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AVALIAÇÃO DE METODOLOGIAS PARA IDENTIFICAÇÃO DE SÊMEN EM AMOSTRAS DE INTERESSE FORENSE RELACIONADAS A CRIMES SEXUAIS
Carolina Oliveira Prado¹; Lorrayne Christine Alves Pereira¹; Raissa de Oliveira Silva¹; Solange da Silva¹; Pablo Alves Marinho²
¹ Graduandas de Biomedicina do Centro Universitário Una, Belo Horizonte-MG
² Instituto de Criminalística de Minas Gerais, Belo Horizonte-MG
EVALUATION OF METHODOLOGIES FOR SEMEN IDENTIFICATION IN SAMPLES OF FORENSIC INTEREST RELATED TO SEXUAL CRIME
RESUMO
Nos crimes de violência sexual mesmo havendo a presença de provas testemunhais os suspeitos podem não serem processados por falta de provas materiais, como a confirmação da presença de sêmen do agressor, identificado pelos testes para pesquisada do antígeno prostático específico (PSA), espermatozoide, seminogelina, fosfatase ácida prostática (FA). O objetivo do trabalho foi realizar uma revisão da literatura, a fim de avaliar as metodologias para identificar sêmen em amostras de interesse forense. Em relação à luz forense, o comprimento de onda mais utilizado para esta finalidade é o 495 nm conjuntamente com os filtros laranja e amarelo, porém é necessário o uso de outra metodologia para confirmação da presença de sêmen. O PSA e a semenogelina estão presentes no líquido seminal e existem testes rápidos para identificação dessas proteínas, sendo empregado a imucromatografia na rotina dos Peritos Criminais. Já a pesquisa da FA necessita de uma análise mais complexa, sendo utilizada exclusivamente no ambiente laboratorial. A microscopia de espermatozoides é utilizada para o rastreio de espermatozoides, tendo papel confirmatório sobre a prática da relação sexual. Dessa forma, conclui-se que os métodos utilizados para a pesquisa de vestígios de crimes sexuais são complementares, pois cada um apresenta suas limitações técnicas e analíticas, não podendo ser interpretados fora do contexto da prática delituosa. 
Palavras-chave: Crimes sexuais; PSA; Seminogelina; Luz forense; Fosfatase Ácida Prostática.
ABSTRACT
In cases of sexual violence, even if witnesses are present, suspects may not be prosecuted for lack of material evidence, such as confirmation of the presence of the offender's semen, identified by tests for prostate specific antigen (PSA), spermatozoa, seminogelin, prostatic acid phosphatase (FA). The objective of the study was to carry out a review of the literature in order to evaluate the methodologies to identify semen in samples of forensic interest. In relation to forensic light, the wavelength most used for this purpose is 495 nm in conjunction with the orange and yellow filters, but it is necessary to use another methodology to confirm the presence of semen. PSA and semenogelin are present in the seminal fluid and there are rapid tests for the identification of these proteins, and the use of immo-chromatography in the Criminal Experts routine is used. The FA research, however, requires a more complex analysis, being used exclusively in the laboratory environment. Sperm microscopy is used for the screening of spermatozoa, having a confirmatory role on the practice of sexual intercourse. Thus, it is concluded that the methods used to search for traces of sexual crimes are complementary, since each presents its technical and analytical limitations, and can not be interpreted outside the context of criminal practice.
Keywords: Sexual crimes; PSA; Seminogelin; Forensic light; Prostatic Acid Phosphatase.
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1. INTRODUÇÃO
 Os crimes de violência sexual no Brasil geralmente não são testemunhados e os suspeitos não são processados devido à ausência de provas materiais. A presença do sêmen realizada em análises laboratoriais pode ser uma prova de que houve agressão sexual, porém não confirma se o suspeito foi ou não realmente o agressor [18]. 
 A falta de informação quanto a necessidade de procurar medidas de profilaxias para evitar patologias decorrentes da agressão, além de que poucas vítimas procuram a delegacia, por causa das consequências psicológicas e a possibilidade de estigmatização por parte da sociedade, fazem com que os índices de denúncia, e, consequentemente, apuração destes delitos, sejam baixos no Brasil [6].
 O Instituto de Pesquisa Econômica Aplicada estima que, em 2013, 0,26% da população brasileira sofreu algum tipo de violência sexual, representando 527 mil casos, dos quais apenas 10% teriam sido reportados à Polícia [10]. Estes dados corroboram com o 11° Anuário de Segurança Pública do Brasil que apontou que, em 2016, 49.497 pessoas foram estupradas no Brasil [2]. Segundo o Sistema de Informação de Agravos de Notificação do Ministério da Saúde (SINAN) 70% das vítimas de crimes sexuais, entre 2011 a 2014, eram crianças e adolescentes [4]. 
 De antes deste quadro estatístico alarmante, é de extrema importância identificar a presença de sêmen no corpo ou no vestuário da vítima que sofreu a violência sexual, devendo esta coleta ser realizada o quanto antes para preservação da amostra. Para isto, é necessário utilizar ensaios para a pesquisa de PSA, seminogelina, fosfatase ácida prostática, espermatozoide, podendo também ser utilizada a luz forense em casos de vestes [8]. Porém, nota-se que há falta de dados científicos comparativos sobre a eficácia de cada um destes ensaios. 
 Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi avaliar os métodos analíticos para identificação de marcadores de sêmen em amostras forenses, relatando a metodologia de cada ensaio e discutindo suas vantagens, desvantagens e limitações.
2. MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE SÊMEN
2.1 Luz Forense
A Luz Forense é utilizada na detecção de fluidos biológicos em casos forenses e locais de crime de agressão sexual. O equipamento é constituído de uma fonte de luz com diversos filtros, podendo irradiar diferentes comprimentos de onda, desde o ultravioleta até o visível (200 a 750 nm). Segundo Fiedler et al. (2008) sua utilização baseia-se na incidência de luz em diversos comprimentos de ondas para análises de superfícies onde há suspeita de algum delito. É um equipamento portátil, que possui bateria recarregável e um conjunto de óculos (nas cores amarelo laranja, vermelho e transparente). Os óculos são utilizados para a melhoria da visualização do vestígio, por bloquear a fluorescência do suporte impregnado com a amostra e destacar o vestígio examinado. [5-12].
 A detecção dos fluidos biológicos baseia-se na incidência da luz forense no suposto local de forma que conduzirá a uma fluorescência na amostra. O componente fosforescente que emite a luz é o fósforo. Segundo Fiedler et al., (2008), os fluidos corporais que contêm fósforo na sua composição são:  sêmen, sangue, saliva e fluidos vaginais. A tabela 1 mostra os tipos de fluidos corporais e os comprimentos de onda utilizados, bem como os óculos adequados para a visualização dos diferentes fluidos corporais.
	Amostra
	(nm)
	Cor dos óculos (filtro)
	Fluidos vaginais
	430 nm
	Amarelo
Laranja
	Saliva
	395nm
	Transparente
	Sangue
	395nm
	Transparente
	Sêmen
	455 nm
	Transparente/amarelo/
laranja
Tabela 1: Amostra analisadas por luz forense.
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
Fonte: FIEDLER et al.,2008 
 Os diferentes comprimentos de onda da luz e cores dos óculos trazem visualizações diferentes. A seguir, é apresentado um tecido branco contendo sêmen onde foi utilizado diferentes comprimentos de onda e o óculos de cor laranja para visualização do fluido biológico (Figura 1 e 2). 
Figura 1: Amostra de sêmen em tecido sem emprego da luz forense. 
 Figura 2: Uso da luz forense no tecido branco contendo sêmen. A: Luz 445 nm e filtro laranja, B: Luz 445 nm e filtro amarelo, C: Luz 455 nm e filtro vermelho, D: Luz 590 nm e filtro laranja, E: Luz 625 nm e filtro laranja, F: Luz 505 nm e filtro laranja. 
 As figuras 2A e 2B demonstram uma melhor visualizaçãoquando se utilizou a luz de 455 nm e óculos laranja e amarelo respectivamente. Na figura 2C utilizou-se luz de 455 nm e filtro vermelho, não sendo possível a visualização nítida da mancha no tecido. Já nas figuras 2D e 2E, utilizou-se luz em 590 nm e 625 nn respectivamente com o óculos laranja, não sendo possível a visualização da mancha. Na figura 2F utilizou-se luz no comprimento de onda 505 nm e óculos laranja, também não sendo visível a mancha de forma nítida. Assim, a utilização do comprimento de onda e o tipo de óculos adequados são fundamentais para uma correta visualização do vestígio biológico. 
A complexidade da utilização da luz forense para detecção de sêmen é que a técnica pode fornecer resultados similares com outros tipos de fluidos biológicos. A urina, por exemplo, possui resultado similar ao do sêmen (Figura 3), não sendo possível a diferenciação. 
 Figura 3: Tecido com amostra de urina submetido à luz forense A: Luz 455 nm e filtro laranja. B: Luz 455 nm e filtro laranja.
No entanto, é um método rápido, de fácil execução e não destrutivo. De acordo com Magalhães et al. (2015) a vantagem do uso de tecidos têxteis na detecção de fluidos biológicos é que são menos propensos a serem removidos em comparação com os fluidos corporais na pele. Com isso a identificação pode ser realizada em um intervalo de tempo mais longo. Essa técnica tem grande aplicabilidade quando a localização dos vestígios biológicos é desconhecida e a área a ser pesquisada é muito ampla [14].
 
2.2 Pesquisa de PSA 
 O antígeno específico da próstata (PSA), conhecido também como p30, é uma glicoproteína sintetizada no epitélio prostático e excretada no fluido seminal, com função principal de liquefação da amostra [3].
 De acordo Sawaya et al., (2004) nos fluidos biológicos provindos de manchas de sêmen em tecidos têxteis são encontrados níveis de PSA inferiores que 4 ng/mL. O PSA é considerado um marcador importante para constatação de sêmen, pois já foi testado e validado pela comunidade forense, em casos de crimes sexuais. Atualmente, o PSA é utilizado nos laboratórios forenses para teste rápido de triagem para sêmen utilizando a técnica de imunocromatografia [19].
 O princípio da imunocromatografia é baseado no uso de uma membrana cromatográfica onde os anticorpos e a amostra de interesse forense se movem por capilaridade. Na membrana (fase estacionária) são aplicados anticorpos do anti-PSA conjugados com nanopartículas de ouro coloidal e a amostra de interesse (fase móvel) é aplicada na base do dispositivo. De acordo com Gartside et al. (2003) a reação positiva acontece quando há formação do imunocomplexo antígeno (PSA)-anticorpo [7].
 A coloração das nanopartículas de ouro revela uma linha de tonalidade rósea, após a estabilidade dos anticorpos aderidos à membrana, sendo a intensidade da coloração proporcional ao número de imunocomplexos formados. Em amostras com níveis de concentrações abaixo do limite de detecção do método (2,5 ng/mL a 4,0 ng/mL) não será visualizada a linha na região teste [7].
 Na análise de vestes, um fragmento da amostra é colocado em tubo de ensaio e extraída com salina. Cerca de 500μL do extrato é aplicado no dispositivo e a leitura realizada após 10 minutos. A presença das duas linhas formadas indica uma reação positiva. O teste exibe uma linha de controle interno (C) de reação para monitoramento qualidade (Figura 4) [16].
Figura 5: Resultado positivo para PSA utilizando o teste imunocromatográfico.
É possível, mesmo na presença de PSA na amostra, obter um resultado negativo devido ao efeito “hook” (efeito prozona). Este efeito ocorre quando há elevada quantidade de PSA presentes na amostra. Com isso a proporção entre PSA e o anticorpos anti-PSA será desigual. De acordo com Jayesh (2017) na maioria dos casos o imunocomplexo não será formado, resultando em falsos-negativo. O efeito “hook” pode ser contornado diluindo a amostra com solução de salina e repetindo o ensaio [11].
2.3 Fosfatase ácida
 A fosfatase ácida (FA) é uma glicoproteína dimérica produzida nas células epiteliais. O líquido seminal contém de 500 a 1000 mais FA comparado a outros fluidos corpóreos. De acordo com Lewis et al. (2013) nas análises forenses a FA é de grande valia por ser encontrada em elevada concentração no sêmen.
 A pesquisa da FA, presente no líquido seminal, é um teste de triagem de grande importância, pois em agressores azoospérrmicos, devido a patologias ou a vasectomia, ou oligospermos, onde há baixa de concentração ou ausência de espermatozoides, a FA continua presente, indicando a presença de líquido seminal do agressor na vítima.  De acordo com Montoya et al. (2010) esta técnica é considerada um teste de triagem, pois a FA é encontrada também em outros fluidos corporais, a exemplo, no soro ou plasma na concentração de 0,15 a 0,56 U/L [16].
 Segundo Magalhães et al. (2015) a FA é identificada, nos laboratórios forenses, por meio do teste enzimático e colorimétrico que utiliza reagentes químicos (substrato de timolftaleina, tampão, reagente de cor e padrão). Quando a FA se encontra presente na amostra ocorre desenvolvimento de coloração azulada após a reação (Figura 6). 
Figura 6: Pesquisa de FA em tecido. A: padrão; B: branco; C: amostra positiva. 
 A intensidade e a velocidade da mudança para a cor azul podem ser utilizadas para de determinar se há a presença de fluido seminal. De acordo Lewis et al. (2013) quando ocorre uma mudança de cor rápida com coloração intensa indica que a amostra contém fluido seminal, porém, quando a mudança de cor é lenta e fraca pode indicar outros fluidos corporais. Por ser um teste muito sensível, todos os resultados devem ser interpretados com cuidado, sendo necessários testes complementares [13].
2.4 Semenogelina
A semenogelina humana (SG) é uma proteína produzida nas vesículas seminais e utilizada como substrato para o PSA. É utilizada como um marcador na detecção do sêmen em amostras de crimes sexuais. Porém, pode estar presente também em outros fluidos corporais como urina, sangue, saliva, suor, leite materno, secreção vaginal e nas fezes, sendo necessário um teste confirmatório [17]. 
A imunocromatografia é uma técnica rápida, fácil e confiável utilizada para detectar a SG, utilizando dois anticorpos monoclonais específicos para o marcador. [9]. 
 Um dos anticorpos é ligado com outro anticorpo coloidal e são depositados abaixo da área teste. O segundo anticorpo é evidenciado sobre a linha de teste. A linha controle na membrana é composta por anticorpos de camundongos anti-IgG e é utilizada para controle interno. Após a adição da amostra no teste, os anticorpos e a amostra serão transportados por capilaridade pela membrana de nitrocelulose e os anticorpos anti-SG bloqueados na linha teste irão capturar o anticorpo ligados à semenogelina, produzindo assim uma linha vermelha na posição teste. O teste irá exibir uma linha vermelha na posição controle, demonstrando que o fluido foi transportado adequadamente [9].
Figura 7: Resultado positivo para SG utilizando o teste imunocromatográfico.
A detecção da semenogelina pode ser utilizada como alternativa à pesquisa de PSA por possuir mesma eficácia e sensibilidade [17].
2.5 Microscopia
 A microscopia de espermatozoides é utilizada como um teste de triagem para pesquisa direta de espermatozoide na amostra coletada. Se houver a presença de espermazóide no material coletado, a amostra deverá ser encaminhada para análise de DNA. A ausência de espermatozoides na amostra, não exclui a possibilidade de sêmen, devendo ser realizado outros métodos como a pesquisa de PSA e semenogelina para fazer a confirmação [18].
 A metodologia consiste em realizar a coleta da amostra da vítima que foi agredida sexualmente com a utilização de swabs. Após a coleta amostra é transferida para uma lâmina e corada para ter uma melhor visualização. Geralmente, são utilizadas duas lâminas, uma para coleta vaginal e outra para aárea perianal (mais comum em vítimas do sexo masculino). As lâminas são visualizadas utilizando um microscópico com a objetiva de 40x e o uso de corantes, sendo os mais utilizados a hematoxila-eosina (HE), por apresentar um melhor custo/benefício para o laboratório [8-15].
 Normalmente são visualizados núcleos azulados meio esbranquiçados na porção anterior do espermatozoide. Também pode ser observado na lâmina apenas a presença do núcleo do espermatozoide, pois a calda é perdida com o tempo (Figura 8) [1].
 
FIGURA 8: Visualização de espermatozoides em microscopia, utilizando a objetiva de 40x e o corante (HE). A: Ponta da seta, indicando um leucócito presente na amostra (pontinho preto), B: Ponta da seta mostrando claramente 3 espermatozoides com cabeça e calda, C: Ponta da seta indicando a presença de um espermatozoide, apresentando apenas a cabeça.
É importante salientar que não há como diferenciar espermatozoide humano de outras espécies com esta ténica. Outra desvantagem é a possibilidade de falso-negativo em casos do uso de preservativos, homens vasectomizados e azoospermáticos [17].
 Segundo Gouveia (2016) o tempo de coleta também pode interferir na análise podendo resultar em falsos-negativos em casos onde há demora na coleta do material. O tempo ideal para a coleta da amostra após a ocorrência do contato sexual é de no máximo 72 horas para coleta vaginal, 6 horas para coleta bucal e 24 horas se na região perianal [8].
 Vítimas em estado de putrefação, que tenham hemorragia ou apresente algum processo inflamatório na flora vaginal resultarão em lâminas de difícil visualização, podendo prejudicar a análise e a liberação dos resultados. Na pratica pericial todos os casos de homicídio onde a vítima é do sexo feminino é realizada a coleta de material para pesquisa de marcadores de sêmen [15].
3. CONCLUSÃO
O número de vítimas de agressão sexual no Brasil é alarmante, o que faz com que métodos eficazes para identificação de sêmen sejam disponibilizados para os Peritos Criminais para constatação do delito.
O emprego da luz forense ocorrerá mais em casos de triagem de vestes e locais externos de ampla área. O PSA e a SG serão importantes nos casos em que a pesquisa de espermatozoide resultou negativa e em casos de agressores azoospermos, oligospermos ou vasectomizados. A microscopia para pesquisa de espermatozoides é o método confirmatório da prática da relação sexual, necessitando da análise de DNA para verificar a origem do fluido biológico na vítima.
Assim, o desenvolvimento de novos métodos e sua interpretação em termos de sensibilidade e especificidade são cruciais para a correta interpretação dos resultados liberados pelos laboratórios forenses.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Perita Criminal do Instituto de Criminalística de Minas, Sordaine Maria Caligiorne, e a Médica Legista do Instituto Médico-Legal de Minas Gerais, Cibele Fontes Alves, pelo auxílio na execução do trabalho.
 
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REFERÊNCIAS 
 [1] ASKOY, E; AKTAN, T.M; DUMAN, S; CUCE, G. Assessment of Spermatozoa Morphology under Light Microscopy with Different Histologic Stains and Comparison of Morphometric Measurements. Int. J. Morphol. v.30, n.4 Temuco dic. 2012.
[2] BRASIL. Anuário Brasileiro de Segurança Pública. ISSN 1983-7364.2016 p.38. Disponível em <http://www.forumseguranca.org.br/storage/10_anuario_site_18-11-2016-retificado.pdf >. Acesso 10 jun 2017.
[3] BOWARD, E. S.; WILSON, S. L. A comparison of ABAcard_ p30 and RSID_-Semen test kits for forensic semen identification. Journal of Forensic and Legal Medicine, v.20 p. 1126-1130. 2013
[4] CERQUEIRA, DANIEL; COELHO, D. S. C.; FERREIRA, HELDER. Estupro no Brasil: vítimas, autores, fatores situacionais e evolução das notificações no sistema de saúde entre 2011 e 2014. Rev. Bras. Segur. Pública. v.11, n.1, p. 24-48. 2017.
[5] FIEDLER, A; REHDORF, J; HILBERS, F; JOHRDAN, L; STRIB, C; BENECKE, M. Detection of Semen (Human and Boar) and Saliva on Fabrics by a Very High Powered UV-/VIS-Light Source. The Open Forensic Science Journal, v.1, p.12-15, 2008
[6] FLORENTINO, B. R. B. As possíveis consequências do abuso sexual praticado contra crianças e adolescentes. Fractal: Revista de Psicologia, v. 27, n. 2, p. 139-144. 2015.
[7] GARTSIDE, B. O.; BREWER, K. J; STRONG, C. L; Estimation of Prostate-Specific Antigen (PSA) Extraction Efficiency from Forensic Samples Using the Seratecâ PSA Semiquant Semiquantitative Membrane Test. Forensic Science Communications, v.5, n.2. 2003.
[8] GOUVEIA, M. A. F. Comparação de diferentes métodos de análise de manchas de sémen, em tecidos analisados na rotina forense. (Dissertação) Mestrado de Genética Forense. Departamento de Biologia. 2016.
[9] INDEPENDENT FORENSICS. Rapid stain identification of human semen (rsid™-semen), Technical Information and Protocol Sheet for Use with Dual Buffer System. 2011.
 [10] IPEA- Instituto de Pesquisa Econômica Aplicada. Brasil em desenvolvimento. Estado, planejamento e políticas públicas. Brasília. 2013.
[11] JAYSEH, W. Retrospective approach to evaluate interferences in immunoassay. The journal of the international federation of clinical chemistery and laboratory medicine.v.28. p.224-232. 2017
[12] LENNARD, C. The detection and enhancement of latent fingerprints. Forensic symposium, p.16-19. 2001.
[13] LEWIS, J. Improved detection of semen by use of direct acid phosphatase testing. Science and Justice v.53 p.385-394, 2013.
[14] MAGALHAES, T; OLIVEIRA, R. J. D; SILVA, B; REAL, F. C; VIERA, D. N. Biological Evidence Management for DNA Analysis in Cases of Sexual Assault. Scientific World Journal, p.1- 11. 2015
[15] MIKE, R. M. F. L. Ministério da Justiça Secretaria Nacional de Segurança Pública. Procedimento Operacional Padrão Perícia Criminal Brasília – DF. 2013.
[16] MONTOYA, R. L; RODRIGUES, H. M; PEREZ, M. A; GARCIA, R. A. Relationship of spermatoscopy, prostatic acid phosphatase activity and prostate-specific antigen (p30) assays with further DNA typing in forensic samples from rape case. Forensic Science International v.206, p.111–118. 2011.
[17] PANG, B. C. M; CHEUNG, B. K. K. Identification of human semenogelin in membrane strip test as an alternative method for the detection of semen. Forensic Science International v.169 p.27–31. 2006
 [18] SOUSA, M. J; M.Q; P.R. Coleta E Preservação De Vestígios Biológicos Para Análises Criminais Por Dna. Ensaios e Ciência: Ciências Biológicas, Agrárias e da Saúde, v. 16, n. 3, p. 99-115. 2012
 
[19] SAWAYA, M. C. T; ROLIM, M. R. S. Antígeno especifico da próstata em fluidos biológicos: aplicação forense. Visão Acadêmica, v.5, n.2, p. 109-116. 2004

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