relatório de Bioquímica

Prévia do material em texto

Critério:
	Nota:
	Apresentação
	
	Introdução
	
	Objetivos
	
	Métodos
	
	Resultados
	
	Discussão
	
	Bibliografia
	
	Total:
	
Introdução 
 Enzimas são catalisadores biológicos que aceleram a velocidade das reações químicas, diminuindo a energia de ativação. Possuem, em geral, estrutura proteica, sendo que algumas moléculas de RNA (ribozimas) foram descritas com atividade catalítica. As enzimas são extremamente específicas em relação à reação na qual elas atuam, algumas catalisam somente um estereoisômero, outras catalisam uma família de reações similares. 
 A ligação entre enzima e substrato é denominada como sítio ativo, local onde ocorre a catalise enzimática como também é a região da enzima que contém resíduos de aminoácidos capazes de interagir com o substrato que participam da ruptura e estabelecimento de ligações químicas que resultam na formação do produto. 
 A estrutura e a forma do centro ativo são uma decorrência da estrutura tridimensional da enzima e podem ser afetadas por quaisquer agentes capazes de provocar mudanças conformacionais na proteína, portanto, a atividade enzimática é dependente das características do meio os processos que influenciam este meio são: alta temperatura, variação de pH, estabilidade em solventes orgânicos e baixa seletividade, entre outras.
 A velocidade com que a reação catalisada por uma enzima irá ocorrer depende de diversos fatores: Concentração de substrato, Concentração da enzima, Temperatura, pH. Em uma concentração constante de enzima, a velocidade da reação aumenta com o aumento da concentração de substrato até que a velocidade máxima seja alcançada. No entanto concentrações de substratos suficientemente altas, os centros catalíticos estarão ocupados e assim a velocidade de reação alcança seu ponto máximo. 
A grande maioria das reações biológicas não ocorre, ou ocorre em velocidades baixíssimas de velocidades nas condições fisiológicas de pH. As enzimas são sensíveis as variações da concentração em H+ do meio. Cada enzima possui uma faixa ideal de pH para qual a atividade enzimática é máxima ou mínima. Valores muito altos ou muito baixos de pH, dependendo da enzima, poderão causar a desnaturação da enzima, o que anula sua ação catalítica.
O aumento da temperatura resulta no aumento da reação enzimática por aumentar a frequência dos choques (excitação) entre os substratos e as enzimas. A temperatura ideal para as enzimas terem atividade ótima varia de 30 a 40 ºC. Com o prosseguimento da elevação da temperatura começa a ocorrer a desnaturação térmica da enzima caindo a velocidade de reação, devido a inativação enzimática.
 Além disso existe substâncias denominadas inibidores que tem como função interferir com a catálise, diminuindo ou interrompendo as reações enzimáticas. Os inibidores podem ser de dois tipos principais, reversíveis ou irreversíveis. Dentre os inibidores reversíveis, existem quatro tipos: inibidores competitivos, não competitivos, acompetitivos e mistos. 
 O inibidor competitivo compete com o substrato pelo sítio ativo da enzima. A medida que o inibidor ocupa o sítio ativo, ele impede que o substrato se ligue à enzima acarretando na redução da velocidade da reação. Já os não competitivos ligam - se a radicais que não pertencem ao grupo ativo da enzima, essa ligação gera uma mudança estrutural que inviabiliza a catálise.
 Os inibidores acompetitivos também se ligam a radicais que não pertencem ao grupo ativo da enzima. No entanto um inibidor não competitivo liga-se em um sítio distinto do sítio ativo do substrato e, ao contrário do inibidor competitivo, liga-se apenas ao complexo ES. 
 Os inibidores irreversíveis ligam-se ao centro ativo da enzima e formam ligações covalentes ou peptídicas com ele, inativando permanentemente a enzima. 
Objetivo 
 Analisar o comportamento da atividade enzimática, através de sua velocidade da reação, quando exposta a diferentes condições, tal como, variação da temperatura, variação da concentração do substrato, variação do tempo assim como sua atividade de reação sob o efeito de inibidores. Dessa maneira possibilitando a construção da curva padrão e calcular os parâmetros cinéticos da enzima, sendo eles Vm e Km. 
Materiais e Métodos 
Solução padrão de p-nitrofenol (PNP) 0,1 mM em tampão Tris -HCl pH 9,5 
 Solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 1 mM tampão Tris- HCl pH 9,5 
Solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 10 nM em tampão água tipo III.
 Solução tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 7,5, 8,5 e 9,5 
 Solução de Na2HPO4 2,5 mM em tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 9,5 (sol. tampão Tris-Pi-HCl) 
 Soluções tampão borato-NaOH 0,3 M, pH 9,5, 10,5 e 11,5 
 Soluções tampão citrato HCl 0,2 M, pH 5,5, 6,5 e 7,5 
 Solução de NaOH 2 M 
 Solução de enzima: fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1) 5,0 g/mL (Sigma Fine Chemicals)
 Pipetador automático 200 - 1000 L (Gilson) 
Pipetador automático 200-1000 L (Gilson)
 2 Pipetas de 1 mL 
 2 Pipetas de 2 mL 
 Pipeta de 5 mL 
 2 Pipetas de 10 mL 
 2 Pró-pipetes 
 22 Tubos de ensaio 
 Vortex (QL-901) 
 Banho de gelo (0°C) 
Banho-maria (25°C) 
 Banho-maria (37 °C) – (Biomatic) 
 Banho-maria (68 °C) – (Tisatom) 
 16 Cubetas 
 Espectrofotômetro (Biospectro –Espectrofotômetro SP -220)
Métodos