3ª MEIO DE CULTURA E AGENTES

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Meio de Cultura e Identificação Agentes Infecciosos
Meios de Cultura
Conjunto de substâncias, formuladas de maneira adequada, capazes de promover o cresc. bacteriano, em condições de laboratório.
A maioria das bact. pode ser cultivada em laboratório, utilizando-se meios nutrientes;
Diferentes espécies de bactérias, variam extensivamente quanto as exigências mínimas de substâncias nutrientes;
Escolha dos meios de cultura para o processamento inicial das amostras = condicionada à flora patogênica desse local;
Usado mais de um tipo de meio, no sentido de fornecer condições de crescimento a todos os patógenos possíveis de estarem presentes;
Então dependendo da amostra clínica e do local de coleta e a suspeita diagnóstica o meio é escolhido.
Seleção dos Meios de Cultura
Sítio da infecção = meios particularmente utilizados na rotina na semeadura primária;
Procedimento mais utilizado = aquisição de meios pré-fabricados e fornecidos de forma desidratada (pesagem criteriosa da qtde necessária ao volume desejado seguido de dissolução e esterilização).
Utilização de meios cromogênicos: identificação presuntiva de microrganismos
Seleção dos Meios de Cultura
Podem ser naturais ou complexos:
Ingredientes com composição química não definida, tais como extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubérculos, peptona de soja, etc.), de animais (carne, cérebro, fígado, caseína, etc.) e de microrganismos (levedura); 
Artificiais, sintéticos ou ainda quimicamente definidos:
Composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e os seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos, em fontes de carbono, azoto, vitaminas, energia, sais minerais, entre outros, quando são conhecidas as necessidades nutricionais específicas. 
Meios de cultura básicos
São os que permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer contudo nenhuma exigência em especial; 
Meios de cultura complexos:
Cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos, como meio de infusão de cérebro e coração, ágar sumo de tomate, ágar sangue, etc.
Procedência dos constituintes 
Meios Sintéticos - A composição química de todos os seus componentes é conhecida (definidos).
Meios Complexos - A composição química de alguns dos seus componentes é desconhecida (geralmente quando se adiciona soro, sangue ou outro componente que não se tem total conhecimento da composi- ção química).
De Acordo com a Composição Química
Meios Básicos: preparo de outros meios;
Meios enriquecidos: meios com nutrientes;
Meios seletivos: possuem substâncias químicas que inibem o crescimento de certas bactérias;
Meios diferenciais: é possível distinguir certos tipos de bactérias;
Meios de dosagem: usado para dosar vitaminas e antibióticos;
Meio de manutenção: usado para manter a viabilidade bacteriana;
Meio de transporte: semi-sólidos e com meios mínimos. 
De Acordo com a Composição Química
A base deste meio é altamente nutritiva e promove um ótimo crescimento de todos os microrganismos relevantes;
Meio base: ágar Columbia ou ágar BHI;
Suplementado de sangue desfibrinado de carneiro ou de cavalo, favorecendo a hemólise; 
Agar Sangue (ASA)
Ágar sangue é um meio de cultura diferencial[1] e não seletivo,[2] rico em nutrientes, utilizado para isolamento de microorganismos não fastidiosos, prova de satelitismo e verificação de hemólise de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. em cultivo primário. 
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Meio não seletivo para cultivo primário da maioria dos Gram (+) e Gram (-);
Permite verificar o padrão de hemólise.
O sangue estéril é adicionado ao ágar (5%) após sua autoclavação. A adição deve ocorrer quando a solução estiver a 45-50ºC. 
Agar Sangue (ASA)
Agar Sangue
Meios Cultura
Hemólise beta hemolítica: Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ou Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Hemólise alfa hemolítica: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.
Hemólise gama (sem hemólise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
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Agar Sangue
Meios Cultura
S. pneumoniae
Hemólise beta hemolítica: Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ou Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Hemólise alfa hemolítica: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.
Hemólise gama (sem hemólise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
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Agar Sangue
Meios Cultura
Micrococcus
S. epidermidis
Hemólise beta hemolítica: Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ou Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Hemólise alfa hemolítica: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.
Hemólise gama (sem hemólise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
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Agar Sangue
Meios Cultura
S. pyogenes 
S. aureus
Hemólise beta hemolítica: Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ou Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Hemólise alfa hemolítica: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.
Hemólise gama (sem hemólise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
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Agar Sangue
Pode ser fornecido em placas prontas para o uso.
Controle de Qualidade: pH: 7,3 ± 0,2 
Cor e aparência do meio preparado: 
vermelho escuro, opaco 
Acondicionamento: sob refrigeração (2º a 8ºC) por 4 meses.	
Meios Cultura
Não seletivo e diferencial;
Destinado ao isolamento e quantificação de colônias em amostras de urina. 
Diferencial para bactérias fermentadoras da lactose devido a mudança de coloração do meio de verde para amarelo.
Deficiente em eletrólitos não permitindo a formação do “véu” ou swarming de Proteus sp.
Ágar Cled (Cystine Lactose Electrolyte 	Deficient) 
Escherichia coli: colônias opacas, amarelas com ligeira cor amarelo escuro no centro, com cerca de 1,25 mm de diâmetro, as não fermentadoras de lactose colônias azuis
Espécies de Klebsiella: colônias muito mucosas, cor variável de amarelo a branco azulado
Espécies de Proteus: colônias azul translúcidas, geralmente menor que E.coli
Espécies de Salmonella: colônias planas, cor azul
Enterococcus faecalis: colônias amarelas, com cerca de 0,5 mm de diâmetro
Staphylococcus aureus: colônias amarelas, com cerca de 0,75 mm de diâmetro
Staphylococcus coagulase negativa: colônias amarelo palha e brancas
Corynebacterium: colônias pequenas e cinza
Lactobacilos: colônias pequenas e com superfície rugosa
Pseudomonas aeruginosa: colônias verdes, com superfície prateada e periferia rugosa
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Aparência: verde
Armazenamento: Invertidas entre 2 a 8ºC; armazenar de forma a permitir a circulação de ar entre as placas
Ágar Cled (Cystine Lactose Electrolyte 	Deficient) 
Ágar CLED é um meio de cultura que inibe cepas de Proteus, além de isolar e quantificar os microorganismos da urina. É um meio de coloração azul clara onde apresenta coloração amarelada para colônias de microorganismo lactose positivos e coloração azul para lactose negativos. 
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Ágar Cled (Cystine Lactose Electrolyte 	Deficient) 
Não fermentadores
fermentadores
S. Coagulase negativo 
É um meio seletivo e diferencial para isolamento de bacilos Gram negativos entéricos;
Agar MacConkey
Positivo: Proteus mirabilis ATCC 12453 (não fermentador de lactose).
Positivo: Escherichia coli ATCC 25922 (fermentador de lactose).
Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
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Os sais biliares e o cristal violeta presentes no meio inibem o crescimento de bactérias Gram (+) e algumas Gram (-) exigentes. 
A lactose e o indicador de pH, vermelho neutro, são utilizados para detectar a degradação da lactose.
Armazenamento: Invertidas entre 2 a 8ºC
Agar MacConkey
Cor original do meio: rosa avermelhado.
Crescimento de bacilos Gram negativos.
Colônias cor de rosa: fermentadoras de lactose.
Colônias incolores: não fermentadoras de lactose.
Não há crescimento de cocosGram positivos
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Nesse meio podemos diferenciar:
Bactérias fermentadoras de lactose - colônias rosa com halos de precipitação como: E. coli, Klebsiella, Enterobacter; 
Não fermentadoras de lactose - colônias transparentes ou incolores como: Salmonella, Shigella, Proteus.
Agar MacConkey
Cor original do meio: rosa avermelhado.
Crescimento de bacilos Gram negativos.
Colônias cor de rosa: fermentadoras de lactose.
Colônias incolores: não fermentadoras de lactose.
Não há crescimento de cocos Gram positivos
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Meio seletivo e diferencial;
Pode ser usado no lugar do Macconkey;
Isola o mesmo que o Macconkey;
Os corantes eosina e azul de metileno inibem as bactérias g (+) e as g (-) exigentes;
Em pH ácido, combinam-se, servindo de indicadores. 
Ágar EMB (Eosina-azul-de-metileno) 
E.coli
Klebsiella, Enterobacter
Proteus, Salmonella
Ágar EMB (Eosina-azul-de-metileno) 
Fermentadores de lactose intensa (E. coli) = colônias negro-esverdeadas com brilho metálico;
Fermentadores fracos (Klebsiella, Enterobacter) = colônias púrpuras
Não fermentadores (Proteus, Salmonella) = colônias transparentes;
Cor e Transparência:
Cor púrpura avermelhado, forma do gel levemente opalescente e precipitado finamente disperso em placas de Petri.
Condições de Armazenamento:
Meio preparado de 2 a 8ºC.
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Altamente Seletivo e diferencial
inibe a maioria dos coliformes e permite o crescimento de Salmonella e Shigella a partir de fezes, urina e alimentos frescos ou enlatados.
As concentrações de sais biliares e citrato de sódio inibem todas as bactérias g (+) e coliformes;
Ágar Salmonella Shigella 
Vermelho Neutro = indicador de pH ácido
bactérias que fermentam a lactose produzem ácido que na presença do indicador vermelho neutro resultando na formação de colônias de cor rosa;
bactérias que não fermentam a lactose formam colônias transparentes
Tiossulfato = e o citrato férrico permitem a detecção de H²S evidenciado por formação de colônias de cor negra no centro. 
Ágar Salmonella Shigella 
Cor original do meio: vermelho alaranjado. 
ƒColônias com centro negro (H²S) ou colônias incolores: suspeita de Salmonella. ƒ 
Colônias incolores: suspeita de Shigella spp. 
ƒColônias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp. ƒ 
As bactérias não fermentadoras de lactose são incolores. ƒ As bactérias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa. 
Ágar Salmonella Shigella 
Ágar Salmonella Shigella 
Meios Cultura
Ágar Salmonella Shigella 
Meios Cultura
K. pneumoniae
E. coli
P. mirabilis 
Salmonella sp.
P. aeruginosa
A. Klebsiella pneumoniae
B. Escherichia coli - Klebsiella pneumoniae & Escherichia coli are positive for acid production from fermentation of the carbohydrate(s) present. 
C: Salmonella sp.
D: Proteus mirabilis - Both Salmonella sp. & Proteus mirabilis product hydrogen sulfide. 
E: Pseudomona aeruginosa  - The Pseudomonas colonies are nearly colorless.
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Seletivo
É um meio direto para amostras fecais, com o objetivo de aumentar o isolamento de Salmonella e Shigella. 
Elevadas concentrações de sais biliares inibe o crescimento de g (+) e retarda o de muitas cepas de coliformes;
Ágar Hektoen 
Ágar Hektoen 
Meios Cultura
Fermentadores de lactose
Amarelo – Salmão 
Produtores H2S 
Precipitado preto
Sem cor 
Não fermentadores
Meio Enriquecido
Cultivo de organismos fastidiosos, como Neisseria sp., Haemophilus sp.e outros germes exigentes. 
Para o isolamento de Haemophilus adiciona-se antibióticos (ex: bacitracina);
Aparência: marron
Ágar Chocolate
Ágar Chocolate
Meios Cultura
Ágar Chocolate
Meios Cultura
Finalidade: 
Realização de antibiograma (teste de sensibilidade) pela técnica de difusão de discos segundo o CLSI. 
É rico proteínas e carboidratos que fornece o substrato ideal para o desenvolvimento e crescimento de cepas bacterianas de interesse clínico.
Aparência: 
Âmbar claro
Ágar Müeller Hinton 
Ágar Müeller Hinton 
Meios Cultura
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Ágar Müeller Hinton + Sangue 
Finalidade: Facilitar o cresimento de microorganismos fastidiosos. 
Streptococcus sp. 
Meios Cultura
Seletivo e Diferencial
Isolamento de Staphilococcus aureus de amostras biológicas como urina, secreções, feridas e exudatos.
Indústria alimentícia utilizado para 
a identificação de Estafilococos em 
líquidos e produtos lácteos, 
carnes e derivados, incluindo 
conservas e pescados. 
Ágar Manitol 
Lowenstein-Jensen
Componentes: ovos inteiros coagulados, sais definidos, glicerol e fécula de batata;
Agente inibidor = verde malaquita (Gram +);
Meio para o isolamento de Mycobacterium tuberculosis.
Meios Cultura
Permite a identificação presuntiva de bactérias;
Baseada nas diferentes colorações das colônias bacterianas, causada pelas reações enzimáticas espécie ou gênero específico com substratos incorporados no meio de cultura
Meios Cromogênicos 
Meios Cromogênicos 
Meios Cultura
Meios Cromogênicos 
Meios Cultura
Meio de enriquecimento;
Permite o crescimento da maioria das bactérias.
Meios Cultura
Caldo BHI
Caldo Tioglicolato
Meio enriquecido, adicionado de hemina e vitamina K;
Não inibidor;
Permite um bom desenvolvimento de todos anaeróbios encontrados com frequência em amostras biológicas.
Meios Cultura
Meios Cultura
Passo 1: Semeio inicial das amostras
Amostras clínicas (por exemplo, sangue, urina, fluido cefalorraquidiano) são espalhados em placas contendo meio de cultura sólido e líquido; 
Colônias isoladas de bactérias (visíveis a olho nu) aparecem após a incubação das placas por 24-48h. 
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Passo 1I: 
A observação das características dessas colônias em relação a tamanho, forma, textura, cor e (se crescidas em meio ágar sangue) reações de hemólise. 
Necessidade ou não oxigênio para crescer.
Fermentação de determinados açúcares.
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Semeio
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Contagem semi-quantitativas = alça de 0,001 
Cultura...
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Meio de cultura
Estufa Bacteriológia 24-48h
Avaliação do Crescimento Bacteriano
Meios de cultura sólidos: crescimento de colônias que podem estar separadas ou não, dependendo do tipo de semeio utilizado.
Placas de Petri ou tubo:
Cor
Aspecto (mucosas ou não)
Forma 
Tamanho. 
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Avaliação do Crescimento Bacteriano
Cada colônia (em princípio) = multiplicação de uma só bactéria. 
Diferentes espécies = diferenças mais visíveis em meios seletivos.
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Passo 2: as colônias isoladas são coradas pelo método de Gram e células individuais de bactérias são observadas ao microscópio.
Passo 3: As bactérias são identificadas usando-se colônias isoladas. 
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Coloração de Gram em Corynebacterium diphtheriae. 
Doença transmissível aguda, toxiinfecciosa, imunoprevenível, causada por bacilo toxigênico, 
que frequentemente se aloja nas amígdalas, faringe, laringe, nariz e, ocasionalmente, em outras 
mucosas e na pele. É caracterizada por placas pseudomembranosas típicas. Corynebacterium diphtheriae, bacilo gram-positivo, produtor da toxina diftérica, quando infectado por um fago.
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Streptococcus.
Staphylococcus.
Coloração de Gram em Bacillus anthracis.
Bacilo móvel, grampositivo encapsulado, formador de esporos denominados Bacillus anthracis.
Toxiinfecção aguda que, em geral, acomete a pele sob as formas de lesão bolhosa e pústula maligna, produzida pelo contato com animais (bovino,caprino, eqüino e outros) com a mesma doença. As formas viscerais são raras, embora graves, representadas pelo carbúnculo pulmonar, gastrintestinal e neuromeníngeo.
Vetores: Aventa-se a possibilidade de transmissão por insetos hematófagos que tenham se alimentado de animais infectados.
Modo de transmissão: A maneira mais comum de contaminação é o manuseio de produtos tais como lã, couro, osso e pêlo, provenientes de animais infectados.
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 Coloração de Gram em Escherichia coli. 
Observa-se a aparência das bactérias sob microscópio. Pergunta-se:
Elas são Gram positivas ou negativas ou álcool-ácido resistentes?
Qual a sua morfologia (bacilos, cocos, espiraladas, etc.)?
As células ocorrem de forma isolada, em cadeias ou em pares?
Qual o tamanho das células?
Intraleucocitárias?
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Cuidados na coloração de Gram:
Espessura do esfregaço;
Superaquecimento na fixação pelo calor;
Descoloração;
Ausência de manutenção preventiva dos microscópios.
Bacterioscopia
Como reportar o resultado de Gram:
Descrever as características morfológicas, tintoriais e o arranjo das células;
Ex: cocos Gram-positivos aos pares;
Diplococos Gram-negativos;
Bacilos Gram-negativos; 
Cocobacilos Gram variáveis
Quantificar as bactérias;
Ausentes;
Raros (<10 em todos os campos)
Alguns, poucos ou moderados (10-30 p/campo)
Numerosos, muitos ou frequente (>30 em um campo observado);
 
Descoloração;
Ausência de manutenção preventiva dos microscópios.
Bacterioscopia
Como reportar o resultado de Gram:
Resultado negativo na bacterioscopia não significa ausência de microrganismos na amostra;
Ex. de laudo 1:
Bacterioscopia: método de Gram
Material clínico: conteúdo vaginal;
Células epiteliais: algumas
Numerosos cocos bacillos Gram negativos, com presença de Clue cells, sugestivo de Gardnerella vaginalis;
Laudo 2: Material clínico: Líquido pleural;
Resultado: não foram observados microrganismos na amostra clínica.
Bacterioscopia
Conteúdo vaginal