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Resumo de engenharia genética (Prova 2) RNA não codificadores: São moléculas de RNA funcional, ou seja, não precisa ser traduzida em proteína para que a informação contida em sua sequência exerça sua função. Eles contêm nas suas moléculas informações variadas que lhes permitem ter diversas funções. Desencadeia o fenômeno de RNA de interferência. #Os genes, os quais encontram-se no DNA, são transcritos em RNAs que são então traduzidos em proteínas. Essas proteínas podem possuir diversas funções estruturais, enzimáticas, etc. Com o sequenciamento do genoma humano foi observado que apenas uma pequena parte do genoma humano (cerca de 1%) é constituído por genes capazes de gerarem RNA codificantes, ou seja, RNA que codificam para proteínas. A outra parte do genoma humano, devido a maior parte de sua função ser desconhecida, ganharam o nome de “DNA-lixo”. Aos poucos diversos estudos demonstraram que esses DNA’s aparentemente sem função eram essenciais para o funcionamento correto da célula, como por exemplo na regulação de genes codificantes). É nessa parte que entra os microRNAs (os quais são pequenas sequências de RNA que são não são traduzidas em proteínas, mas que possuem função na regulação dos RNAs codificantes). #Atualmente, sabe-se que estes pequenos RNAs são bastante conservados, estando presentes na maioria dos organismos eucariotos. Os microRNAs têm uma importante função na diferenciação e manutenção do estado diferenciado dos diversos tipos celulares de um organismo, estando envolvidos em importantes processos celulares como apoptose, angiogênese, metilação do DNA, entre outros. Tipos de RNA não codificadores: RNA ribossômico (rRNA): ajuda o mRNA e o RNA de transferência se unem para formar a cadeia de polipeptídeo. RNA transportador (tRNA): molécula adaptadora que atua como elo entre a sequência de nucleotídeos do mRNA e a sequência de aminoácidos das proteínas; Pequeno RNA nuclear: presente no núcleo de eucariotos, envolvido em vários processos como: splicer de RNAs, regulação de fatores de transcrição, manutenção de telômeros, etc) Pequeno RNA nucleolar (snoRNA): pequenas moléculas responsáveis por guiar modificações em outros RNAs durante a maturação destes (rRNAs, tRNAs, snRNAs) Micro RNA (miRNA): atua na regulação da expressão gênica de eucariotos superiores. Função dos MicroRNA: Os microRNAs desempenham importantes papéis na regulação da tradução, na regulação da expressão gênica, na inibição da tradução de proteínas e na degradação de RNAs mensageiros. Microarrays Os microarrays, também conhecidos como biochips de DNA, são micro arranjos de DNA dispostos em um suporte sólido (geralmente um vidro especial), com tamanho semelhante com uma lâmina de microscópio óptico. Essa tecnologia permite analisar um grande volume de dados simultaneamente, sendo uma técnica poderosa na análise prévia da composição genômica de determinado organismo ou traçar um perfil de expressão gênica deste genoma em determinado momento. # São constituídos de uma lâmina de vidro (geralmente) onde estão aderidos oligonucleotídeos de DNA fita simples de aproximadamente 50 a 70 pb. Cada oligonucleotídeo possui uma seqüência representativa de um determinado gene. Ainda, cada oligonucleotídeo está aderido em um ponto específico do slide (microarray), conhecido como spot. *Uma único slide pode conter dezenas ou até centenas de milhares de spots, cobrindo assim um determinado genoma inteiro. Para a sua construção, o genoma de interesse é primeiramente seqüenciado e então um oligonucleotídeo de DNA fita simples de cada gene é representado no microarray. #O processo de construção do biochip é todo robotizado e requer uma estrutura complexa para a sua execução. Os oligonucleotídeos podem ser impressos (aderidos) no biochip ou sintetizados diretamente sobre ele. O laboratório que deseja trabalhar com esta técnica não necessita possuir toda a estrutura para a construção do biochip, pois há empresas especializadas que fornecem o microarray. Objetivos da técnica: A principal aplicação desta tecnologia está no estudo de perfis de expressão gênica de todos os genes de determinado genoma. Outra aplicação é no mapeamento genômico de genomas relacionados com o genoma de referência (representado no biochip). No primeiro caso utiliza-se o mRNA e no último caso o DNA genômico. Em estudos de expressão gênica, a maior vantagem, é que é possível em um único experimento, mensurar a expressão de milhares de genes simultaneamente. #Quando se deseja analisar a expressão de apenas alguns genes, a técnica de real-time PCR é geralmente empregada, que consegue analisar a expressão de até 4 genes simultaneamente. Quando se deseja analisar o perfil da expressão gênica no nível de genoma, esta técnica é tecnicamente inviável, já que, por exemplo, para um genoma bacteriano de 4 mil genes, seriam necessários 1000 análises. Esta tecnologia usa o princípio da complementaridade de bases dos ácidos nucléicos. Essencialmente, microarray é uma técnica de hibridização de ácidos nucléicos em grande escala. Como funciona: Primeiramente, é feita a extração do mRNA nas condições do estudo. Em qualquer experimento, sempre será utilizado material genético de duas situações distintas, onde uma será a amostra controle e a outra a amostra experimento. No momento de coletar a amostra de células para a extração do mRNA, as mesmas devem ser imediatamente colocadas em temperaturas de congelamento, para evitar que enzimas RNAses degradem parcialmente o RNA, comprometendo seriamente a confiabilidade dos resultados. Após a extração do mRNA conforme protocolo específico para cada caso, é realizada uma RT-PCR, obtendo como produto final de interesse o cDNA. As amostras de cDNA são coradas com compostos fluorescentes, geralmente as cianinas Cy3 e Cy5, sendo que uma amostra é corada com Cy3 e a outra com Cy5. Este cDNA corado é então desnaturado por aquecimento e hibridizado com o biochip. Quando a solução contendo o cDNA corado for colocado sobre a lâmina de microarray, ocorrerá a hibridização entre este cDNA e o DNA do biochip, pelo princípio da complementaridade das bases de DNA. Após a hibridização o biochip é colocado em um scanner especial, que irá fazer a leitura da intensidade da fluorescência nos comprimentos de onda referente aos 2 compostos fluorescentes utilizados. Cy3 emite a cor verde, e Cy5 a cor vermelha. É fácil deduzir que quando um determinado gene é expresso em ambas as amostras, o spot correspondente no microarray irá hibridizar com ambos os mRNAs. Como conseqüência, este spot emitirá tanto a cor verde como a cor vermelha, resultando na cor amarela. Durante a leitura o scanner digitaliza a imagem em alta resolução, para análise posterior. As imagens digitalizadas são então analisadas por um software específico que irá converter a cor e a intensidade da fluorescência em um conjunto de valores numéricos. Os arquivos resultantes (valores numéricos) são analisados posteriormente em outros softwares onde os dados são filtrados e tratados estatisticamente. Etapas do procedimentos: 1- Coleção das amostras 2- Isolamento do mRNA 3- Criação do cDNA etiquetado 4- Hibridização Tipos de Microarrays: a. Microarrays do cDNA: usa as costas complementares do DNA formadas pela transcrição do mRNA b. Microarrays Oligo do ADN: os usos sintetizaram quimicamente o DNA oligo como pontas de prova c. Microarrays do CCB: usa o molde amplificado pela reacção em cadeia da polimerase como a ponta de prova d. Microarrays de SNP: usado para detectar polimorfismo dentro de uma população Aplicações: Para estudar transcriptomes e proteomes; para diagnosticardoenças patogênicas assim como genéticas no homem; para detectar a expressão genética dos mRNA de uma pilha particular em horas diferentes; para estudar ganhos e perdas genômicas; para medir mudanças no nível de expressão genética. #A análise cromossômica por microarray permite detectar alterações genéticas em todos os cromossomos simultaneamente, possui sensibilidade e especificidade significativamente maiores que os exames de citogenética. Limitações da técnica: demora para análise dos resultados recolhidos; os resultados são de complexa interpretação e nem sempre são quantitativos; tecnologia cara; os resultados não são sempre reprodutíveis; Organismos geneticamente modificados Vantagens: Tolerância a herbicidas – aumento de produtividade #As plantas podem ser modificadas de modo a terem no seu DNA um gene que lhe confira resistência a produtos químicos como os pesticidas e os inseticidas. Com isto o agricultor vão puder usar as quantidades de químicos desejadas para acabar com as pragas e assim obter um maior aumento de produto no final de cada época. Tolerância a insetos – redução dos químicos utilizados # As culturas transgênicas podem ser munidas de genes que lhes confiram resistência ás suas pragas naturais, produzindo toxinas que matam essas pragas. Com isto, é desnecessário o uso de químicos como os pesticidas na agricultura, uma vez que a própria planta se “protege sozinha”, contribuindo assim para reduzir a poluição ambiental Redução do uso de fertilizantes # Alguns frutos e nozes são munidos de genes capazes de os fazer aumentar o seu tamanho naturalmente sem precisarem de ser utilizados fertilizantes e outros químicos nas culturas para os tornarem maiores e mais apetecíveis. Clonagem # Através da técnica de DNA recombinante é possível introduzir nas bactérias genes com determinadas funções (genes de interesse). As bactérias ao reproduzirem-se formam descendentes exatamente iguais entre si, como se fosse um clone, assim fazem copias desse gene, sendo este processo chamado de Clonagem. Produção de medicamentos # Tal como na clonagem, através de técnicas de DNA recombinante é possível fazer com que as bactérias passem a produzir determinadas substâncias através da inserção de genes de interesse benéficas para a saúde, e assim produzir medicamentos com base nessas substâncias produzidas. Desvantagens: Redução da Biodiversidade # A existência de plantas resistentes a produtos químicos provoca uma redução dos predadores naturais dessa planta, afetando assim os níveis seguintes da cadeia alimentar, como os pássaros que necessitam dos insetos para se alimentarem, e ainda pode provocar uma dificuldade em existir predadores naturais para essa mesma planta. Em consequência destes acontecimentos vai haver a possibilidade de criar efeitos nocivos nos insetos que não são pragas importantes a agricultura e induzir um rápido crescimento de insetos resistentes (seleção natural). Poluição genética #Não é possível separar culturas convencionais das transgênicas, pois os grãos de pólen percorrem distâncias na ordem dos 180 Km por dia, sendo possível haver uma disseminação dos grãos de pólen das plantas transgênicas para as plantas naturais, ou seja, vai haver uma “contaminação” pelo ar das plantas naturais pelas plantas modificadas, convertendo assim estas plantas em “cópias” daquelas que haviam sido geneticamente modificadas, convertendo todas as plantas atingidas em plantas com as mesmas características das transgênicas, alterando assim também a biodiversidade. Aumento das alergias # Há possibilidade de desenvolvimento de alergias a produtos transgênicos. A criação de proteínas sintetizadas pelos novos genes nos transgênicos pode ter um potencial alérgico ao nosso organismo e são postos à venda nos supermercados muitos produtos com substâncias transgênicas cujo potencial alérgico ainda não foi testado. Perigo para a Saúde Pública #O excesso de produtos químicos que advêm da utilização de organismos geneticamente modificados na agricultura, não tem apenas um impacto negativo no ambiente, mas também um risco para saúde pública. Se considerarmos que os alimentos provenientes de campos transgênicos são excessivamente irrigados com pesticidas e herbicidas, esses mesmos produtos químicos vão chegar a nossa mesa, mesmo em ínfimas quantidades, nos alimentos. Os especialistas dizem que a quantidade de químicos que tem possibilidade de chegar a nossas casas é “banal” para provocar algum tipo de impacto a nível da saúde, mas de certo que bem também não faz. Terapia gênica Terapia gênica é a transferência de material genético com o propósito de prevenir ou curar uma enfermidade qualquer. No caso das enfermidades genéticas, nas quais um gene está defeituoso ou ausente, a terapia gênica consiste em transferir a versão funcional do gene para o organismo portador da doença, de modo a reparar o efeito. #A terapia genética abre perspetivas excitantes como alternativa à terapêutica convencional, possibilitando potencialmente a solução para algumas das doenças hereditárias e adquiridas que acarretam graves consequências ao indivíduo, ou também em doenças adquiridas onde a adição de uma sequência ou gene permite acrescentar uma função não existente naturalmente no organismo, mas que pode desempenhar uma função importante. A terapia genética tem como principal objetivo, através da utilização de técnicas de DNA recombinante, atacar a doença na sua origem, ou seja, na sua base genética, de forma a curar ou corrigir uma condição causada por um alelo mutante, através da introdução de uma sequência de DNA, codificante ou não, como forma de tratamento farmacológico. Para isso, os genes funcionais têm que ser identificados numa biblioteca de DNA genómico ou de DNA complementar (cDNA), isolados e clonados. Seguidamente, o gene desejado é introduzido num vetor específico para que ocorra o transporte do gene até à célula de interesse. #O local onde irá ocorrer a transferência genética, o tecido alvo, assim como o facto de se pretender efetuar essa transferência in vivo ou ex vivo vão ser determinantes na escolha do vetor e do método mais adequado. Os procedimentos de transferência do DNA in vivo ou em ex-vivo têm o mesmo propósito: o gene deve ser transferido para dentro das células, e uma vez inserido tem que resistir bastante tempo. Neste tempo, o gene tem que produzir grandes quantidades de proteína para reparar o defeito genético. Essas características podem ser resumidas em um único conceito: o gene estranho precisa se expressar de modo efetivo no organismo que o receberá. #O sistema mais simples, de injetar o DNA diretamente nas células ou nos tecidos do organismo a ser tratado, é bastante ineficaz (o DNA desnudo quase não apresenta efeito nas células). As recentes técnicas de transferência de material genético implicam o uso de vetores, para transportar o DNA as células hospedeiras. Vetores virais: Retrovírus: possuem a habilidade de integrar o seu DNA dento dos cromossomos da célula infectada. Eles infectam somente células que estão se proliferando. Lentivírus: permitem transferir material genético para células que não se proliferam (como neurônios e células do fígado) ou para células refratárias para o retrovírus (como as células retiradas da medula óssea) Adenossociados: Integram o DNA ao cromossomo da célula hospedeira. Eles têm a vantagem de serem inofensivos para a natureza m relação aos retrovírus, mas não são capazes de transportar genes de grandes dimensões. Adenovírus: Integram o DNA ao cromossomo da célula hospedeira. Transportam genes de grandes dimensões,mas a expressão deles não duram muito tempo. Vetores não-virais: Lipossomos: as esferas de lipídeos podem seu um importante meio para terapia gênica. Em comparação aos vírus, eles têm a vantagem de não introduzir algum risco em condições de segurança, mas eles não possuem grande eficiência e são muito seletivos. Limites da terapia gênica: eficiência da transferência (procura de vetores que possam transferir o material genética de modo eficiente); duração da expressão (expressão do gene estranho não é mantida por muito tempo – deve-se procurar uma expressão duradoura); a segurança do procedimento; a reação imunitária. Sistema CRISPR/Cas 9 #Na edição genética, existem 4 grandes grupos de proteínas que ligam ao DNA. As meganucleases (provenientes de elementos genéticos móveis microbianos), as nucleases (ZFN), as transcription activator-like effectores (TALENs) [provenientes da bactéria Xanthomonas], e mais recentemente a endonuclease Cas9 do sistema imunitário adaptativo de algumas bactérias como S. pyogenes. O sistema CRISPR/Cas 9 do tipo II é um mecanismo de defesa das bactérias e Archaea contra elementos genéticos invasores como fagos e plasmídeos de DNA. A memória imunitária surge após o DNA ser cortado em pequenos fragmentos e incorporado no CRISPR locus, passando a designar-se como protoespaçador. #CRISPR locus: pequenos fragmentos de RNA com capacidade de desempenhar o reconhecimento de um DNA exógeno específico e atuar como um guia de modo a orientar a nuclease Cas). #Processo: O locus é transcrito numa cadeia percurssora de RNA ñ codificante (pre-crRNA) As cadeias repetidas do pre-crRNA sofrem hibridização com um segundo RNA não codificante, o trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA). Forma-se uma cadeia dupla de RNA que é clivada e processada pela host factor ribonuclease (RNase). A forma duplex de crRNA-tracrRNA associa-se com a nuclease Cas9 e forma um complexo responsável pelo reconhecimento e destruição do DNA invasor in vitro e nas células procariotas. Esta estrutura formada, que possui crRNA co o espaçador, tem especificidade para uma sequência alvo, ligando-se por complementariedade e arrastando consigo a nucleasse Cas9. O seu domínio HNH (que corta o DNA de cadeia simples) cliva a cadeia complementar e o domínio RuvC a cadeia não complementar, provocando um duplo corte na dupla cadeia de DNA. #Isso acontece caso a sequência alvo se encontre na região adjacente a uma pequena sequência conhecida como protospacer adjacent motif (PAM). #O passo chave na edição do genoma de um organismo é uma segmentação seletiva de uma sequência específica de DNA. Duas macromoléculas biológicas, a proteína Cas9 e o RNA guia, interagem para formar um complexo que pode identificar sequências alvo com alta seletividade. A proteína Cas9 é responsável pela localização e clivagem do DNA-alvo, tanto em sistemas CRISPR / Cas naturais quanto artificiais. A proteína Cas9 tem seis domínios, REC I, REC II, Bridge Helix, PAM Interacting, HNH e RuvC #O domínio Rec I é o maior e é responsável pelo guia RNA de ligação . O papel do domínio REC II ainda não é bem compreendido. A hélice de ponte rica em arginina é crucial para iniciar a atividade de clivagem após a ligação do DNA alvo. O domínio PAM-Interacting confere especificidade PAM e, portanto, é responsável por iniciar a ligação ao DNA alvo. Os domínios HNH e RuvC são domínios de nuclease que cortam o DNA de cadeia simples. Eles são altamente homólogos aos domínios HNH e RuvC encontrados em outras proteínas; Nos sistemas CRISPR de engenharia, o RNA guia é composto por uma única cadeia de RNA que forma uma forma de T composta de um tetraloop e dois ou três trilhos de caule. O RNA guia é projetado para ter uma extremidade 5' que é complementar à sequência de DNA alvo. Este RNA guia artificial liga-se à proteína Cas9 e, após a ligação, induz uma mudança conformacional na proteína. A mudança conformacional converte a proteína inativa em sua forma ativa. Uma vez que a proteína Cas9 é ativada, ela pesquisa o DNA alvo por ligação com sequências que combinam sua sequência de motivos adjacentes protospacer (PAM). Um PAM é uma sequência de duas ou três bases localizada dentro de um nucleótido a jusante da região complementar ao RNA guia. Os PAMs foram identificados em todos os sistemas CRISPR, e os nucleótidos específicos que definem PAMs são específicos da categoria particular do sistema CRISPR. Quando a proteína Cas9 encontra uma sequência alvo potencial com o PAM apropriado, a proteína irá derreter as bases imediatamente a montante do PAM e emparelhando-as com a região complementar no RNA guia. Se a região complementar e a região alvo parem adequadamente, os domínios de nuclease RuvC e HNH cortarão o DNA alvo após a terceira base de nucleótidos a montante do PAM. Como transportar o sistema CRISPR/Cas9 até as células alvo: O transporte do sistema CRISPR Cas9 continua a ser um desafio constante para a engenharia genética. Apesar de todas as limitações existentes destacam-se três potentes métodos de transporte Cas9 e gRNA até às células alvo. Plasmídeos Vantagem: fácil produção in vitro; Desvatagem: baixa eficiência de entrega. Vetores virais tem a capacidade de integrar um fragmento de DNA exógeno no material genético da célula alvo de forma aleatória, o que pode gerar inserções indesejadas. #Para contornar esse problema recorre-se a vetores virais não-integrativos, como os adenovírus e vírus adeno-associados. Vatangens: grande capacidade de ser clonado e transduzidos em linhas celulares, facilidade de produção. Resultados recentes sugerem que a escolha de vetor viral mais adequado recai no uso de adeno-associados em que a Cas9 é proveniente da bactéria S. aureus. Ribonucleoproteínas: Método alternativo aos plasmídeos e vetores virais [plasmídeos e vetores virais enfrentam elevadas taxas de mutações off-target (alterações na sequência)]. O uso de RNPs evita a possibilidade de integrações de DNA não desejadas. Vantagens da técnica: Simplicidade no desenho do alvo Técnica eficiente Mutações podem ser introduzidas em múltiplos genes ao mesmo tempo Desvantagens: Introdução de mutações a loci não específicos homólogos semelhantes, mas não idênticos, aos sítios alvo. RNA de interferência A interferência por RNA (RNAi) é um mecanismo de silenciamento gênico pós-transcricional conservado durante a evolução. Esse mecanismo é mediado por pequenos RNAs de fita dupla (dsRNAs) capazes de reconhecer especificamente uma sequência de mRNA-alvo e mediar sua clivagem ou repressão traducional. O emprego da RNAi como uma ferramenta de terapia gênica tem sido muito estudado, especialmente em infecções virais, câncer, desordens genéticas herdadas, doenças cardiovasculares e mesmo em doenças reumáticas. Aliados aos dados do genoma humano, os conhecimentos do silenciamento gênico mediado por RNAi podem permitir a determinação funcional de praticamente qualquer gene expresso em uma célula e sua implicação para o funcionamento e homeostase celular. #A produção de RNAi é um processo biológico que está presente em diferentes espécies (desde os animais invertebrados aos vertebrados e as plantas) e por esse motivo diz-se que está evolutivamente conservado. #Esse mecanismo atua sobre o RNA mensageiro (mRNA), ou seja, é esse mecanismo que determinará o fim da vida útil do mRNA para que não sejam produzidas proteínas além do necessário. Como funciona: Envolvida neste mecanismo está uma molécula de fita dupla de RNA (dsRNA - double stranded RNA) que, ao ser incorporada na forma ativa a um complexo no citoplasma, se liga a umasequência de nucleotídeos complementar localizada no mRNA-alvo, ocasionando assim o silenciamento, por inibição da tradução e/ou degradação do mRNA. O processo de interferência de RNA, que leva à clivagem de um mRNA específico ou ao bloqueio da síntese de proteínas a partir deste mRNA, pode começar: Pela injeção de uma RNA fita dupla (dsRNA) Pela síntese de um RNA que forme um longo grampo ( a partir da transcrição de um trecho de DNA genômico ou de um transgene, engenheirado para isso e inserido no genoma do organismo) Pela síntese de um RNA de interferência, que será clivado pela enzima “Drosha” no núcleo, gerando um grampo que será, no citoplasma, clivado de novo pela enzima Dicer. Quando gera-se um RNA fita dupla no citoplasma (por qualquer um dos três mecanismos acima), as enzimas Dicer vão cortá-lo em pelo menos um fragmento de 21 pb. Os pequenos fragmentos de dsRNA são então carregados num complexo enzimático formado pela enzima Argonauta e algumas outras enzimas, como uma helicase e uma enzima com domínio ligador de dsRNA, chamada R2D2. Uma das subunidades leva embora uma das fitas de RNA e a outra (em geral a complementar ao mRNA alvo da futura clivagem), fica. Há um mecanismo de instabilidade da região 5’ do dsRNA que favorece a permanência da fita complementar no complexo. O passo seguinte do caminho para a interferência é o pareamento entre o RNA fita simples contido na Argonauta e o mRNA alvo. A probabilidade de um pareamento errôneo é muito remota, já que é preciso que haja o pareamento exato de pelo menos 19 das bases. Assim que o pareamento for feito, duas coisas podem ocorrer: Se o mRNA não estiver sendo traduzido, ele será clivado; Se o mRNA estiver sendo traduzido, o Argonauta se liga a ele e leva a um bloqueio da tradução. #Em ambos os casos não vai haver mais a síntese de proteínas a partir do mRNA-alvo. Múltiplas vantagens: A principal delas é que, em princípio, a produção de qualquer proteína pode ser inibida pela administração de siRNA. Além disso, diferentemente dos fármacos convencionais, o siRNA é específico, ou seja, gera somente o bloqueio da produção da proteína de interesse, não afetando a síntese de proteínas com estruturas moleculares semelhantes, o que reduz possíveis efeitos adversos. Seu uso também é mais efetivo, pois uma única molécula de siRNA pode silenciar várias cópias de RNAm, responsável pela produção de várias moléculas da proteína. O siRNA é uma molécula de fácil síntese e suas características físico-químicas não mudam, apesar de suas variações para atingir alvos distintos (isso facilita o desenvolvimento de sistemas para liberação da molécula no organismo para sua aplicação clínica). #O tratamento com RNAi também é vantajoso quando comparado à terapia com DNA, porque o siRNA é uma molécula menor do que o DNA, o que facilita sua entrada nas células, e não precisa ultrapassar a barreira do núcleo para agir. Aplicações: O RNAi pode vir a ser uma alternativa aos inseticidas químicos no controle de insetos e doenças. O RNA interferência como um processo para diminuir ou desligar a expressão de certos genes, que suprimem a produção de uma proteína específica em um organismo. No caso de pragas, RNAi poderia desligar proteínas relacionadas ao metabolismo ou na reprodução, matando ou impedido que os insetos-alvo reproduzam-se. Emprego na terapia gênica (infecções virais, câncer, desordens genéticas herdadas, doenças cardiovasculares e mesmo em doenças reumáticas). Prática: Extração plasmidial O processo de extração do DNA genômico difere do processo de extração do plasmídeo, onde na técnica de extração do DNA genômico todo o material genético da célula é extraído, tendo como produto final o DNA genômico e o DNA plasmidial. Existem inúmeros métodos para a extração de DNA, os quais geralmente envolvem a ruptura e lise da célula. Após a liberação do DNA no meio, as proteínas devem ser removidas deste, e o método mais utilizado para este procedimento é a extração com fenol e clorofórmio, que provoca a desnaturação das proteínas presentes na amostra de maneira eficiente, diminuindo a interação destas com a água. A extração do DNA genômico pode ser dividida em quatro estágios: 1) ruptura da célula, 2) lise da célula, 3) remoção de proteínas e contaminantes, e 4) recuperação do DNA. Para extração de DNA plasmidial, podem ser utilizados dois procedimentos diferentes: lise alcalina e método de “boiling”. O método mais utilizado para o isolamento e purificação do DNA plasmidial é o da lise alcalina. Esse método é muito robusto e apresenta bons resultados qualitativos e quantitativos sob diversas condições. O método de isolamento por lise alcalina baseia-se na diferença em desnaturação, em condições alcalinas (pH~12), entre o DNA plasmidial circular e o cromossômico de alto peso molecular. #O método de lise alcalina é o método da rotina mais popular, é simples, de baixo custo relativo, reprodutível. A combinação de alto pH e um detergente fortemente iônico (SDS) rompe a célula, desnatura o DNA cromossomal e proteínas e libera o plasmídeo no sobrenadante. O método de “boiling” possui como principal vantagem a velocidade com a qual o DNA é obtido, sendo muito mais rápido do que o observado no método por lise alcalina. Entretanto, este método se mostra menos eficiente quando comparado à lise alcalina, pois produz uma quantidade inferior de DNA plasmidial. Este método baseia-se na lise celular através de um detergente não-iônico e calor. Eletroforese Esta técnica é utilizada para a visualização dos fragmentos de DNA, após este ser extraído. A eletroforese em géis de agarose (mais utilizado) ou poliacrilamida é utilizada para separar, identificar e isolar os fragmentos de DNA a partir da influência de um campo elétrico aplicado. Como os fragmentos de DNA possuem aproximadamente a mesma carga é necessária a utilização de um meio viscoso para que este seja separado por tamanho, por isso utiliza-se estes géis, os quais formam uma malha, que possibilita a separação de fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho. Por possuir carga negativa, o DNA é sempre aplicado do lado do pólo negativo no gel. Isso possibilita a corrida para o pólo positivo. A migração da molécula de DNA depende de diversos fatores: 1) tamanho da molécula – quanto maior a molécula, maior o coeficiente de atrito desta, sendo assim a sua migração no gel será mais lenta. 2) conformação do DNA – o DNA em forma de super- hélice circular ou na forma circular possui a velocidade de migração mais elevada; por isso as moléculas de DNA são clivadas, para que todas estejam na forma linear, a fim de se obter um padrão. 3) concentração da agarose – a concentração do gel (0,8% - 1,0%) deixará o gel mais ou menos viscoso, isso possibilitará que um mesmo fragmento de DNA tenha uma maior velocidade de migração (gel menos viscoso, possui um menor coeficiente de atrito) ou uma menor velocidade de migração (gel mais viscoso, possui um maior coeficiente de atrito e facilita a separação de fragmentos menores). Reagentes utilizados em P2 NaCl: Na extração do DNA é importante o uso de um sal, para proporcionar ao DNA um ambiente favorável, o NaCl contribui com íons positivos e íons negativos, sendo o caso, que os positivos possuem a função de neutralizar a carga negativa d o DNA, e as cargas negativas tem como função neutralizar as histonas, permitindo o acoplamento de DNA + Histonas, além da função de neutralizar as cargas, o NaCl também participa na dissociação das proteínas associadas aos ácidos nucleicos, e também o sal aumenta a densidade do meio, facilitandoa migração do DNA para o álcool SDS: É conhecido como um detergente sódio dodecil sulfato, determinado como agente que solubilizada lipídeos, no entanto tem como principal função desnaturar as proteínas da membrana, separando-as do DNA cromossômico, também participa no rompimento das ligações não -covalentes, além de realizar o rompimento e a desnaturação o SDS certifica que não há nenhuma nucleasse que não depende de Mg2, cause qualquer tipo de degradação.
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