parte de uma rotina clínica é o preço para os clientes. EXAMES QUE COMPÕEM O HEMOGRAMA O Hemograma é o exame que avalia os glóbulos sanguíneos: leucócitos, hemácias e plaquetas. Avalia quantitativamente e qualitativamente, ou seja, além de mostrar as quantidades desses três glóbulos, mostra como estão os aspectos morfológicos e funcionais deles. O Hemograma pode ser dividido em três partes: Eritrograma que avalia as hemácias; Leucograma que avalia os leucócitos e Plaquetograma que avalia as plaquetas. Cada um deles tem exames quantitativos e qualitativos. O reconhecimento de cada exame, pelo seu nome, é fundamental para o estudo da interpretação dos resultados. Primeiramente é mostrado os exames do Leucograma: 1. Leucometria Global – mostra a quantidade total de leucócitos por volume de sangue. Esse volume pode ser microlitro (µL) ou milímetro cúbico (mm3). 2. Leucometria Específica – mostra a quantidade e a qualidade de cada tipo leucocitário. Esses resultados são colocados em uma seqüência padrão dos tipos leucocitários chamada “Fórmula de Schilling” (ou “Ordem de Schilling” ou “Sequência de Schilling”). Nessa ordem, primeiro vem o resultado dos Basófilos, depois dos Eosinófilos, seguido dos Neutrófilos, em penúltimo os resultados dos Linfócitos e por último os Monócitos. Essa seqüência padronizada permite que se coloquem os resultados numéricos de cada leucócito, sem necessidade de se escrever os nomes dos leucócitos. No caso dos Neutrófilos os resultados são subdivididos pelos tipos de células jovens de neutrófilos que podem aparecer no sangue do paciente examinado, por exemplo: bastão, metamielócito e Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 10 mielócito que são neutrófilos ainda jovens e que normalmente não estão no sangue circulante e sim na medula óssea. Assim, a seqüência de Schilling completa é: basófilos, eosinófilos, mielócitos, metamielócitos, bastões, segmentados, linfócitos e monócitos. A Leucometria Específica é dividida em: 2.1. Leucometria Específica Relativa - A quantidade de cada leucócito é mostrada em porcentagem (%) e colocada na Ordem de Schilling, por exemplo: 0 -7 - 0 - 0 - 0 - 75 -10 - 8, totalizando 100, pois os valores são percentuais. Assim, não é necessário colocar os nomes dos leucócitos, pois estão na seqüência padronizada. 2.2. Leucometria Específica Absoluta – A quantidade da cada leucócito é mostrada em número por volume de sangue. É obtida relacionando-se a Leucometria Específica Relativa com a Leucometria Global. Exemplo: Leucometria Global = 10000/µL e a leucometria específica, segundo a Fórmula de Schilling exemplificada anteriormente: 0 -7 - 0 - 0 - 0 - 75 -10 - 8, os valores absolutos corresponderão a 0 - 700 - 0 - 0 -0 - 7500 - 1000 – 800 cada um desses valores por volume de sangue (µL ou mm3). 2.3. Morfologia Leucocitária – também pode ser chamado de Hematoscopia Leucocitária ou Leucoscopia. Durante a confecção da leucometria específica relativa os leucócitos são observados para serem classificados e também para serem analisados quanto suas morfologias, se estão normaisou não. Esse exame pode não ter um nome específico, na maioria dos laboratórios, sendo colocado como “observações”, mas pode estar dentro da Hematoscopia que é o exame dos glóbulos sanguíneos em geral. Lembrar que valores de referências nem sempre estão associados apenas a números, também podem ser aspectos morfológicos e, em hematologia isso será sempre importante. Esses aspectos são abordados mais profundamente nas apostilas de “Interpretação do Leucograma” e “Interpretação do Eritrograma”. O Eritrograma é composto pelos seguintes exames: I – Exames Quantitativos: Esses exames expressam a quantidade de hemácias ou de Hemoglobina no sangue de um animal. São três exames: Volume Globular, Hematimetria e Hemoglobinometria. 1. Volume Gobular ou Hematócrito – mostra a quantidade de hemácias compactadas em uma coluna de sangue, dividida em cem (100) partes iguais, logo essa quantidade é Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 11 mostrada em porcentagem (%). Chamaremos a partir daqui esse exame de VG, pois ele será usado em fórmulas para calcular resultados de outros exames. 2. Hematimetria – é a quantidade de hemácias por volume de sangue. Semelhante a Leucometria Global, esse volume sanguíneo pode ser em µL ou mm3. Chamaremos a Hematimetria de H, pois também será utilizada para calcular resultados de outros exames. 3. Hemoglobinometria – é a quantidade de Hemoglobina em massa por volume de sangue. A massa normalmente está em gramas (g) e o volume sanguíneo em decilitros (dl) que corresponde a 100 mililitros (mL), assim colocamos o resultado em g/dl ou g%. Chamaremos a Hemoglobinometria de Hb, pois também será utilizada para cálculo de outros exames. II – Exames Qualitativos – São os exames que mostram como estão as hemácias quanto ao aspecto morfológico. Esses exames são de dois tipos: os índices Hematimétricos e a Hematoscopia. II.1. Índices Hematimétricos – são índices calculados a partir das análises quantitativas (VG, H e Hb) e servem para mostrar o tamanho da hemácia e o seu conteúdo de hemoglobina. Esses índices são três: 1. VGM (Volume Globular Médio) que também é chamado de VCM (Volume Corpuscular Médio) e mostra o tamanho (em volume) da hemácia em fentolitros (fL) que é uma subunidade do litro ; é calculado dividindo o VG pela H. 2. CHGM (Concentração de Hemoglobina Globular Média) que também pode ser chamado de Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média e mostra o conteúdo de hemoglobina dentro da hemácia em porcentagem (%); é calculado dividindo a Hb pelo VG. 3. HGM (Hemoglobina Globular Média) que como os dois índices anteriores também pode ter o termo “globular” substituído por “corpuscular”. Tanto um termo quanto o outro servem para se referirem a hemácia como glóbulo sanguíneo. Este último índice também mostra o conteúdo de hemoglobina dentro da hemácia, mas em massa, ou seja, em picograma (pg) que é uma subunidade do quilograma (kg). É calculado dividindo a Hb pela H. Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 12 Os cálculos desses Índices são explicados na ApostilaI de Técnicas Manuais para Realização do Hemograma e, o significado interpretativo, na de Interpretação do Eritrograma. Os dois últimos índices indicam a mesma coisa: conteúdo de hemoglobina dentro das hemácias, um em porcentagem e o outro em massa, mas o CHGM é o mais usado. Essa explicação também é discutida na parte de Interpretação do Eritrograma. II.2. Hematoscopia – é o exame que se faz olhando, uma lâmina corada de sangue, no microscópio. A confecção dessa lâmina é mostrada nesta Apostila, no Tópico de Coleta de Sangue para exames Laboratoriais e, a preparação e leitura ao microscópio, na Apostila de Técnicas Manuais para Realização do Hemograma e alguns Exames Complementares. Nesse exame, as hemácias são vistas como se fossem fotografadas com a morfologia em que se encontram no sangue do animal. Por isso são vistas com o tamanho e conteúdo de hemoglobina que devem ser iguais aos calculados nos Índices Hematimétricos. Ou seja, se ao calcularmos VGM e CHGM normais para espécie testada, à visualização microscópica deverá mostrar hemácias de tamanhos normais (normocíticas) e conteúdos de hemoglobina normais (normocrômicas) também. Caso contrário, ou seja, se não houver concordância entre o calculado e o observado deve-se optar por corrigir as análises quantitativas que foram usadas para calcular VGM e CHGM, já que as hemácias observadas ao microscópio são realmente como elas estão no sangue, em tamanho e conteúdo de hemoglobina. Por isso, ao se analisar a lâmina hematológica para o hemograma o patologista deve ter experiência em reconhecer o tamanho normal para cada espécie para fazer essa comparação, como é explicado em tópico específico Análise do Esfregaço Corado no Microscópio, na Apostila de Técnicas Manuais para Realização do Hemograma e alguns Exames Complementares. Além de corrigir VGM e CHGM, pode corrigir também, indiretamente, as análises quantitativas do Eritrograma, do Leucograma e do Plaquetograma. Na Hematoscopia também é observado se as hemácias estão com formato normal para espécie que, para maioria, é arredondada. Observa-se ainda na Hematoscopia se há presença de inclusões dentro das hemácias, pois, no caso dos mamíferos essas hemácias normalmente não apresentam inclusões. Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 13 Exemplos de campos de Hematoscopia: na foto A são mostradas hemácias normais de ruminante(apontada pela seta preta e, também, estruturas semelhantes à ela). As estruturas menores (seta amarela) são plaquetas. Na foto B são mostardas hemácias normais de canino. Sendo que na foto B há uma hemácia com inclusão (seta). Essa foto B será novamente mostrada e interpretada na Apostila de Interpretação do Eritrograma. Embora a Hematoscopia e a Leucometria Específica sejam feitas no mesmo material, ou seja, na lâmina observada ao microscópio, são realizados em regiões diferentes, como mostrado em esquema do item de Confecção do Esfregaço Hematológico e, na Apostila de Técnicas Manuais para Realização do Hemograma e Exames Complementares, são mostradas como esses exames são feitos. Atualmente existem aparelhos automatizados que, durante a realização do hemograma, já medem o tamanho da hemácia, calcula o CHGM através da dosagem de hemoglobina (Hb) e do VG e mostram outras análises eritrocitárias, através de gráficos, como a variação de tamanho entre as hemácias que os aparelhos chamam de RDW. Esses aparelhos também podem mostrar através de gráficos, possíveis alterações leucocitárias, quando são do tipo que realizam leucometria específica. Os gráficos feitos por esses aparelhos são denominados de Histograma. Mas, em Medicina Veterinária, é fundamental a análise da lâmina, como é discutido nas Apostilas de Interpretação do Eritrograma e do Leucograma. O Plaquetograma é um conjunto menor de exames, pois outras análises plaquetárias podem ser feitas no Coagulograma. O Plaquetograma é composto dos seguintes exames: 1. Plaquetometria – é a quantidade de plaquetas por volume de sangue (µL ou mm3). É um dos exames que mais sofre influência se a amostra sanguínea não tiver sido colhida adequadamente. Pode haver, principalmente, redução no número de plaquetas se forem feitas várias perfurações durante a tentativa de puncionar a veia para coleta ou se a amostra não for homogeneizada imediatamente com o anticoagulante. Outros fatores também podem interferir no resultado final da plaquetometria, como são descritos no Hemácias de Ruminante (seta preta)e plaquetas (seta amarela). Aumento 1000x Hemácias de Canino. Na seta hemácia com inclusão parasitária. Aumento 1000x A B Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 14 tópico de Plaquetometria na Apostila de Técnicas Manuais para Realização do Hemograma e alguns Exames Complementares. 2. Morfologia Plaquetária – também é feita na mesma lâmina corada de sangue observada ao microscópio. São observados: tamanho, formato e inclusões plaquetárias. Na foto B, com sangue de ruminante, são observadas plaquetas normais para essa espécie. Esses resultados também têm significados que são discutidos na Apostila de Interpretação do Plaquetograma e do Coagulograma. Nos laboratórios que utilizam métodos automatizados de contagens dos glóbulos sanguíneos, a plaquetometria já faz parte do hemograma, no entanto, naqueles laboratórios que utilizam técnicas manuais essa contagem pode não estar incluída no hemograma e ter que ser solicitada separadamente. Isso porque a contagem manual de plaquetas é trabalhosa e requer alguma experiência por parte do profissional de laboratório. Alguns aparelhos também fazem análise do tamanho plaquetário e mostram sob a forma de gráfico e valores numéricos (PDW) essa variação no tamanho das plaquetas. EXAMES COMPLEMENTARES AO HEMOGRAMA DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA Vários exames complementam as informações do hemograma, no entanto, alguns são realizados na mesma amostra de sangue enviada ao laboratório para fazer o hemograma. Por isso, muitas vezes devem ser solicitadas junto ao hemograma para que não haja necessidade de outra coleta no animal. Alguns laboratórios podem incluir alguns desses exames no hemograma. Os principais exames complementares são: 1) leitura de proteínas plasmáticas totais; 2) dosagem de fibrinogênio, principalmente em herbívoros; 3) contagem de reticulócitos, em animais anêmicos com exceção de equinos; 4) pesquisa de hemoparasita. Alguns desses exames são descritos na Apostila de Técnicas Manuais para Realização do Hemograma e alguns Exames Complementares. Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 15 COLETA DE SANGUE PARA EXAMES LABORATORIAIS A coleta de material para exames laboratoriais em Medicina Veterinária é bem diferente do que ocorre na Medicina Humana. Algumas considerações e comparações são feitas nesta apostila, para que seja destacada a importância de uma coleta bem feita, a fim de que o material colhido sirva para ser processado no laboratório. Na Medicina Veterinária, a coleta de sangue para exames laboratoriais, muitas vezes é negligenciada, pelos mais variados motivos. Um dos mais freqüentes é o fato da amostra não ser coletada por um técnico especializado em exames laboratoriais sangüíneos, como ocorre na Medicina Humana. Outro motivo, é que ao solicitar um determinado exame, não ocorre um contato prévio entre o solicitante e o laboratório que irá realizar o exame, o que poderia esclarecer dúvidas como: qual o melhor tipo de amostra sangüínea? Qual o tempo máximo ideal para que esta amostra seja processada? Qual a melhor maneira de conservação desta amostra? Qual a melhor forma de colher a amostra? E, outras dúvidas, que o laboratório provavelmente, teria um profissional apto para esclarecer. Um elemento muito importante a se considerar, de diferença marcante, entre a Patologia Clinica Humana e a Veterinária, sob o aspecto da coleta sangüínea, é que na Humana, o próprio paciente se encaminha ao laboratório, muitas vezes escolhido por ele mesmo, para que a coleta seja feita adequadamente. Caso haja necessidade de uma preparação prévia desse paciente, ele é orientado no próprio laboratório, pelo técnico especializado para isso. Na Patologia Clinica Veterinária, no entanto, a coleta de sangue é feita, na grande maioria das vezes, na clínica onde o animal foi com o proprietário, a fim de que fossem feitos exames clínicos e tratamento. Sendo assim, o médico veterinário, além de examinar e selecionar os exames complementares para esclarecimento das alterações clínicas, tem que interpretá-los, prescrever o tratamento, e ainda definir e colher o melhor material biológico a ser encaminhado ao laboratório. Essas tarefas raramente são desenvolvidas pelos médicos humanos, a menos que seja uma coleta de alto risco para o paciente, sendo necessária intervenção do médico, como ocorre, por exemplo, na punção e biópsia de medula óssea e na coleta de líquido encéfalo-raquiano. Por tudo isso, é necessário que se tenham alguns cuidados na coleta de material, para que os resultados dos exames laboratoriais não sejam alterados por erros, antes do processamento da amostra. Esses erros são chamados de “pré analíticos”, pois são erros que ocorrem antes da análise do material no laboratório, mas que prejudicam os Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 16 resultados obtidos durante o processamento e, consequentemente, a interpretação desses resultados. Nesta apostila é focada a coleta de sangue para exames hematológicos, relacionados com: Hemograma, Pesquisa de Hemoparasitas e Coagulograma. I – ESCOLHA DOS LOCAIS DE PUNCÃO VASCULAR Em termos gerais, a punção venosa é feita, em pequenos animais, escolhendo em um dos membros anteriores, a veia cefálica e, em grandes animais, a veia jugular. No entanto, deve-se considerar como ideal a veia que fica mais volumosa ao sofrer garrote e também a mais fixa e segura quanto aos movimentos do animal. Deve-se escolher a veia considerando ainda o temperamento do animal e, por isso, em um local do corpo em que, o profissional que faz a coleta, esteja mais protegido de um possível ataque agressivo desse animal. Sendo assim, procurando um local com veia que acumule bom volume sanguíneo e seja fixa, em pequenos animais de tamanho muito reduzido, pode-se optar pela punção da veia jugular. Em alguns animais mais agressivos ou agitados, como os gatos, há também a opção das veias dos membros posteriores. Em grandes animais esta também é uma alternativa. No entanto deve ser lembrado que, tanto para pequenos quanto para grandes animais, estas são veias pouco fixas e no momento da punção, a perfuração deve ser lateral, para evitar que se desloque ou sofra perfuração que atravesse de um lado até o outro da parede vascular. A pressão vascular também é um fator importante para escolha do vaso a ser puncionado. Em um paciente desidratado, por exemplo, mesmo que se tenham vasos de grandes calibres e, bem evidentes, deve-se tentar repor o volume hídrico antes da coleta de sangue, a fim de que a punção não seja prejudicada. A punção intracardíaca deve ser evitada, mas pode ser uma última opção de escolha, naqueles casos de total impossibilidade de se realizar a coleta em vasos periféricos e, o exame laboratorial, for imprescindível. Isso porque a manipulação pode causar lesões irreversíveis ao miocárdio ou mesmo a morte do indivíduo. Portanto, caso seja necessário esse tipo de coleta, ela deverá ser feita com cuidado e por profissional experiente. Após a escolha da veia para coleta da amostra sanguínea, o local deve ser higienizado com anti-sépticos. Pode-se ou não fazer tricotomia sobre o vaso sanguíneo no ponto em que será feita a perfuração. A tricotomia permite melhor visualização do vaso e também que o anti-séptico seque mais rápido. Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 17 Selecionado o vaso e feita a higienização do local, deve-se amarrar o garrote de borracha com um laço de fácil abertura, acima do ponto onde é feita a perfuração vascular, para que o sangue se acumule no local e seja aspirado com mais facilidade.Imediatamente após o garrote o vaso deve ser puncionado para a coleta do sangue, a fim de se evitar isquemia local. Raros são os casos em que o garrote deve ser mantido por algum tempo antes da punção. Esses casos são aqueles em que o paciente se encontra com volemia reduzida ou com hipotensão vascular. O garrote também pode ser feito com a mão do profissional que coleta o sangue ou por outro profissional que auxilia na contenção do animal, como mostrado na seqüência de fotos a seguir que ilustra a coleta de sangue. A seqüência de fotos mostra a punção venosa em um cão de médio porte e é usado o sistema de coleta a vácuo que é chamado de “coleta múltipla”. Isso porque através de uma só punção vários tipos de amostras sanguíneas podem ser coletados separadamente e diretamente no tubo que é encaminhado ao laboratório: com anticoagulante (vários tipos identificados pela cor da tampa) e sem anticoagulante (tampa vermelha). Todas as fotos são da autora. Material para coleta de sangue: luvas descartáveis, algodão, frasco com anti-séptico, agulha, seringa, tubos a vácuo com tampas de cores diferentes (vermelha sem anticoagulante para obter soro, roxa com EDTA e cinza com fluoreto de sódio), agulhas e aparelho para coleta a vácuo. Profissional calçado com luvas descartáveis, destampando a agulha de coleta a vácuo. A parte destampada é coberta por uma borracha de proteção que será empurrada pela tampa do frasco de coleta, no momento da punção. A outra parte da agulha permanece tampada e só será destampada no momento de perfuração do vaso, no paciente. Agulha de coleta a vácuo sendo acoplada e rosqueada no aparelho de coleta (A). Agulha de coleta a vácuo é destampada para ser introduzida no vaso do paciente (B) .A B Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 18 Paciente canino contido na mesa de atendimento clínico, deitado em decúbito lateral. Garrote na veia cefálica feito manualmente, enquanto outro profissional toca com o dedo, a superfície do vaso a ser puncionado, no membro anterior esquerdo, que está limpo com anti-séptico a base de iodo. Ao lado está o tubo de coleta com EDTA. Aparelho com agulha acoplada já puncionada no animal e com tubo sendo introduzido, por dentro do aparelho, para que seja perfurado internamente pela agulha, que estava coberta com borracha. Após a pressão negativa aspirar o sangue para dentro do tubo, o sangue pára de entrar quando esta pressão termina. Retira-se o tubo e permanece a agulha puncionando o vaso, para que outro tubo possa ser introduzido no aparelho. Tubo de coleta a vácuo com tampa vermelha, para obtenção de soro, sendo introduzido no aparelho de coleta a vácuo, imediatamente depois de retirada do tubo de tampa lilás (com EDTA). Tubo de coleta a vácuo com tampa vermelha, para obtenção de soro, sendo empurrado para que a agulha interna no aparelho possa perfurar a tampa, empurrando a borracha de proteção. Término da coleta a vácuo onde se retira todo o conjunto: agulha, aparelho e o último tubo de coleta. Esse procedimento só deve ser feito no final, senão permitirá entrada de ar no tubo, acabando a pressão negativa. Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 19 A seguir são mostradas fotos com a seqüência de coleta de sangue em eqüino, seguidas de coleta de sangue capilar no mesmo animal. Todas as fotos também são da autora. Último tubo de coleta sendo retirado do aparelho que está com a parte da agulha, que perfura o vaso do animal, tampada (C). Agulha de coleta a vácuo sendo descartada em recipiente apropriado para objetos perfuro cortantes. Observar que a outra parte perfurante se encontra coberta com a borracha de proteção, no entanto, está sem a tampa(D). C Punção com agulha e seringa em veia do membro posterior em um paciente canino. Animal deitado na mesa de atendimento clínico em decúbito lateral. Contenção e garrote manuais. Punção com agulha e seringa em veia jugular em um paciente canino, deitado na mesa de atendimento clínico, em decúbito lateral. Contenção e garrote manuais. Observar que, o mesmo profissional que colhe o sangue, faz a contenção da cabeça do animal com a mão esquerda, enquanto aspira o sangue, com a seringa na mão direita. Isso porque este paciente é muito pequeno. Confecção do esfregaço sanguíneo com amostra de sangue fresco, imediatamente após a coleta de sangue. Material essencial para fazer o hemograma. Seqüência mostrando confecção do esfregaço. Detalhes para confecção do esfregaço no texto, em tópico específico. Seqüência mostrando anti-sepsia (A) e garrote de veia jugular (B) em paciente eqüino. Animal em estação contido pelo cabresto por outra pessoa, enquanto o profissional veterinário faz o procedimento de coleta de sangue. A B D Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 20 Seqüência de coleta de sangue capilar na ponta de orelha em eqüino para confecção de esfregaço, para pesquisa de hemocitoparasitas: Seqüência mostrando palpação digital da veia jugular repleta de sangue (C) e punção (D) com agulha acoplada ao aparelho de colheita a vácuo. Observar que o profissional já está com o tudo de coleta com EDTA para introduzi-lo no aparelho, como mostrado na foto a seguir (E). Em (E) o tubo com EDTA é introduzido no aparelho de coleta a vácuo e em (F) o tubo começa a ser preenchido de sangue, indicando que a posição da agulha está perfeitamente correta, dentro do vaso. Nesta seqüência é mostrado o preenchimento total do tubo de coleta a vácuo. O sangue pára de entrar quando acaba a pressão negativa dentro do tubo. Em (J) é mostrada a ponta da orelha como local de escolha e em (L) a borda da orelha é esticada para mostrar que a coleta é feita bem na superfície para ser sangue de capilares. Nesta seqüência o profissional está fazendo uma pequena incisão com o bisel da agulha de punção venosa. Em (N) a imagem está mais aproximada. Essa coleta pode ser feita com ou sem tricotomia. C D E F G H I J L M N Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 21 Os detalhes da confecção do esfregaço de sangue capilar são descritos a seguir, no tópico específico de confecção de esfregaço, e mais fotos dessa técnica são mostradas em pequenos animais. II - TIPOS DE AMOSTRAS SANGUÍNEAS PARA EXAMES LABORATORIAIS Após o exame clínico semiológico, o veterinário conclui quais os parâmetros sanguíneos seriam importantes para complementar e confirmar sua(s) suspeita(s) clínica(s). O importante nesse momento é saber qual o tipo de amostra sanguínea é necessário, para o laboratório obter o resultado do exame que se quer solicitar. Assim, podemos começar a dividir os tipos de amostras sanguíneas em dois tipos: Após a pequena incisão é feita uma pequena compressão com as pontas dos dedos (O), para que saia uma gota se sangue (P), que será coletada para confecção do esfregaço. Esta sequência mostra duas formas de coleta da gota do sangue capilar: com a extensora em (Q) e com a lâmina onde será espalhada a gota em (R). Com a gota de sangue na extensora, o profissional apóia sobre a lâmina (S) e estende o sangue até a extremidade oposta (T). Com o esfregaço feito, o profissional coloca a lâmina sobre a palma da mão para verificara espessura de sangue no esfregaço. Através da cor pouco vermelha é indicada a espessura ideal do esfregaço. Quanto mais vermelho ficar, mais espesso e pior é o esfregaço para análise. O P Q R S T U Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 22 1. Sangue sem anticoagulante, onde ocorrerá coagulação e o fibrinogênio plasmático se transformará em fibrina que seqüestra os glóbulos sanguíneos, separando da parte líquida que é o soro. 2. Sangue com anticoagulante, onde a coagulação será bloqueada, obtendo-se sangue total, ou seja, sangue com todas as suas partes, que poderá ser utilizado diretamente ou poderá ser centrifugado para separação dos glóbulos sanguíneos da parte líquida que é o plasma. Dependendo do tipo de anticoagulante utilizado, a amostra servirá para um, ou mais de um, tipo de exame laboratorial. II. a - Tipos de anticoagulantes e suas funções. Existem dois tipos de anticoagulantes: os orgânicos e os inorgânicos salinos. Entre os tipos de anticoagulantes orgânicos, a heparina é que tem sido mais utilizada, tanto em tratamentos clínicos como também na coleta de sangue para exames laboratoriais, como hemogasometria e para bioquímica seca (Reflotron). A heparina tem sua ação anticoagulante bloqueando a trombina que é uma enzima da cascata de coagulação. Os anticoagulantes inorgânicos são salinos e mais numerosos. Os mais usados são: EDTA, fluoreto de sódio e citrato de sódio. Os anticoagulantes salinos bloqueiam a coagulação por se ligarem a todo cálcio livre da amostra (cálcio ionizado). Assim, não sobra cálcio livre para agir como cofator na cascata da coagulação. Cada um desses anticoagulantes tem utilização específica, como descrita a seguir. Nesta apostila, é enfocado o uso do EDTA para amostra sanguínea direcionada ao hemograma, e do citrato de sódio para o coagulograma. No sistema de coleta de sangue a vácuo esses anticoagulantes são identificados pela cor da tampa e podem ser encontradas informações sobre esses produtos em várias páginas na internet, de diferentes fabricantes ou distribuidores de material para laboratório, como: http://www.bd.com/brasil/vacutainer/tubos.asp, http://www.gbo.com/preanalytics-br/por/563.php, http://www.gbo.com/preanalyticsbr/porressource/navigation/1130.php, http://www.labcenter.com.br/catalogo/showfaq.asp?fldAuto=28 Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 23 1. EDTA (Ácido Etileno Diamino Tetracético) é um ácido que dá origem ao sal de sódio ou de potássio que é chamado de sequestrene e tem ação anticoagulante. A identificação do tubo com EDTA, no sistema internacional de coleta a vácuo, é feita através da cor da tampa, que é roxa. É o anticoagulante que menos altera os glóbulos sanguíneos e por isso, é o melhor para realização do hemograma, permitindo que se façam as análises quantitativas até 24 horas depois de colhida a amostra. Essas análises são: o volume globular ou hematócrito, hematimetria, hemoglobinometria e leucometrïa global. Para isso utiliza-se uma gota (aproximadamente 30 microlitros) para até 5mL de sangue, ou seja, nessa proporção todo o cálcio livre na amostra será seqüestrado, tornando-se indisponível a fim de que a cascata de coagulação seja bloqueada. Normalmente, os tubos usados de coleta a vácuo têm capacidade para 5mL, mas a pressão negativa pára de aspirar o sangue com 4,5mL, para que não se tenha o risco de sobrar cálcio livre na amostra e haver coagulação. Apesar de ser o anticoagulante que menos interfere na morfologia dos glóbulos, alguns cuidados devem ser feitos para que a amostra encaminhada para realização do hemograma seja adequada. Esses cuidados são: 1.1. não coletar menos de 2mL de sangue para a gota de EDTA que vem no tudo de 5mL de coleta a vácuo. O EDTA deve ficar diluído no plasma de maneira que não altere muito a concentração de sais em relação ao interior das células. Caso seja necessário coletar menos de 2mL de sangue deve-se abrir o tubo, escorrer a gota de EDTA para fora e, a quantidade residual que permanece nas paredes do tubo é suficiente para impedir a coagulação da amostra de volume inferior a 2mL. Outra opção é a utilização de frascos menores de coleta a vácuo, chamados “pediátricos”, que vem com metade do volume. 1.2. realizar sempre o esfregaço hematológico imediatamente após a coleta de sangue. Esse esfregaço será utilizado para contagem específica de leucócitos e também para observação da morfologia dos glóbulos (hemácias, leucócitos e plaquetas). O EDTA é o A foto ilustra vários tipos de tubos de coleta a vácuo. Os de tampa vermelha não contém anticoagulante e são observados dois tubos de 10mL com dois tipos de tampas: o mais à esquerda com rolha simples e o seguinte com rolha com proteção de respingo de sangue durante a abertura do frasco. O terceiro e o quarto são de 5 mL sem aticoagulante e o quinto tubo de 2,5mL (pediátrico), semelhante ao último da direita, que contém EDTA (rolha lilás). Os demais, são 3 tubos de 5mL com EDTA mostrando diferentes tons de lilás. Foto da autora. Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 24 único anticoagulante que permite a confecção do esfregaço hematológico até duas horas depois de colhido o sangue. 1.3. Manter a amostra de sangue com EDTA sob refrigeração (20C a 80C), até que ela chegue ao laboratório. E o esfregaço sanguíneo fora de refrigeração, ou seja, em temperatura ambiente, mas protegido, como descrito mais adiante, no tópico de confecção de esfregaço. OBSERVAÇÃO: Uma das diferenças mais importantes entre a Patologia Clínica Veterinária e a Patologia Clínica Humana são: o local e o momento em que é feito o esfregaço sanguíneo para realização do hemograma. Em Patologia Clínica Humana, o esfregaço hematológico é feito no laboratório, imediatamente após a coleta do sangue, por um profissional especializado em coleta de sangue. Na Patologia Clínica Veterinária, como a coleta é feita na clínica, que muitas vezes é distante do laboratório, o esfregaço deveria ser feito imediatamente, ou seja, na própria clínica, no máximo até duas horas depois de ter colhido o sangue. E, não deixar para que seja feito no laboratório, pois poderá ter passado muito mais do que duas horas, até que a amostra com EDTA chegue ao laboratório, para ser feito o esfregaço. Esse tem sido um dos principais motivos de erros pré analíticos nos resultados do hemograma e será discutido nas Apostilas de Interpretação do Eritrograma e do Leucograma, onde serão mostrados os tipos de erros na interpretação, decorrentes das alterações morfológicas que podem aparecer nos glóbulos sanguíneos, no esfregaço hematológico feito após duas horas em contato com EDTA. A descrição da confecção do esfregaço sanguíneo é feita mais adiante em um tópico específico. 2. Citrato de Sódio é o anticoagulante que está no tubo de coleta a vácuo identificado com tampa azul e pode estar com concentrações diferentes que variam de 3,2 a 3,8%. É utilizado para amostras de sangue que serão usadas no laboratório para os testes que avaliam a coagulação do sangue. Os cuidados necessários para esse tipo de amostra são: 2.1. Nesse tubo deve ser mantida a proporção de uma parte de anticoagulante para nove de sangue. Para isso, o volume de sangue colhido corresponde a toda capacidade do tubo para que não tenha diluição da amostra no anticoagulante. 2.2. Para realização dos testes de coagulação tem que ser colhido sangue do animal que se quer avaliar e também de outros animais para servir como valor de referência. Essas amostras devem seguir imediatamente para o laboratório, sendo mantidas rigorosamente Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza- Universidade Federal Fluminense 2010 25 refrigeradas (20C a 80C). Por causa disso, muitos profissionais indicam a coleta de sangue para esses exames no próprio laboratório. 2.3. A punção venosa para obtenção dessas amostras com citrato deve ser única, ou seja, não pode haver várias perfurações no mesmo local, pois isso estimula muito a coagulação, prejudicando a realização dos testes. 2.4. não é necessária a confecção do esfregaço, pois esses testes são realizados com o plasma que é separado por centrifugação. Todas essas implicações, da coleta para os exames laboratoriais da coagulação, são discutidas na Apostila de Interpretação do Coagulograma. II. b – Confecção do Esfregaço Hematológico O esfregaço sanguíneo é um material imprescindível para realização do hemograma no laboratório. A leitura da lâmina é descrita na Apostila de Técnicas Manuais para Realização do Hemograma e alguns Exames Complementares. Para que esse esfregaço tenha informações sobre os glóbulos sanguíneos, idênticas àquelas quando estão no sangue do animal, ele deve ser confeccionado imediatamente após a coleta de sangue. O ideal é que seja usado o sangue sem contato com o anticoagulante, porém a coleta a vácuo não deixa resíduos na agulha, só a coleta feita com seringa permite essa manipulação. No entanto, para isso é necessário rapidez na confecção para que o sangue não coagule. O estudo dos efeitos do anticoagulante EDTA sobre o aspecto morfológico dos glóbulos sanguíneos (CARVALHO, et al, 1993), mostra que quanto mais próximo do momento da coleta, menos alterações ocorrem. A experiência com sangue de diferentes espécies tem mostrado que, até duas horas depois de colhido, não são observadas alterações referentes ao aspecto dos glóbulos sanguíneos, desde que a amostra esteja conservada sob refrigeração. A seguir são descritas as etapas para realização do esfregaço. Todas as fotos são da autora. 1) Material necessário – lâminas de microscopia, preferencialmente novas. Caso contrário, devem ser limpas, desengorduradas e mantidas em solução de álcool com éter (meio a meio). Além das lâminas é necessária uma outra lâmina que é a extensora que espalha a gota de sangue. A extensora tem os cantos quebrados para que fique mais estreita do que a outras lâminas. 2) Seqüência da confecção - Colocar uma gota de sangue sobre uma das extremidades da lâmina. Para isso podem ser usados vários métodos. O mais simples é usar o resíduo de sangue que fica na tampa do frasco com sangue: Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 26 Esse método pode ser o mais usado na clínica, pois não requer material exclusivo de laboratório. No entanto, existem frascos cujas tampas não permitem esse procedimento. Um outro método é usar uma pipeta (como por exemplo micropipeta automática) ou um conta gotas descartável (pipeta tipo Pauster) ou microcapilar que aspire o sangue. Também podem ser usados na clínica, mas esse material nem sempre é encontrado na clínica normalmente. 2.1) Com a gota na extremidade da lâmina, coloca a extensora sobre essa gota e espera alguns segundos para que o sangue escorra pela largura da extensora. 2.2) Após escorrer pela largura da extensora, empurrar o sangue em direção oposta a que foi depositada a gota na lamina. Balançar ao ar para secar rapidamente. A secagem deve ser rápida para que as células se desidratarem rápido, ficando fixas em sua morfologia e não encolham durante a secagem. Sangue depositado na extremidade da lâmina usando a tampa do frasco de sangue com EDTA. Sangue depositado na extremidade da lâmina usando a pipeta automática. Sangue depositado na extremidade da lâmina usando microcapilar. Gota de sangue depositado na extremidade da lâmina. Gota de sangue escorrida pela largura da extensora. Após isso a extensora é empurrada levemente para o outro lado da lâmina (sentido da seta). Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 27 2.3) Características do esfregaço Os esfregaços não devem conter muito sangue para que não haja sobreposição dos glóbulos, prejudicando a visualização da morfologia de cada um deles (hemácias, plaquetas e leucócitos). Uma forma de verificar se o esfregaço está espesso é colocá-lo sobre um fundo branco e observar a tonalidade vermelha. Quanto mais vermelho, mais espesso e indesejável está o esfregaço. Outra característica é o comprimento. O esfregaço hematológico para os exames do hemograma deve ter dois terços do comprimento da lâmina para que tenha uma extensão adequada para realização da leucometria específica, que deve ser feita nas regiões medianas de cada borda, como mostrado no esquema a seguir: A terminação em franja é importante para pesquisa de hemocitoparasitas que, embora não faça parte do hemograma, é um exame complementar muito importante em Medicina Veterinária e, por isso, a maioria dos clínicos sempre solicita junto com o pedido de hemograma. 2.4) Identificação - A identificação do esfregaço também é imprescindível, uma vez que ele não é transportado para o laboratório junto com o frasco de sangue com EDTA, pois Esfregaço ainda úmido secando sobre a lamina. Deve ser secado rapidamente balançando a lamina no ar. Nunca soprar, pois causa hemólise e estraga o material. Esfregaços hematológicos prontos para serem corados e analisados. Os esfregaços devem ser confeccionados com a menor quantidade possível de sangue, indicada pela cor vermelha sobre um fundo branco. Nesses exemplos o primeiro da esquerda é o melhor. Além de ter pouco sangue, é longo, ou seja, ocupa dois terços da lamina tem bordas retilíneas e terminação em franja. Todos devem ser identificados ANTES da coloração. Foto da autora. Considerando o esquema em azul como uma lâmina e o vermelho um esfregaço sobre ela, são mostradas as regiões usadas na identificação e na realização da leucometria específica, nas bordas (entre as setas), Hematoscopia (H) e pesquisa de hemocitoparasitas (HP) na terminação em franja. IDENTIFICAÇÃO H LEUCOMETRIA ESPECÍFICA LEUCOMETRIA ESPECÍFICA HP Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 28 não pode ser refrigerado. A lâmina com esfregaço deve ser guardada logo após secar, em frasco próprio para transporte de laminas ou simplesmente embrulhada em papel e protegida para não quebrar. A identificação pode ser feita de várias maneiras, no entanto a melhor delas é escrevendo com lápis de grafite preto sobre o sangue na lamina, em um espaço que não é examinado no microscópio (meio, afastado das bordas). Outros tipos de identificações podem ser feitas, mas muitas delas podem ser manchadas pelo corante, como as etiquetas de papel, ou podem ser apagadas, também por causa do corante, como canetas de escrever no vidro. Algumas dessas alterações na identificação são mostradas no Apostila de Técnicas Manuais para Realização do Hemograma, no item sobre coloração. Por fim, na dúvida, a identificação pode ser feita no pote de transporte para lâminas ou no papel que embrulha os esfregaços e deixar que a identificação seja feita no laboratório, quando cada pacotinho de esfregaço for aberto. 2.5 – Acondicionamento para transporte até o laboratório – O esfregaço não pode ser refrigerado, senão o sangue hemolisa e o material é perdido. Após estar seco e identificado, pode ser embrulhado em papel, protegido de queda ou pressão para não quebrar a lâmina. Pode ser transportado em potes apropriados ou caixas de madeira ou papelão. II. c – Confecção do Esfregaço de Sangue Capilar Para a pesquisa de hemocitoparasitas, o ideal é quese faça um esfregaço de sangue capilar, pois a probabilidade de serem encontrados glóbulos parasitados é maior. Isso porque nos capilares a circulação de células com conteúdo parasitário fica mais lenta, tanto as hemácias para se deformarem e retornar para circulação, como para leucócitos para fazerem leucodiapedese. O esfregaço de sangue capilar deve ser feito da seguinte maneira: Esfregaços identificados com lápis: o primeiro da esquerda apenas com a numeração feita com lápis dermatográfico; os outros dois com lápis de grafite preto. O do meio feito sobre o sangue, no meio do esfregaço, região que não é utilizada para análise no microscópio, como é mostrado no esquema do final do item 2.3 da Seqüência de confecção. No último esfregaço, da direita, a identificação está na parte fosca da lâmina. Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 29 II.c.1) selecionar a região em que vai ser feita a coleta. Essa região é diferente dependendo da espécie. Em pequenos animais o local mais utilizado é a superfície interna da orelha, porque normalmente já tem menos pelos, como é mostrado a seguir, na seqüência de fotos da autora. Em grandes animais é usada a extremidade da cauda, principalmente em bovinos, e em eqüinos pode ser feito tanto na ponta da orelha, como mostrado anteriormente na seqüência de fotos, ou no mento (queixo). II.c.2) limpeza do local com anti-sépticos. Pode ser usado álcool, álcool iodado ou outros. Alguns profissionais utilizam o éter, pois ajuda a desengordurar a pele evitando que o esfregaço fique inadequado. Não deve ser feito tricotomia para evitar qualquer trauma capilar (arranhões). II.c.3) Com uma agulha fazer um arranhão sobre a pele e imediatamente depois, pressionar a região ao redor para que saia um volume de sangue para a confecção do esfregaço. II.c.4) Com ajuda da extensora “raspar” suavemente o sangue da superfície da pele e imediatamente estender o sangue na lamina. Alguns profissionais preferem pegar a gota de sangue sobre a pele usando a própria lamina onde é estendido o sangue. O importante é lembrar que o sangue está coagulando e o procedimento deve ser rápido. A seqüência de fotos a seguir ilustra a coleta de sangue capilar para esfregaço com objetivo de pesquisar hemocitoparasita em pequenos animais. Todas fotos são da autora. Esfregaços confeccionados com excesso de gordura. O sangue não adere na lâmina e as células nessas regiões não podem ser observadas. Em alguns casos, a análise do esfregaço não fica totalmente prejudicada, principalmente quando o esfregaço é longo, ocupando dois terços ou mais da lâmina, como ocorre em alguns dos esfregaços da foto. Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 30 Os detalhes do processamento deste material são mostrados na Apostila de Técnicas Manuais para Realização do Hemograma e alguns Exames Complementares. Com o bisel da agulha de punção venosa é feito um arranhão em um local que não tenha pelos. Anti-sepsia da região (face interna da orelha) para coleta de sangue capilar em um paciente canino de pequeno porte. Com as pontas dos dedos é feita pressão para que sai a um volume de sangue suficiente para realização do esfregaço, antes que haja coagulação. Com a extensora é coletada a gota de sangue, “raspando” a superfície da pele suavemente. Esfregaço confeccionado imediatamente, antes que haja coagulação. Márcia de Souza Xavier & Aline Moreira de Souza - Universidade Federal Fluminense 2010 31 OBRAS CONSULTADAS CARVALHO, M. G.; LIGNANI, C.; OLIVEIRA, J.M. C. & CARVALHO, I. P. – Estudo dos efeitos do anticoagulante EDTA sobre as células sanguíneas em diversos intervalos de tempo. Ver. Brás. Anal. Clín., 25 (4): 101-105, 1993. COLES, H. Veterinary Clinical Pathology. Chap 1, 2, 3, 5 e Appenyx 4th Ed W. B. Saunders Company, Philadelphia 1986. COVILLE, J. Laboratório de Clínica Veterinária In: HENDRIX, C. M. Procedimentos Laboratoriais para técnicos veterinários. Cap 1 4ed, Roca Ed. São Paulo, 2006 FELDMAN, B, F; ZINKL, J, G; JAIN, N, C (Org.) Schalm’s veterinary hematology. 5. ed. 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