antonio teixeira

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Universidade Federal de Pernambuco 
Centro de Ciências da Saúde 
Departamento de Ciências Farmacêuticas 
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas 
 
 
 
 
 
 
 
 
MARCAÇÃO DE ANTÍGENOS ERITROCITÁRIOS DO SISTEMA ABO COM 
NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES DE SEMICONDUTORES 
 
 
 
 
 
 
ANTONIO TEIXEIRA DE SALES NETO 
 
 
 
 
 
 
Recife-PE, Brasil 
Fevereiro, 2012 
Universidade Federal de Pernambuco 
Centro de Ciências da Saúde 
Departamento de Ciências Farmacêuticas 
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas 
 
 
 
 
 
MARCAÇÃO DE ANTÍGENOS ERITROCITÁRIOS DO SISTEMA ABO COM 
NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES DE SEMICONDUTORES 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANTONIO TEIXEIRA DE SALES NETO 
(Bolsista CAPES) 
 
Orientação: Profª Dra. Beate Saegesser Santos 
Co-orientação: Profª Dra. Adriana Fontes 
 
 
 
Recife-PE, Brasil 
Fevereiro, 2012 
Dissertação apresentada ao Programa 
de Pós-Graduação em Ciências 
Farmacêuticas da UFPE como parte 
dos requisitos necessários para a 
obtenção de título de Mestre em 
Ciências Farmacêuticas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Recife, 28 de fevereiro de 2012. 
 
 
Defesa de Dissertação de Mestrado de Antonio Teixeira Sales Neto defendida e 
APROVADA, por decisão unânime, em 28 de fevereiro de 2012 e cuja Banca 
Examinadora foi constituída pelos seguintes professores: 
 
PRESIDENTE E PRIMEIRA EXAMINADORA INTERNA: Beate Saegesser 
Santos do Depto. de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de 
Pernambuco - UFPE. 
 
 Assinatura:___________________________________ 
 
SEGUNDA EXAMINADORA INTERNA: Ana Cristina Lima Leite do Depto. de 
Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE. 
 
 Assinatura: ___________________________________ 
 
PRIMEIRA EXAMINADORA EXTERNA: Norma Lucena Cavalcante Licínio da 
Silva do Depto. De Imunologia do Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães da 
Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ. 
 Assinatura: __________________________________ 
 
 
 
 
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO 
PRÓ-REITORIA PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabalho a minha mãe, Maria da Paz, 
e minhas irmãs, Rosanny e Rosimery. 
A todos que me ajudaram nesta empreitada... 
 
 
 
 
 
 
... a equipe do laboratório de Citometria de Fluxo da Fundação Hemocentro de Ribeirão 
Preto: Patrícia Palma, Daiane dos Santos, Camila Menezes e Carmen Simão que me 
receberam com muito carinho e atenção; 
...a Fundação HEMOPE Recife, pelas amostras fornecidas; 
...Dra. Valéria Pereira, pelo auxílio nas análises em citometria de fluxo no Centro de 
Pesquisas Aggeu Magalhães; 
...do grupo de pesquisa NanoBio (Nanotecnologia Biomédica), que colaboraram 
diretamente neste projeto pelo apoio essencial; 
...minha co-orientadora, Profa . Dra. Adriana Fontes, pela valiosa contribuição e amizade; 
...minha orientadora, Profa. Dra. Beate Saegesser Santos por ter aceitado me conduzir no 
desenvolvimento deste trabalho e pelo conhecimento e disposição diante das minhas 
limitações; 
...e a todos que indiretamente contribuíram a cada dia... 
 
...os meus fraternos agradecimentos. 
 
 
 
 
 
 
 
Resumo 
 
Os Quantum dots (QDs) ou ponto quânticos vem sendo cada vez mais aplicados na área 
de diagnóstico por fluorescência como uma alternativa mais estável em comparação com 
os corantes orgânicos usualmente aplicados. Em comparação a estes, os QDs têm 
características ópticas peculiares que os dão vantagens como: resistência ao 
fotoescurecimento, possuírem um estreito espectro de emissão e uma larga banda de 
absorção. Uma vez recobertos, estas nanoestruturas podem ser bioconjugadas a alvos 
biológicos ou mesmo a anticorpos tornando-se fluoroimunoensaios com grande 
especificidade. Este foi o objetivo deste manuscrito, onde CdS/Cd(OH)2 - emissão no 
verde - tendo como agente estabilizante o polifosfato de sódio ([(NaPO3)]n) e CdTe 
sintetizados com telúrio metálico, Cd(ClO4)2, ácido mercaptosuccínico (AMS) - emissão 
no laranja - e ácido mercaptopropiônico (AMP) - emissão no verde - como agentes 
estabilizantes, foram bioconjugados por formação de bases de Shiff e por adsorção a 
anticorpos do sistema sanguíneo ABO e, posteriormente, usados na marcação simples (A 
e B) e dupla (AB) de eritrócitos previamente fenotipados sendo o tipo O foi usado como 
controle negativo. Os QDs foram caracterizados opticamente através de espectroscopias 
de absorção e emissão e estruturalmente através de técnicas de microscopias eletrônica 
de transmissão, pela qual pode ser confirmada a sua cristalinidade, e também a difração 
de raio-X, revelando diâmetros médios de ~3 nm para o QD-AMS, ~2 nm para o QD-AMP 
e ~7,5 nm para o CdS/Cd(OH)2. Através da Citometria de Fluxo, os sistemas QDs-
anitocorpos demonstraram especificidade obtendo-se valores de 28,4% para os 
bioconjugados com CdS/Cd(OH)2-anti-A, 70,64% para o tipo A com o sistema CdTe/CdS-
anti-A em FL2 (canal laranja), 37,73% para o tipo B com o sistema CdTe/CdS-anti-B em 
FL1 (canal verde) e 58,24% de dupla marcação detectada em ambos os canais. Os 
resultados dos QDs CdS/Cd(OH)2, QD-AMS e QD-AMP bioconjugados a anticorpos do 
sistema ABO mostram especificidade da técnica e abrem a possibilidade de 
determinação de fenótipos fracos desse sistema. Além disso, serve de modelo para a 
bioconjugação com outros anticorpos e consequentemente, para o diagnóstico de várias 
doenças. 
 
 
Palavras-chave: Quantum dots, imunohematologia, bioconjugação, adsorção. 
 
Abstract 
 
The quantum dots (QD) or quantum point has been increasingly applied in the diagnostic 
area fluorescence as a more stable in comparison with organic dyes is usually applied. In 
comparison to these, QD have optical characteristics which provide unique advantages 
such as resistance fotoescurecimento, having a narrow emission spectrum and a 
broadband absorption. Once coated, these nanostructures to be bioconjugadas biological 
targets or even becoming fluoroimunoensaios antibodies with high specificity. This was 
the aim of this manuscript, where CdS/Cd(OH)2 - emission in the green - as having a 
stabilizing agent sodium polyphosphate ([(NaPO 3)]n) and synthesized CdTe with tellurium 
metal, Cd(ClO4)2, acid mercaptosuccínico (AMS) - emission in the orange - 
mercaptopropionic acid (MPA) - emission in the green - as stabilizing agents, by formation 
of bioconjugates were of Schiff bases and adsorption system ABO blood antibodies and 
subsequently used in single marking ( A and B) and double (AB) of erythrocytes and the 
type previously phenotyped O was used as negative control. The optically QD were 
characterized by absorption and emission spectroscopies and structurally by techniques 
of transmission electronic microscopy, in which can be confirmed its crystallinity, and also 
the X-ray diffraction, showing an average diameter of ~3 nm to QD-AMS, ~2 nm for the 
QD-AMP and ~ 7.5 nm for the CdS/Cd(OH)2. By Flow Cytometry, QD-anitocorpos 
systems showed specificity to yield values of 28.4% for the bioconjugate with 
CdS/Cd(OH)2 anti-a, 70.64% type A with the system CdTe-anti-AFL2 (channel orange), 
37.73% type B with the system CdTe-anti-B-FL1 (green) and 58.24% of double labeling 
found in both channels . The results of the QDs CdS/Cd(OH)2, QD-AMS and QD-AMP 
bioconjugates to antibodies of the ABO system show specificity of the technique and open 
the possibility of determining weak phenotypes of the system. Moreover, it serves as a 
model for bioconjugation with other antibodies and hence for the diagnosis of various 
diseases. 
 
 
Keywords: Quantum dots, immunohematology, bioconjugation, adsorption. 
 
 
 
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS 
 
[(NaPO3)]n Polifosfato de Sódio 
AMP Ácido Mercaptopropiônico 
AMS Ácido Mercaptosuccínico 
anti-A anticorpos anti-A 
Anti-B anticorpos anti-B 
Cd(ClO4)2 Perclorato de Cádmio 
Cd(OH)2 Hidróxido de Cádmio 
CdO Óxido de Cádmio 
CdS Sulfeto de Cádmio 
CdSe Seleneto de Cádmio 
CdSe Seleneto de Cádmio 
CdTe Telureto de Cádmio 
EDC 1-etil-3-3-dimetilaminopropil-carbodiimida 
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético 
FSC "Forward Scatter" ou Ângulo de dispersão Frontal 
Fuc L-Fucose 
G Guanina 
g/mL Gramas por militro 
Gal D-Galactose 
GalNAc N-acetilgalactosamina 
GlcNAc N-acetilglucosamina 
Glut Glutaraldeído 
HCl Ácido Clorídrico 
HClO4 Ácido Perclórico 
He Hemácias 
IgA Imunoglobulina A 
IgG Imunoglobulina G 
IgM Imunoblobulina M 
ISBT International Society of Blood Transfusion 
˗N=C= carbodiimida 
NaOH Hidróxido de Sódio 
nm Nanômetro 
PBS 1X Tampão Fosfato 
QD Quantum dots 
SSC "Side Scatter" ou Ângulo de Dispersão Lateral 
sulfo-NHS N-hidroxi-sulfo-sucinamida 
TPSA Antígeno Prostático Específico Total 
ua Unidades Arbitrárias 
UV Ultra Violeta 
ZnS Sulfeto de Zinco 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1: Emissão de suspensões contendo nanocristais de CdSe/ZnS de diferentes 
diâmetros, excitadas com lâmpada na região do UV. 
Figura 2: Esquema de um quantum dot (QD) passivado (camada cinza) e 
funcionalizada com Glutaraldeído. 
Figura 3: Fotodegradação em função do tempo. Linha superior: antígenos nucleares 
marcados com CdSe 630 estreptavidina (vermelho) e microtúbulos 
marcados com Alexa Fluor 488 (verde), simultaneamente. Linha inferior: 
microtúbulos foram marcados com quantum dots 630-estreptavidina 
(vermelho), e antígenos nucleares foram corados com Alexa 488 (verde). O 
tempo de exposição é indicado em segundos. 
Figura 4: Comparação dos perfis de emissão e excitação entre a Rodamina 6G e 
CdSe (ua: unidades arbitrárias) 
Figura 5: Comparação entre diferentes quantum dots e fluoróforos utilizados em 
análises 
Figura 6: Estruturas químicas dos Ácidos mercaptopropiônico AMP (superior) e 
mercaptosuccínico AMS (inferior). 
Figura 7: Bioconjugação de quantum dot (funcionalizado com terminações 
carboxílicas) a anticorpos mostrando dois tipos de ligação, covalente e 
sufidril-amina. 
Figura 8: Modelo da membrana eritrocitária que carrega os grupos sangüíneos. 
Figura 9: Síntese dos antígenos ABO. 
Figura 10: Configuração de filtros e espelhos para compor 5 parâmetros específicos: 
FSC, SSC e fluorescências verde, laranja e infravermelho (> 650nm). 
Figura 11: Perfis de dot-plots de sangue total características das populações celulares 
nos parâmetros FSC x SSC e posterior separação em Gates para análise 
das populações mais homogêneas separadamente. 
Figura 12: Exemplo de gráfico de citometria de fluxo mostrando em seus quatro 
quadrantes a positividade e negatividade de marcação para dois antígenos 
celulares numa população celular sendo analizados por fluoróforo 
detectados nos filtros FL1 e FL2 (verde e laranja, respectivamente). 
Figura 13: Esquematização da bioconjugação QDs-anti-A e sua ligação aos antígenos 
eritrocitários (1) e imagens de microscopia de fluorescência de hemácias 
(2). 
Figura 14: Esquema de síntese e passivação do CdS/Cd(OH)2 (1) (CHAVES, 2006, 
adaptada); Aspecto final da suspensão (2) e a mesma sob UV (3). 
Figura 15: Monitoramento visual das fases da redução do telúrio. A coloração violeta 
refere-se à presença da espécie Na-Te-Te-Na(aq). 
Figura 16: Solução precursora de cádmio (1) e a mesma após injeção de solução 
contendo íons Te2- (2). 
Figura 17: Aspecto final da suspensão de CdTe - AMS (1); Suspensões de AMS 
(esquerda) e AMP (direita) (2) e as mesmas sob UV (3). 
Figura 18: Da esquerda para direita tobserva-se as proporções de bioconjugados 50:1, 
25:1 e 12,5:1 (v/v) do AMP (amareladas) e as mesmas proporções de 
bioconjugados para o AMS ( esverdeadas). 
Figura 19: Difratograma de raios-X de pó representativo de amostra de CdS/Cd(OH)2. 
Figura 20: Espectros de Absorção e emissão normalizada do CdS/Cd(OH)2 (excitado 
em 337 nm). 
Figura 21: Difratograma de Raios-X de pó do CdTe - AMS. 
Figura 22: Espectros de absorção e emissão normalizados da suspensão de CdTe - 
AMS sintetizada. 
Figura 23: Imagem HR-MET de nanopartículas de CdTe - AMS. Barra: 5 nm. 
Figura 24: Difratograma de Raios X de pó de CdTe - AMP. 
Figura 25: Imagens HR-MET de nanopartículas de CdTe - AMP. Barra: 2 nm. 
Figura 26: Espectros de absorção e emissão normalizados da suspensão de CdTe - 
AMP sintetizada. 
Figura 27: Dot-plots obtidos na citometria de fluxo na marcação com CdS/Cd(OH)2. 1: 
Células tipo A não marcadas; 2: Células tipo A incubadas com 
CdS/Cd(OH)2-Glut; 3: Células tipo A incubadas com CdS/Cd(OH)2-Glut-anti-
A 100:1; 4: Células tipo A incubadas com CdS/Cd(OH)2-Glut-anti-A 20:1; 5: 
Células tipo O incubadas com CdS/Cd(OH)2-Glut-anti-A 100:1. 
Figura 28: Histogramas de hemácias marcadas com CdTe - AMS - anti-A. 1: hemácias 
tipo A com QD; 2: hemácias tipo A com QD-anti-A; 3: hemácias tipo O com 
QD-anti-A. 
Figura 29: Gráfico que demonstra a diferença percentual da marcação de hemácias 
em duas concentrações diferentes quantificadas através de citometria de 
fluxo. 
Figura 30: Gráfico evidenciando a diferença percentual da marcação com a variação 
de bioconjugado em cada amostra observada através de citometria de fluxo. 
Figura 31: Dot-plots de hemácias duplo marcadas com QD - AMS e Glicoforina - FITC. 
Em (1) hemácias tipo A evidenciando a dupla marcação e em (2) hemácias 
tipo O demonstrando marcação apenas da glicoforina. 
Figura 32: Gráfico dos percentuais de hemácias marcadas com bioconjugados após 2 
h, 24 h e formalizados, observados através de citometria de fluxo. 
Figura 33: Histogramas de hemácias tipo A (1) e tipo O (2) onde o bioconjugado CdTe 
- AMS - anti-A foram incubados com as duas suspensões celulares a 1%. 
Figura 34: Histogramas de hemácias tipo A (1) e tipo O (2) onde o bioconjugado CdTe 
- AMP - anti-B foram incubados com as duas suspensões celulares a 1%. 
Figura 35: Dot-plots da dupla marcação com os sistemas CdTe - AMS - anti-A e CdTe - 
AMP - anti-B em hemácias tipo AB a 1% nas proporções 1,5:1 (1) e 3:1 (2) 
bioconjugado:células. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
Tabela 1: Descrição dos componentes da síntese com seus respectivos valores para 
cada QD preparado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO ......................................................................................... 16 
CAPÍTULO 2: OBJETIVOS .............................................................................................. 19 
2.1 OBJETIVO GERAL ..................................................................................................... 19 
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................19 
CAPÍTULO 3: REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................. 20 
3.1 NANOESTRUTURAS ................................................................................................ 20 
3.2 QUANTUM DOTS ....................................................................................................... 21 
3.2.1 Aplicações Biológicas ............................................................................................. 23 
3.3 SISTEMA ABO ............................................................................................................. 30 
3.3.1 Grupos Sanguíneos ................................................................................................ 30 
3.3.2 Sistema ABO ............................................................................................................. 31 
3.3.3 Estrutura e Biossíntese do Sistema ABO......................................................... 33 
3.4 CITOMETRIA DE FLUXO ......................................................................................... 35 
3.4.1 Fundamentos ............................................................................................................ 35 
3.4.2 Aplicações em Eritrócitos ...................................................................................... 40 
CAPÍTULO 4: METODOLOGIA EXPERIMENTAL ................................................... 42 
4.1 QUANTUM DOTS DO TIPO CdS/Cd(OH)2 ......................................................... 42 
4.1.1 Síntese e Passivação ............................................................................................. 42 
4.1.2 Funcionalização ....................................................................................................... 43 
4.1.3 Bioconjugação .......................................................................................................... 44 
4.1.4 Imunomarcação Simples com CdS/Cd(OH)2 .................................................. 44 
4.2 QUANTUM DOTS DO TIPO CdTe - AMS e CdTe - AMP ............................. 45 
4.2.1 Síntese e Funcionalização .................................................................................... 45 
4.2.2 Bioconjugação QDs - anticorpos ........................................................................ 48 
4.2.3 Imunomarcação Simples com CdTe - AMS e CdTe - AMP ........................ 49 
4.2.3.1 Formalização (Fixação da Fluorescência) ................................................... 50 
4.2.3.2 Imunomarcação Dupla com CdTe - AMS e CdTe - AMP ........................ 50 
4.3. CARACTERIZAÇÃO ÓPTICA E ESTRUTURAL DOS QDs ......................... 51 
4.3.1 Caracterização Estrutural ...................................................................................... 51 
4.3.2 Caracterização Óptica ............................................................................................ 52 
CAPÍTULO 5: RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................... 54 
5.1 CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E ÓPTICA DOS QDs .......................... 54 
5.1.1 Caracterização Óptica e Estrutural do CdS/Cd(OH)2 ................................... 54 
5.1.2 Caracterização Óptica e Estrutural do CdTe - AMS ..................................... 56 
5.1.3 Caracterização Óptica e Estrutural do CdTe - AMP ..................................... 58 
5.2 ANÁLISES DE CITOMETRIA DE FLUXO ........................................................... 60 
5.2.1 Imunomarcação Simples de Eritrócitos com CdS/Cd(OH)2........................ 60 
5.2.2 Imunomarcações Simples com CdTe ................................................................ 62 
5.2.2.1 Otimização parâmetros da marcação ............................................................ 63 
Variação do Hematócrito .................................................................................................. 64 
Avaliação da Concentração do Bioconjugado ........................................................... 65 
5.2.2.2 Dupla Marcação QD e Glicoforina .................................................................. 65 
5.2.2.3 Estabilidade do Bioconjugado após 24 horas e Formalização .............. 67 
5.2.2.4 Imunomarcações Simples ................................................................................. 68 
Hemácias tipo A com CdTe - AMS - anti-A ................................................................ 68 
Hemácias tipo B com CdTe - AMP - anti-B ................................................................ 69 
5.2.2.5 Imunomarcações Duplas ................................................................................... 70 
5.2.2.6 Discussão ............................................................................................................... 71 
CAPÍTULO 6: CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ................................................. 73 
CAPÍTULO 7: REFERÊNCIAS ....................................................................................... 75 
APÊNDICE I ......................................................................................................................... 80
16 
 
CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO 
 
 Uma ferramenta muito útil como método de diagnóstico é a 
imunofluorescência. Essa técnica baseia-se em uma reação imunológica revelada 
com um corante fluorescente, ou fluorocromos, que conjugado a um anticorpo, 
favorece a localização da reação entre os antígenos e os anticorpos conjugados. 
Estas reações antígeno-anticorpo podem ser visualizadas por microscopias 
adequadas ou outras técnicas como a citometria de fluxo e desta forma, o padrão 
da fluorescência da sonda ou mesmo sua ausência podem ser utilizados na 
obtenção de diagnósticos confiáveis e importantes para a clínica médica. 
 Na maioria dos casos, os marcadores fluorescentes empregados nesta, e 
em outras técnicas de fluorescência, são corantes orgânicos com características 
limitantes como a fotodegradação e a citotoxicidade. No campo de novos classes 
de fluorocromos os quantum dots (QD), ou pontos quânticos, surgem como 
alternativas viáveis e seguras com algumas características superiores aos 
corantes orgânicos mais utilizados. Entre essas características podem ser citadas: 
elevada fotoestabilidade; largo espectro de absorção; estreito espectro de 
emissão; marcação de estruturas biológicas em células ou fixadas ou em 
suspensão; emissão em diversos comprimentos de onda para um mesmo 
material; obtenção de resultados com tempos de incubação da ordem de alguns 
minutos e baixa citotoxicidade (SANTOS, 2008). 
 Foi publicado em 1982 por Henglein e colaboradores um dos primeiros 
trabalhos sobre síntese e caracterização óptica de QDs de Sulfeto de Cádmio 
(CdS) e co-colóides de Sulfeto de Cádmio e Zinco (CdS-ZnS) obtidos em meio 
coloidal aquoso (HENGLEIN, 1982). Porém, apenas em 1998 é que essa nova 
classe de materiais passou a ser utilizada com finalidades para análises 
biológicas (ALIVISATOS, 1998; CHAN, 1998). Desde então, inúmeras aplicações 
vem surgindo em diversos campos das ciências da saúde como no diagnóstico de 
câncer (NIDA et al, 2005), em métodos microbiológicos (XUE, 2009) e em 
imunohematologia (LIRA, 2010). 
 A aplicação biológica dos QDs é possível através da funcionalização das 
nanopartículas onde os nanocristais inorgânicos são recobertos com moléculas, 
geralmente orgânicas, que farão o elo entre estes e os alvos biológicos que se 
pretendem marcar. Podendo ser efetuadas funcionalizações com estruturas 
complexas usando, por exemplo, concanavalina (SANTOS et al., 2006) ou 
imunoglobulinas (FARIAS et al., 2005). A funcionalização com imunoglobulinas, 
por exemplo, permite a marcação de antígenos específicos, tais como os do 
sistema ABO, importantespara a classificação sangüínea. 
 O sistema ABO norteia transfusões sangüíneas e, até mesmo, transplantes 
de órgãos, visto a distribuição destes antígenos em várias células do corpo. 
Dependendo da tipagem sangüínea de um indivíduo, a imunoglobulina anti-A e/ou 
anti-B presentes no soro do indivíduo naturalmente podem constituir uma barreira 
para as transfusões de sangue e para o transplante de órgãos ABO incompatíveis 
(BATISSOCO & NOVARETT, 2003). Desta forma, transfusões de sangue com 
antígenos não compatíveis podem levar a graves reações imunológicas 
chamadas reações ou incidentes transfusionais que podem ocorrer com o 
paciente durante ou após a transfusão sangüínea podendo levá-lo a morte 
(LUDWIG & ZILLY, 2011). 
 Apesar dos anticorpos monoclonais anti-A e/ou anti-B reconhecerem e 
aglutinarem a maioria dos grupos do sistema ABO, a determinação daqueles que 
apresentam baixa expressão de antígenos é laboratorialmente trabalhosa, tendo 
que algumas vezes utilizar protocolos morosos e até mesmo técnicas de biologia 
molecular. Além disso, nos subgrupos ou variantes, há uma distinção na 
quantidade de antígenos e consequentemente também no padrão de distribuição 
destes nos eritrócitos A, B e O (H) (HOSOI, 2008) o que pode dificultar o método 
de hemaglutinação utilizado comumente. 
 Desta forma, a imunofluorescência com fluorocromos mais estáveis e 
versáteis, seja avaliada por microscopias ou pela citometria de fluxo, apresenta-se 
como uma ferramenta útil para as análises imunohematológicas, e diagnósticas, 
através da verificação dos padrões e perfis de intensidade de fluorescência 
característicos de cada tipo celular analisado. Por conseguinte, estes aspectos 
motivaram a realização deste trabalho onde QDs foram preparados, 
caracterizados e bioconjugados a anticorpos do sistema ABO para a fenotipagem 
de eritrócitos através da citometria de fluxo. Foram realizadas marcações com 
QDs com emissões no verde e no laranja, além de duplas marcações simultâneas 
com corantes orgânicos e QDs, e com dois QDs distintos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO 2: OBJETIVOS 
 
 
 2.1 OBJETIVO GERAL 
 
 Marcação de antígenos eritrocitários do sistema ABO com QDs do tipo 
CdS/Cd(OH)2 e CdTe conjugados a anticorpos anti-A e anti-B, respectivamente, 
para imunofenotipagem do sistema ABO usando quantificação por citometria de 
fluxo como metodologia de avaliação. 
 
 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
1. Síntese de QDs do tipo CdS/Cd(OH)2 em meio aquoso e 
funcionalizados com glutaraldeído; 
2. Síntese de QDs do tipo CdTe em meio aquoso e funcionalizados com 
ácido mercaptosuccínico (AMS) ou ácido mercaptopropiônico (AMP); 
3. Caracterização óptica e estrutural dos nanocristais obtidos; 
4. Bioconjugação dos nanocristais aos anticorpos anti-A e anti-B; 
5. Imunomarcação, com os bioconjugados, eritrócitos do tipo A e do tipo B 
usando o tipo O como controle negativo; 
6. Quantificação das células marcadas por citometria de fluxo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO 3: REFERENCIAL TEÓRICO 
 
 
 3.1 NANOESTRUTURAS 
 
 Nos últimos anos, pesquisas em química e física têm focado em grande 
parte na síntese de nanopartículas de semicondutores, metálicas e/ou 
magnéticas, tais como: nanofios, pontos quânticos (quantum dots), nanotubos e 
nanobastões. 
 As razões para isso são as novas propriedades que esses materiais 
apresentam por estarem em escala nanométrica, as quais geram novas 
aplicações em vários campos extremamente importantes, como, por exemplo, em 
catálise, revestimentos, têxteis, armazenamento de dados, biotecnologia e 
indústrias biomédicas e farmacêuticas (DRBOHLAVOVA et al., 2009). 
 A utilização de nanopartículas, com ênfase na química coloidal, aliada às 
técnicas microscópicas, eletroquímicas e espectroscópicas, tem gerado grande 
contribuição para a melhoria da visualização e caracterização de materiais 
biológicos nas últimas décadas. O uso de diferentes sondas nanoestruturadas 
(como, por exemplo, nanopartículas de metais e óxidos, nanotubos de carbono e 
nanoestruturas poliméricas) associadas a biomoléculas vem sendo utilizadas 
tanto em técnicas físico-químicas que auxiliam uma melhor compreensão de 
sistemas biológicos bem como em ferramentas terapêuticas. A síntese de novos 
marcadores fluorescentes, como os QDs, tem possibilitado o aumento da 
capacidade de visualização, manipulação, caracterização de sistemas biológicos 
e no desenvolvimento de aplicações médicas (CHAVES, 2006). 
 
 
 
 
 3.2 QUANTUM DOTS 
 
 Quantum dots, ou nanocristais de semicondutores, são uma nova classe de 
marcadores fluorescentes de tamanhos nanométricos constituídos de poucas 
centenas a poucos milhares de átomos que exibem propriedades ópticas 
diferentes dos cristais macroscópicos do mesmo material, conhecidos como 
“bulks”. (MICHALET, 2008). 
 Eles são geralmente formados de materiais binários de átomos dos grupos 
II - VI, III - V ou IV - VI da tabela periódica e possuem propriedades ópticas 
diferenciadas dos materiais originais macroscópicos (devido aos efeitos de 
quantização dos estados eletrônicos que descrevem o material) as quais podem 
superar as apresentadas pelos corantes orgânicos convencionais (MEDINTZ, 
2005; MICHALET, 2008). Controlando-se o tamanho dos quantum dots, pode-se 
conseguir a sintonização do comprimento de onda de emissão para um mesmo 
material. As partículas menores tendem a emitir em regiões próximas ao azul, 
enquanto que as maiores devem apresentar luminescência em regiões mais 
próximas ao vermelho chegando ao infravermelho (CHAVES, 2006; 
DRBOHLAVOVA, 2009). 
 A Figura 1 mostra dez diferentes emissões de cor do quantum dot 
CdSe/ZnS excitado com uma lâmpada próxima ao UV (Ultravioleta). Da esquerda 
para a direita, do azul ao vermelho, a emissão máxima é localizada em 443, 473, 
481, 500, 518, 543, 565, 587, 610 e 655 nm. 
 
 
Figura 1: Emissão de suspensões contendo nanocristais de CdSe/ZnS de diferentes 
diâmetros, excitadas com lâmpada na região do UV. (FORTINA, 2005) 
A síntese das nanopartículas pode ser feita basicamente de duas formas: 
“top-down” e “bottom-up”. No caso do “top-down”, se constrói um material 
macroscópico e esse vai sendo desgastado, por um laser, até se chegar à 
estrutura e no tamanho desejado. Já no “bottom-up”, o material é construído 
juntando-se átomos e/ou moléculas através de reações químicas (SCHMID, 
2004). 
 A síntese coloidal, um exemplo de síntese bottom up, ocorre por reações 
que permitem relativo controle da nucleação e crescimento dos nanocristais. O 
precursor é uma molécula, ou um complexo, que contem um ou mais átomos 
necessários para o crescimento do nanocristal que uma vez introduzidos na 
reação, se decompõem, dando forma a uma nova espécie reativa (os 
monômeros). Estes irão causar a nucleação e o crescimento dos nanocristais 
suspensos em meio líquido (CHAVES, 2004). 
 A síntese coloidal de QDs pode ser realizada em meio orgânico ou aquoso. 
A síntese em solvente orgânico envolve tipicamente três principais componentes: 
um ou vários precursores organometálicos, algum surfactante orgânico e um 
solvente, todos misturados juntos no mesmo recipiente (MICHALET, 2008). Neste 
caso o crescimento dos cristais é controlado pela reação a temperaturas altas 
(200 - 300oC). Recentemente QDs fluorescentes usados para imagem biológica 
tem sido obtidos através de reações químicas de precursores inorgânicos a 
temperaturas relativamente baixas (80-90oC). De uma forma geral a síntese dos 
QDs envolve duas etapas principais, aformação do núcleo (core) e a passivação, 
que é a formação de uma casca de algumas monocamadas de átomos 
(conhecida por shell). A função desta nova camada é reduzir a quantidade de 
defeitos presentes na superfície dos nanocristais, que surgem a partir de ligações 
não compartilhadas. A nova camada balanceia o equilíbrio iônico destas ligações 
aumentando a eficiência da emissão original do cristal através da formação de 
uma camada fina de um novo semicondutor com melhor fluorescência. A 
formação da casca pode ser induzida pela deposição de outro composto numa 
etapa posterior á formação do core ou pela reação de hidrólise dos agentes 
estabilizantes a base de tióis, os quais acabam sendo incorporados na estrutura 
externa das partículas. Esta deposição de certa forma ocorre de forma não 
controlada e contínua. 
 A ligação com sistemas biológicos se dá através da funcionalização dos 
nanocristais, uma etapa na qual pequenas moléculas orgânicas, capazes de 
formar interações químicas com a superfície dos quantum dots, introduzem novos 
grupos funcionais a estes para que possam se complexar com diferentes 
componentes biológicos (CHAVES, 2006). A Figura 2 mostra o esquema de um 
quantum dot passivado e funcionalizado, pronto para a bioconjugação. 
 
 
Figura 2: Esquema de um quantum dot (QD) passivado (camada cinza) e funcionalizada 
com Glutaraldeído. 
 
 
 3.2.1 Aplicações Biológicas 
 
 Os QDs são nanopartículas com notáveis propriedades ópticas com 
aplicações in vivo, in vitro e in situ (CHAN, 2002; SUKHANOVA & NABIEV, 2008). 
Quando conjugados à biomoléculas específicas QDs tem sido utilizados em 
hibridização de DNA, imunoensaios e imagens fluorescentes de cortes 
histológicos com tempo limitado. Podemos dividir suas aplicações em dois 
principais grupos, a saber: biosensores e marcadores para imagens biológicas 
(DRBOHLAVOVA, 2008). 
 Diferentes cristais apresentando diferentes cores de emissão podem ser 
usados para imagens simultâneas em marcações internas e/ou de superfícies de 
células vivas. Além disso, com uma camada inerte recobrindo-os acredita-se que 
os nanocristais adquirem menor toxicidade em relação a alguns corantes 
orgânicos. Outra importante vantagem é a alta fotoestabilidade que permite o 
monitoramento em tempo real de caminhos/processos intracelulares por longos 
períodos, minutos ou até horas (CHAN, 2002). Segundo Chan & Nie (1998), a 
emissão do CdSe (t1/2= 960 s) é quase 100 vezes maior que a da rodamina 6G 
(t1/2= 10 s). A Figura 3 mostra o efeito do fotoescurecimento em uma marcação de 
fibroblastos com CdSe- estreptavidina e AlexaFluor 488 (CHAN, 1998). 
 
 
Figura 3: Fotodegradação em função do tempo. Linha superior: antígenos nucleares 
marcados com CdSe 630 estreptavidina (vermelho) e microtúbulos marcados com Alexa 
Fluor 488 (verde), simultaneamente. Linha inferior: microtúbulos foram marcados com 
quantum dots 630-estreptavidina (vermelho), e antígenos nucleares foram corados com 
Alexa 488 (verde). O tempo de exposição é indicado em segundos (MEDINTZ, 2005). 
 
 
 Os quantum dots são altamente luminescentes (a intensidade de 
fluorescência de um único CdSe é de aproximadamente 20 moléculas de 
rodamina 6G) (CHAN, 1998) e apresentam larga faixa de comprimento de onda 
para excitação com picos de fluorescência simétricos e larguras relativamente 
estreitas (20 - 50 nm). A Figura 4 ilustra o exemplo comparativo entre os perfis de 
absorção e emissão do CdSe e da Rodamina 6G. 
 
 
Figura 4: Comparação dos perfis de emissão e excitação entre a Rodamina 6G e CdSe 
(ua: unidades arbitrárias) (CHAN, 2002). 
 
 Eles possuem comprimento de fluorescência ajustável pelo tamanho da 
partícula. Sob circunstâncias ideais, estes nanocristais podem ter um elevado 
rendimento quântico, elevada absorbância e faixas estreitas de emissão podendo 
também fornecer diferentes emissões (mudando o tamanho dos nanocristais) 
usando um único comprimento de onda para excitação. O que significa que com 
diferentes composições químicas e diâmetros eles podem substituir todos os 
corantes orgânicos conhecidos utilizados nas suas atuais áreas de aplicação para 
detecção e diagnóstico médico (SUKHANOVA & NABIEV, 2008), como 
demonstrado na Figura 5. Teoricamente, com o uso de seis cores e dez níveis de 
intensidade, pode-se marcar um milhão de proteínas ou seqüências de ácidos 
nucléicos (CHAN, 2002). 
 
Figura 5: Comparação entre diferentes quantum dots e fluoróforos utilizados em análises 
(SUKHANOVA & NABIEV, 2008, adaptada) 
 
Para que os QDs tenham especificidade por células e tecidos é necessário 
fazer a suas conjugações com biomoléculas que sejam capazes de reconhecer 
moléculas alvo nas células ou tecidos, como por exemplo, as imunoglobulinas. 
Uma boa conjugação é aquela onde o sistema resultante tem compatibilidade 
com os sistemas biológicos, como: pH fisiológico, baixa toxicidade, isotonicidade, 
hidrofilicidade e que as propriedades fluorescentes das sondas e das 
biomoléculas conjugadas sejam mantidas. 
Os tipos de conjugações de QD com biomoléculas mais conhecidos são: 
(1) utilização de um agente de acoplamento, como por exemplo, o EDC, 1-etil-3-
(3-dimetilaminopropil) carbodiimida; (2) ligação direta da superfície do QD com 
proteínas que tenham grupamentos tiol ou resíduos de polihistidina; (3) utilizando 
o glutaraldeído formando bases de Schiff com a superfície do QD a qual contenha 
grupamento amina, e após redução do glutaraldeído forma-se uma amina 
secundária estável, e; (4) adsorção ou ligação não covalente (HERMANSON, 
2008). 
Especificamente para a conjugação de pontos quânticos funcionalizados 
com moléculas que possuam grupamento carboxilatos como o ácido 
mercaptopropiônico (AMP) ou o ácido mercaptosuccínico (AMS), pode-se utilizar 
os agentes de acoplamento o 1-etil-3-3-dimetilaminopropil-carbodiimida (EDC) e o 
N-hidroxi-sulfo-sucinamida (sulfo-NHS) para ativar esse carboxilatos e possibilitar 
a formação de ligações amidas entre o QD e a proteína que se deseja conjugar. O 
sulfo-NHS por meio de formação de seu intermediário (éster), que apresenta 
maior estabilidade frente ao formado pelo EDC, ao interagir com uma amina 
primária oriunda da proteína, promove a formação da ligação amida pela 
conjugação. Isso ocorre via formação do intermediário reativo instável o-
acilisouréia, produto de um carbono do grupamento ˗N=C= (carbodiimida) da 
molécula do EDC e o grupamento carboxilato dos QDs (HERMANSON, 2008). A 
Figura 6 ilustra a estrutura do AMP e AMS. 
 
Figura 6: Estruturas químicas dos Ácidos mercaptopropiônico AMP (superior) e 
mercaptosuccínico AMS (inferior). 
O glutaraldeído é uma molécula que contém dois grupamentos aldeídicos, 
sendo um em cada uma de suas extremidades, esse fato possibilita a ligação 
dessa molécula à porção amina das proteínas, formando bases de Schiff. Por 
possuir essa afinidade por aminas o glutaraldeído pode ser usado como agente 
funcionalizante inespecífico para qualquer tipo de proteínas ou como agente de 
ligação entre os QDs e biomoléculas capazes de se ligar especificamente a certas 
estruturas biológicas, como os anticorpos. Para estas finalidades o glutaraldeído 
deve ser utilizado em concentrações menores que 0,1%, pois em concentrações 
maiores pode causar fixação de estruturas biológicas, bem como fazer ligações 
indesejáveis ou inativar biomoléculas (MENEZES, 2006). 
Um outro mecanismo de conjugação que pode ser feito como 
anteriormente citado é a adsorção. Este é um termo utilizado para descrever o 
fenômeno no qual moléculas que estão presentes em um líquido ou gás, 
concentram-se espontaneamente sobre uma superfície sólida. O mecanismode 
adsorção é baseado em atrações hidrofóbicas (Van der Waals do tipo London) ou 
por interação eletrostática, sendo, portanto, um método simples e flexível, 
largamente utilizado atualmente e será o método adotado nesta monografia. Na 
adsorção não há desnaturação do anticorpo como pode acontecer quando se usa 
o EDC, sendo esta um método economicamente satisfatório pois dispensa o uso 
de outras substâncias. 
A adsorção de proteínas é um processo que tem um papel fundamental na 
área de biomateriais. Na verdade, superfícies de biomateriais em contato com o 
meio biológico, como sangue ou soro, são imediatamente revestidos por 
proteínas. A adsorção passiva tem sido estudada extensivamente para 
imobilização de imunoglobulinas em microplacas de poliestireno e em 
microesferas (HERMANSON, 2008). 
Independentemente do tipo de conjugação utilizado, três fatores são 
crucias para o resultado final do conjugado: (1) o planejamento estratégico da 
conjugação; (2) a capacidade de controlar com precisão as proporções de 
QD/proteína; (3) resultados homogêneos com orientação homogênea das 
proteínas na superfície do QD. No entanto, quando um desses três fatores não é 
seguido criteriosamente podem ser produzidos conjugados de proteínas que não 
são funcionais (MEDINTZ, 2005) 
É grande o número de trabalhos de marcação de diversos antígenos como 
proteínas e carboidratos, em vários imunoensaios (DRBOHLAVOVA, 2009). 
Kerman et al. (2007) estudou a aplicação dos quantum dots em imunoensaio tipo 
sanduíche para detecção de antígeno prostático específico total (TPSA), um 
importante marcador tumoral (KERMAN, 2007). Yang et al. (2004) desenvolveu 
um imunoensaio para detecção de traços abaixo de 0,1 ng/mL de antígenos de 
Hepatite B com sucesso (YANG, 2004; SEYDACK, 2005). Já Goldman et al. 
(2004), desenvolveu vários trabalhos com anticorpos IgG para marcação de 
diversos antígenos como, por exemplo, toxina colérica e enterotoxina 
estafilocócica B (GOLDMAN, 2004; HUANG, 2005). A Figura 7 ilustra um exemplo 
de duas possíveis ligações dos quantum dots a anticorpos. 
 
Figura 7: Bioconjugação de quantum dot (funcionalizado com terminações carboxílicas) a 
anticorpos mostrando dois tipos de ligação, covalente e sufidril-amina (GAO, 2005, 
adaptada). 
 
 
 Alguns passos para o uso de anticorpos conjugados a quantum dots são 
descritos por Zhang et al. (2003) onde a imunoreação ocorre no mesmo meio em 
que o antígeno está disperso. Inicialmente os anticorpos são ligados a partículas. 
Então esta suspensão é incubada com o meio contendo antígenos. Considerando 
que uma molécula de antígeno pode ligar-se a dois anticorpos (e, portanto, a 
nanocristais bioconjugados a eles), a imunoreação resulta, assim, em um 
processo de agregação. A detecção é tipicamente baseada nas mudanças das 
propriedades ópticas, uma vez que duas ou mais partículas estão em íntima 
proximidade (ZHANG, 2003; SEYDACK, 2005). 
 No campo da hematologia, podemos citar alguns trabalhos publicados que 
descrevem o uso dos quantum dots CdSe/ZnS para marcação fixa de eritrócitos 
humanos (TOKUMASU, 2003), linfomas de células T (HOSHINO, 2004) e 
aplicações em citometria de fluxo (LIRA, 2010). 
 
 
3.3 SISTEMA ABO 
 
 
3.3.1 Grupos Sanguíneos 
 
 O mosaico fluido no qual constitui a membrana eritrocitária e os sistemas 
de grupos sanguíneos são testemunhos inequívocos da hereditariedade onde a 
diversidade expressa na membrana eritrocitária define a identidade biológica de 
cada indivíduo (MURADOR, 2007). 
 O significado biológico da grande variedade de antígenos eritrocitários 
ainda é pouco compreendido. E é possível que vários destes antígenos devem ter 
proporcionado uma vantagem seletiva no passado para terem alcançado uma 
freqüência maior que 1% na população humana. Algumas das funções atribuídas 
a esses antígenos na superfície das hemácias incluem: transporte de membrana, 
adesão celular, atividade enzimática e participação na eritropoiese (DANIELS, 
2001). 
 A maioria dos antígenos eritrocitários corresponde a moléculas de 
carboidratos associadas a proteínas da membrana plasmática, formando as 
glicoproteínas, ou a moléculas de fosfolipídios da membrana, que forma os 
glicolipídios (SAMPEDRO, 1998). A Figura 8 mostra um esquema de membrana 
eritrocitária na qual estão representados alguns antígenos de grupos sangüíneos. 
 
Figura 8 - Modelo da membrana eritrocitária que carrega os grupos sangüíneos. (HOSOI, 
2008, adaptada) 
 
 De acordo com International Society of Blood Transfusion (ISBT), existem 
308 antígenos reconhecidos, dos quais 270 estão descritos em 30 sistemas de 
grupos sanguíneos (DANIELS, 2001). O conhecimento destes tem contribuído 
para o entendimento de alguns dos mecanismos básicos da herança genética e a 
mais de um século de sua descoberta continua sendo de grande interesse prático 
e conceitual (DEL PEON-HIDALGO, 2002). 
 
 
3.3.2 Sistema ABO 
 
 Em 1900 o cientista austríaco Karl Landsteiner encontrou, através de 
diferenças sorológicas no sangue de diferentes pacientes, três diferentes tipos 
sangüíneos (A, B, e O) (LANDSTEINER, 1900). Dois anos depois, em 1902, von 
DeCastello e Stürli, seus colaboradores, descobriram um quarto tipo, o AB (VON 
DECASTELLO & STÜRLI, 1902). Estava formado assim o primeiro grupo 
sanguíneo da história. 
 O sistema de grupo sangüíneo ABO é até hoje considerado o mais 
importante sistema de grupo sangüíneos na medicina clínica transfusional e é 
caracterizado pela expressão de dois antígenos carboidratos (A e B) expressados 
na membrana das hemácias. Não estando restritos apenas à membrana dos 
eritrócitos, podendo ser encontrados também em uma grande variedade de 
células como linfócitos, plaquetas, endotélio capilar venoso e arterial, células 
sinusoidais do baço, medula óssea, mucosa gástrica, além de secreções e outros 
fluidos como saliva, urina e leite (BATISSOCO & NOVARETTI, 2003). Possui 
também dois anticorpos plasmáticos (anti-A e anti-B) que aparecem após o 
nascimento (MATTOS & MOREIRA, 2004; HOSOI, 2008). 
 Indivíduos que não apresentam um antígeno particular de grupo sangüíneo 
podem produzir anticorpos naturais contra aquele antígeno ausente. Quando os 
eritrócitos do indivíduo possuem antígeno A e/ou B, os anticorpos 
correspondentes, anti-A e/ou anti-B, estão ausentes no soro. Por outro lado, se o 
indivíduo carece de antígenos A e/ou B, o plasma contém o anticorpo contra 
ambos os antígenos ausentes. Por conseguinte, o indivíduo do tipo A terá 
anticorpos anti-B no soro; o indivíduo do tipo B terá anticorpos anti-A no soro; o 
indivíduo do tipo O terá isoanticorpos anti-A e anti-B no soro e, o indivíduo AB não 
apresentará isoanticorpos no soro (BATISSOCO & NOVARETTI, 2003; HOSOI, 
2008). 
 As imunoglobulinas anti-A e anti-B podem ser IgM, IgG ou IgA e alguns 
soros podem conter as três classes. Indivíduos não imunizados possuem, 
predominantemente IgM, embora, IgG e IgA também possam estar presentes. 
Estes anticorpos não estão presentes em recém nascidos, mas aparecem no 
primeiro ano de vida. Os anticorpos detectados no soro de neonatos são 
usualmente IgG de origem materna, porém podem ocasionalmente ser IgM 
produzidas pelo feto. Geralmente, aglutininas são detectadas primeiro aos três 
meses de idade e continuam aumentando em título até alcançar níveis adultos 
entre 5 e 10 anos (DANIELS, 2001). 
 Ainda não está totalmente esclarecida a razão pela qual o organismo é 
estimulado a produzir anticorpos contra os antígenos A ou B ausentes, todavia, 
aparentemente existem antígenos semelhantes às estruturas ABO na natureza 
que de algum modo produzem sensibilização natural. A hipótesemais 
disseminada é a de uma reação cruzada com epítopos de antígenos expressos 
em bactérias, vírus, plantas e até mesmo em alimentos que possuem estrutura 
similar a dos antígenos A e B levando a produção destes anticorpos (DANIELS, 
2001; HOLSOI, 2008). 
 Esse perfil que o sistema ABO apresenta quanto a distribuição de 
antígenos e presença de anticorpos naturais circulantes contra o antígeno 
ausente gera um grande obstáculo para a transfusão sangüínea podendo resultar 
em respostas imunológicas expressivas entre os anticorpos preexistentes que se 
ligam às células transfundidas, ou os anticorpos do sangue transfundido se ligam 
às células do paciente (WITTIG, 2006). 
 Estas reações podem provocar: hemólise imediata, mediada pelo sistema 
complemento; fagocitose extensiva das hemácias revestidas por anticorpos e 
complemento; liberação exacerbada de hemoglobina que pode chegar a níveis 
tóxicos para células renais; febre alta; choque; coagulação intravascular 
disseminada, etc. (LUDWIG & ZILLY, 2007). 
 
 
3.3.3 Estrutura e Biossíntese do Sistema ABO 
 
 Os alelos responsáveis por esses antígenos não os codificam diretamente, 
pois são carboidratos, e não proteínas. Eles codificam enzimas chamadas 
glicosiltransferases, que adicionam moléculas de carboidrato às moléculas de 
proteína ou de lipídio presentes na membrana celular da hemácia anticorpos 
(DANIELS, 2001). No caso do sistema ABO elas são responsáveis pela 
transferência de resíduos específicos de açúcar. Estas enzimas catalisam as 
reações de transglicolização entre o substrato aceptor e o açúcar receptor 
(BATISSOCO & NOVARETTI, 2003). 
 A transferase A, a α1→3-N-acetilgalactosamina transferase, e a transferase 
B, a α1→3-N-galactosil transferase, têm estruturas similares, sendo que sua 
especificidade será determinada pelos aminoácidos localizados próximos ao sítio 
de ligação da enzima com seu respectivo açúcar resultando na adição dos 
resíduos de N-acetilgalactosamina (GalNAc), transferase A, e Galactose (Gal), 
transferase B, na ligação α1→3 da galactose terminal do antígeno H. O grupo 
sangüíneo AB apresenta a atividade das duas transferases (A e B), enquanto o 
grupo O não possui as transferases A e B, mas apresenta o antígeno H em 
grande quantidade na superfície das hemácias tipo O pela ação da transferase H. 
 O primeiro passo para síntese dos antígenos ABO é a adição da L-fucose 
na ligação α1→2 no terminal galactose (Gal) de um precursor comum ligado a 
lipídeos ou proteínas pela α1,2-fucosiltransferase (H transferase), resultando no 
antígeno H ou O. Seis diferentes tipos de precursores são conhecidos, sendo o 
Tipo 1 (Galβ1→3GlcNAcβ-R) e o Tipo 2 (Galβ1→4GlcNAcβ-R) as estruturas mais 
freqüentes. O Tipo 1 é a substância em secreções e tecidos e o Tipo 2 é o 
antígeno da superfície da hemácias. Os antígenos A, B, O (H) na superfície dos 
eritrócitos são definidos por carboidratos determinantes, 
GalNAcα1→(Fucα1→2)3Galβ1→ 4GlcNAcβ-R, Galα1→(Fucα1→ 
2)3Galβ1→4GlcNAcβ-R e (Fucα1→ 2)Galβ1→ 4GlcNAcβ-R, respectivamente, os 
quais são sintetizados a partir da estrutura do antígeno H pela ação das 
glicosiltransferases específicas produtos dos genes ABO (PORETZ, 1972; 
SHACHTER, 1973; HAKOMORI, 1984). 
A Figura 9 esquematiza a biossíntese dos antígenos ABO a partir do 
precursor tipo 2 que está na superfície dos eritrócitos. 
 
 
Figura 9: Síntese dos antígenos ABO. (HOSOI, 2008, adaptada) 
 
 
3.4 CITOMETRIA DE FLUXO 
 
 
3.4.1 Fundamentos 
 
 A citometria de fluxo é um recurso emergente na medicina que permite 
uma rápida análise qualitativa e quantitativa de células em suspensão (NAKAGE, 
2005). Por meio desta técnica, propriedades físicas e biológicas de uma célula 
podem ser estudadas. População e subpopulações celulares em uma amostra 
podem ser determinadas pelo número e tipo de antígeno da membrana celular, 
citoplasma ou mesmo do núcleo, propiciando a sua quantificação e classificação 
imunológica (imunofenótipo) (GUILHERME, 2008). Ela também possibilita a 
análise multiparamétrica, fornecendo informações adicionais tais como análise 
simultânea de dois ou mais antígenos, e informações morfológicas (CAVALCANTI 
JÚNIOR, 2004). 
 O citômetro de fluxo é o aparelho utilizado para avaliação da emissão de 
fluorescência das células (FACS – “Fluorescence Activated Cell Sorter”) podendo 
alguns aparelhos serem capazes de separar fisicamente as células, de acordo 
com as características citométricas estabelecidas. 
 Sua estrutura é composta basicamete de três diferentes sistemas físicos 
complementares: 
1. de fluxo: onde com o auxílio de um líquido isotônico as células são 
transportadas, uma a uma, na câmara de fluxo ou “flow cell” para que 
sejam posicionadas no centro de um feixe de laser; 
 
2. óptico: que consiste em um feixe de laser que ao interagir com a célula 
sofre espalhamento e pode gerar fluorescência, que é captada por um 
conjunto de filtros ópticos que separam estas pelos seus comprimentos de 
onda para detecção; 
 
3. eletrônico: responsável pela conversão dos sinais de luz detectados em 
sinais eletrônicos que são processados e analisados por sistema 
computacional. 
 
 A Figura 10 mostra uma representação de um citômetro FACScalibur 
(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) para leitura de cinco parâmetros. 
 
Figura 10: Configuração de filtros e espelhos para compor 5 parâmetros específicos: 
FSC, SSC e fluorescências verde, laranja e infravermelho (> 650nm) (BD Bioscience, 
2000, adaptada). 
 
 A suspensão é introduzida por aspiração no citômetro, e conduzida através 
de um fluxo de líquido isotônico até a câmara de fluxo. Nesse compartimento, o 
laser incide sobre cada célula, sendo uma parte, bloqueada frontalmente 
("Forward Scatter" ou FSC) e outra parte dispersada lateralmente ("Side Scatter" 
ou SSC). A fração FSC é relativa ao tamanho da célula e a SSC representa a 
complexidade intracitoplasmática, que nas células sangüíneas caracteriza a 
granulosidade interna (CAVALCANTI JÚNIOR, 2004). Correlacionando as 
medidas FSC e SSC é possível diferenciar grupos celulares em uma população 
de células heterogêneas. Na Figura 11 são representadas diferentes populações 
celulares onde o eixo X do gráfico representa a complexidade e granulosidade da 
célula (SSC) e o eixo Y representa o tamanho da célula (FSC). 
 
Figura 11: Perfis de dot-plots de sangue total características das populações celulares 
nos parâmetros FSC x SSC e posterior separação em Gates para análise das populações 
mais homogêneas separadamente. 
(http://www.dpmdiagnostica.com.br/produtos_infinicyt.html, 2012) 
 
 Uma vez que uma célula ou partícula passa através da luz laser, os sinais 
de SSC, FSC e os sinais de fluorescência, são encaminhados para 
fotomultiplicadoras (detectores) através de um sistema de espelhos e filtros 
ópticos. A detecção da fluorescência de um corante particular é otimizada através 
da presença de um filtro na frente da fotomultiplicadora, o qual permite que 
apenas uma faixa estreita de comprimento de onda atinja o detector. Esta faixa 
espectral de luz está perto do pico máximo de emissão do corante fluorescente. 
Esses filtros são chamados bandpass (passa banda). Por exemplo, o filtro 
utilizado para o FITC (Isotiocianato de Fluoresceína) é rotulado 530/30. Este 
número dá as características da banda espectral transmitida: 530 ± 15 nm. Outros 
filtros utilizados no citômetro de fluxo são tipo shortpass (filtros que transmitem 
comprimentos de onda da luz igual ou inferior a um determinado comprimento de 
onda), e o filtro tipo longpass, (o qual transmitem comprimentos de onda igual ou 
superior a um determinado comprimentode onda) (BD Biosciences, 2000). 
A incidência do laser sobre fluoróforos causará a emissão de luz de 
diferentes comprimentos de onda (por exemplo: FITC - verde; Ficoeritrina - 
laranja) que será captada pelos detectores/filtros (FL1, FL2), cujo número e 
quantidade será dependente de cada aparelho (CAVALCANTI JUNIOR, 2004), 
gerando o gráfico de resultados do tipo histogramas ou dot plot (Figura 11). Caso 
as células expressem o antígeno em estudo, elas serão detectadas pelo citômetro 
através da fluorescência emitida pelo marcador ligado ao anticorpo. 
No caso da expressão de mais que um antígeno de interesse, pode-se 
efetuar marcação múltipla e as células mostrarão diferentes combinações de 
anticorpos - fluoróforos, dando o perfil multiparamétrico que a técnica possui, ou 
seja, várias avaliações podem ser feitas ao mesmo tempo. 
A imunofenotipagem consiste na identificação de populações de células 
distintas com diferentes antígenos marcados com anticorpos fluorescentes 
específicos (ROITT, 1999). Caso as células expressem o antígeno em estudo, ela 
será detectada pelo citômetro, pois estarão marcadas com um anticorpo 
conjugado a um fluorocromo. No caso das mesmas expressarem outros 
antígenos para os quais se inclui a incubação com diferentes anticorpos 
específicos, as células mostrarão diferentes combinações de anticorpos-
fluoróforos. 
 A Figura 12 mostra um exemplo de gráfico gerado para análise de 
fluorescência. 
 
Figura 12: Exemplo de gráfico de citometria de fluxo mostrando em seus quatro 
quadrantes a positividade e negatividade de marcação para dois antígenos celulares 
numa população celular sendo analizados por fluoróforo detectados nos filtros FL1 e FL2 
(verde e laranja, respectivamente). 
 
 
3.4.2 Aplicações em Eritrócitos 
 
 Segundo Weiss (2002) a análise dos eritrócitos pode ser realizada usando 
sangue total com anticoagulante ou com hemácias isoladas da camada 
eritrocitária após a centrifugação. As aplicações da citometria de fluxo na 
avaliação dos eritrócitos geralmente consiste na quantificação de reticulócitos, 
pesquisa de eritroparasitas e detecção de anticorpos anti-eritrocitários (WEISS, 
2000; NAKAGE, 2005). Além de detecção e quantificação de pequenas 
populações de eritrócitos com alterações genéticas, de hemácias transfundidas e 
de hemácias fetais em sangue materno (GARRATTY & ARNDT, 1999) e também 
registros de trabalhos com imunofenotipagem do sitema ABO. 
Farias e col. (2005) mostraram um novo capítulo nesse campo da 
imunohematologia, bioconjugando QDs a anticorpos anti-A na marcação de 
eritrócitos humanos e sua avaliação por microscopia de fluorescência Figura 13. 
Outro trabalho utilizando QDs em células sanguíneas humanas foi o realizado por 
Lira e cols. (2010) no qual análises por citometria de fluxo foram realizadas. 
 
Figura 13: Esquematização da bioconjugação QDs-anti-A e sua ligação aos antígenos 
eritrocitários (1) e imagens de microscopia de fluorescência de hemácias (2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 2 
CAPÍTULO 4: METODOLOGIA EXPERIMENTAL 
 
 
4.1 QUANTUM DOTS DO TIPO CdS/Cd(OH)2 
 
 
 4.1.1 Síntese e Passivação 
 
 A síntese do CdS seguida da sua passivação com Cd(OH)2 foi realizada 
segundo metodologia Weller e colaboradores (FOJTIK, 1984). A funcionalização 
com Glutaraldeído (Glut) seguiu o trabalho de Menezes (2006). 
 O primeiro passo é a preparação das nanopartículas de sulfeto de cádmio 
(CdS). Em um balão contendo água deionizada (95,5 mL) são adicionados 
estabilizante polifosfato de sódio [(NaPO3)]n 0,0051 g/mL (com n igual à 9) (2,0 
mL) e uma solução 0,01 molL-1 perclorato de cádmio Cd(ClO4)2 (2,5 mL) 
preparado a partir de óxido de cádmio (CdO) (0,642 g) e ácido perclórico (HClO4) 
(1,44 mL), também com água deionizada, e sob agitação. Para 0,005 mols de 
CdO, foi utilizado 0,01 mol de HClO4. 
 Em seguida, o pH da solução é elevado com NaOH até o valor de 8,5; 
(valor necessário para uma luminescência no comprimento de onda de 500nm 
após passivação). O balão é vedado com um septum de borracha. 
 Com auxílio de uma seringa é adicionado à solução gás sulfídrico H2S (750 
μl). A solução resultante é agitada continuamente durante 10 min, na qual após 
este tempo observamos a mudança da coloração de incolor para amarelo. 
Através desta observação, verificamos a formação das nanopartículas de sulfeto 
de cádmio. A solução é mantida à temperatura de aproximadamente 10o C até a 
passivação realizada aproximadamente após 24 h de preparação das 
nanopartículas de sulfeto de cádmio. 
 Para esta etapa o pH da suspensão é novamente ajustado com solução de 
NaOH, elevando-o para 10,5. Em seguida, é adicionado lentamente perclorato de 
cádmio Cd(ClO4)2 à 0,01 molL
-1 (6 mL), sob agitação constante. A adição lenta do 
Cd(ClO4)2 evita a formação de grandes aglomerados de hidróxido de cádmio. 
 O esquema geral da síntese e passivação do CdS/Cd(OH)2 está 
demonstrado na Figura 14. 
 
Figura 14: Esquema de síntese e passivação do CdS/Cd(OH)2 (1) (CHAVES, 2006, 
adaptada); Aspecto final da suspensão (2) e a mesma sob UV (3). 
 
 
4.1.2 Funcionalização 
 
 Finda a etapa de passivação, segue-se a funcionalização do CdS/Cd(OH)2, 
neste caso com Glutaraldeído (Glut), um agente bidentado utilizado para fixação 
de células em microscopia, mas quando utilizado em pequenas quantidades, 
pode ter outra função como a interação com as nanopartículas de CdS e dar a 
estas a possibilidade de ligação a materiais biológicos (SALES-NETO, 2009). 
 A funcionalização dos nanocristais foi realizada usando-se Glut a 0,01% do 
volume de suspensão de QD, deixando-os por 2 horas ao abrigo da luz antes da 
bioconjugação. O pH foi corrigido para um valor próximo ao fisiológico usando-se 
NaOH e HCl (pH ~ 8.0), e após esta etapa, 14 mL de suspensão de QDs foram 
funcionalizados utilizando-se 1,4 mL de Glut a 0,01%. 
 
 
 4.1.3 Bioconjugação 
 
 A partir da etapa de funcionalização, os QDs funcionalizados com Glut 
foram incubados em duas proporções com anticorpos anti-A sendo elas: 100:1 e 
20:1 QD-anti-A (v/v). Os sistemas ficaram overnight (tempo de 24 h) a 
temperatura ambiente para a formação do bioconjugado CdS/Cd(OH)2 - Glut - 
anti-A. 
 
 
 4.1.4 Imunomarcação Simples com CdS/Cd(OH)2 
 
O sangue utilizado foi coletado a partir de vasos periféricos em tubo de 
EDTA e posteriormente lavado, com PBS 1X ou solução salina (NaCl) a 0,9%, 
para serem obtidos hematócritos a 5% suspensos no mesmo fluido isotônico 
utilizado na lavagem. Os seguintes sistemas foram incubados na marcação sendo 
a concentração CdS/Cd(OH)2 - Glut - anti-A:células, de 3:1 (v/v): 
 
1. Suspensão de hemácias tipo A com QDs não funcionalizados (controle 
negativo 1); 
2. Suspensão de hemácias tipo A com QDs-Glut (controle negativo 2); 
3. Suspensão de hemácias tipo A com QDs-Glut-anti-A 100:1; 
4. Suspensão de hemácias tipo A com QDs-Glut-anti-A 20:1; 
5. Suspensão de hemácias tipo O com QDs-Glut-anti-A 100:1. 
 
 Após a incubação, o material foi submetido à centrifugação (rpm: 1800; 
145 g) por 30 s e após este procedimento, o sobrenadante foi desprezado sendo 
adicionado ao pellet de hemácias 500 µL por amostra teste. 
 
 
4.2 QUANTUM DOTS DO TIPO CdTe - AMS e CdTe - AMP 
 
 4.2.1 Síntese e Funcionalização 
 
QDs de CdTe em meio aquoso foram sintetizados a partir de uma 
adaptação de metodologia publicada anteriormente Santos et. al, 2007 (SANTOS, 
2007). A síntese é realizada usando-se dois balões nos quais segue-se o seguinte 
procedimento para síntese de 100 mL de QD:1. Em um balão (1) adiciona-se 0,013 g de telúrio (Te0) (Sigma Aldrich), 
100 µL de NaOH a 2 M (ou 100 µL a 1 M) e 0,144 g de Boridreto de 
Sódio (NaBH4) (Sigma Aldrich). Em atmosfera inerte, contendo 
Nitrogênio (White Martins), necessária para a redução do Telúrio, a 
reação seguirá sob aquecimento em temperatura controlada de 70 - 80° 
C e sob agitação constante até a completa redução do telúrio. A 
coloração desta reação passará de grafite inicialmente, passando por 
um roxo vívido característico da espécie química Na-Te-Te-Na, até a 
incolor (Te2-) que indicará o fim da redução; A Figura 15 ilustra as 
etapas da redução do telúrio visivelmente notada através da variação 
de coloração da solução. A formação de Te2- (incolor) passa pelo 
intermediário Na-Te-Te-Na de coloração lilás. 
 
 
Figura 15: Monitoramento visual das fases da redução do telúrio. A coloração 
violeta refere-se à presença da espécie Na-Te-Te-Na(aq). 
 
2. Em um segundo balão (2), o precursor de cádmio (Cd2+), 20 mL de 
Cd(ClO4)2 (Sigma Aldrich) em solução aquosa de concentração 0,01 M 
e o estabilizante escolhido, o ácido mercaptosuccínico (AMS) (Sigma 
Aldrich), 0,3603 g em 5 mL de H2O, ou ácido mercaptosuccínico (AMP) 
(Sigma Aldrich), 1,2 mL (4,9% (m/v) a pH 2,5), são adicionados. O pH 
desta solução é ajustado para aproximadamente 10,5 sob a 
temperatura ambiente; 
 
3. O conteúdo do balão 1 é transferido com o auxílio de uma seringa para 
o balão 2 e a reação prosseguirá sob agitação e refluxo com a 
temperatura controlada entre 80 - 90° C por 4 h no caso do uso de AMP 
como estabilizante e 8 h no caso do AMS. A Figura 16 mostra a solução 
precursora de cádmio e o momento da injeção do telúrio reduzido. 
 
 
 
 
Figura 16: Solução precursora de cádmio (1) e a mesma após injeção de solução 
contendo íons Te2- (2). 
 
Ao final do processo de síntese, as suspensões apresentaram-se límpidas 
e com colorações acastanhadas para o AMS e laranja para o AMP, indicativo da 
formação dos QD. A Figura 17 ilustra o aspecto da suspensão de QDs ao término 
da síntese. 
 
Figura 17: Aspecto final da suspensão de CdTe - AMS (1); Suspensões de AMS 
(esquerda) e AMP (direita) (2) e as mesmas sob UV (3). 
 
A proporção molar de síntese utilizada de Cd:Te:AMS e Cd:Te:AMP foram 
2:1:2,4 e 2:1:5,7, respectivamente. A Tabela 1 descreve os volumes de cada 
componente da síntese de 100 mL de QD. 
 
Tabela 1: Descrição dos componentes da síntese com seus respectivos valores para 
cada QD preparado. 
 Volume/Massa de 
Estabilizante 
(g/mL) 
Volume de 
Cd(ClO4)2 
(mL) 
Massa do 
Telúrio 
(g) 
Massa de 
NaBH4 
(g) 
CdTe - AMS 0,3603 g 
(em 5 mL de H2O) 
20,00 0,0130 0,1440 
CdTe - AMP 1,2 mL a 4,9 % 20,00 0,0130 0,1440 
 
 
4.2.2 Bioconjugação QDs - anticorpos 
 
No caso deste QD, não há a etapa de funcionalização visto que os 
estabilizantes já cumprem também esta função. Ao final da síntese, o CdTe já 
está recoberto por AMS, ou AMP, que fará a ligação com a molécula alvo, neste 
caso, anticorpos anti-A e anti-B, respectivamente. 
O CdTe - AMS e CdTe - AMP foram bioconjugados com as biomoléculas, o 
anticorpo monoclonal anti-A e anti-B (Fresenius Kabi e Lorne), respectivamente, 
por adsorção (SHI, 2009). Foi realizado o ajuste do pH dos QDs para 8,0 e os 
anticorpos ficaram em contato com os QDs por 2 horas a 25 ºC e ao abrigo da luz. 
As proporções entre QD-AMS:anti-A e QD-AMP:anti-B foram de 50:1, 25:1 e 
12,5:1 (v/v). A estabilidade dos bioconjugados também foi testada após 24 horas 
de preparados. A Figura 18 ilustra os bioconjugados citados. 
 
Figura 18: Da esquerda para direita observa-se as proporções de bioconjugados 50:1, 
25:1 e 12,5:1 (v/v) do AMP (amareladas) e as mesmas proporções de bioconjugados 
para o AMS ( esverdeadas). 
 
 
 4.2.3 Imunomarcação Simples com CdTe - AMS e CdTe - AMP 
 
Dois hematócritos foram feitos a 5% e 1% com hemácias previamente 
lavadas e ressuspensas no mesmo fluido isotônico utilizado na lavagem. 
Os bioconjugados foram colocados em contato com uma suspensão a 5% 
e 1% na proporção de bioconjugado:células de 3:1 (v/v) seguido de uma 
incubação a temperatura ambiente por 30 minutos. Após esse tempo, o material 
incubado foi submetido a uma lavagem com o tampão escolhido, sob 
centrifugação (rpm: 1800; g: 652) por 30 segundos. 
O pellet foi ressuspenso com 300 µL no mesmo tampão utilizado na 
lavagem e posteriormente, foi analisado em um citômetro de fluxo FACScalibur 
(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) e as análises foram realizadas com 
aquisição de 10.000 eventos/células para os filtros FL1 (λ = 515 - 530 nm) 
emissão correspondente a cor verde do CdTe - AMP, e FL2 (λ = 560 - 580 nm) 
emissão correspondente ao alaranjado emitido pelo CdTe - AMS. Para fins de 
comparação, todos os experimentos foram realizados nestas condições. 
O software utilizado para o tratamento dos dados foi o Cell Pro (Cell Quest 
TM Software, Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA). 
 
 
4.2.3.1 Formalização (Fixação da Fluorescência) 
 
A tentativa de formalização foi realizada colocando-se um pool de 
hemácias incubadas junto com 500 µL de PBS - Formol que consiste numa 
solução de PBS 1X a 1% de formol. Esta solução é utilizada na rotina laboratorial 
para fixação de fluorescência em amostras que não serão processadas na 
citometria em um breve espaço de tempo logo após a incubação. 
No momento da leitura, a amostra é centrifugadas nas mesmas condições 
já citadas e o pellet formado é ressuspenso em 300 µL de PBS 1X ou salina 0,9%. 
 
4.2.3.2 Imunomarcação Dupla com CdTe - AMS e CdTe - AMP 
 
Os mesmos passos iniciais da marcação simples foram aplicados neste 
experimento, porém as proporções de bioconjugados diferiram. 
Na primeira situação 150 µL de cada QDs, CdTe - AMS e CdTe - AMP, 
bioconjugados a anticorpos anti-A e anti-B, respectivamente, foram incubados 
com uma suspensão de eritrócitos a 1% ficando em uma proporção final de 3:1 
bioconjugado:células (150 µL de CdTe - AMS - anti-A + 150 µL CdTe - AMP - anti-
B: 100 µL de células tipo AB). 
Já na segunda, 300 µL de cada bioconjugado supracitado foi colocado para 
incubação com a suspensão de eritrócitos (300 µL de CdTe - AMS - anti-A + 300 
µL CdTe - AMP - anti-B: 100 µL de células tipo AB). 
Em resumo, duas proporções de bioconjugados foram aplicados nas 
hemácias sendo estes 1,5:1 e 3:1 (v/v), de cada sistema (CdTe - AMS - anti-A e 
CdTe - AMP - anti-B), para cada incubação. 
Posteriormente as mesmas condições de lavagem e centrifugação citadas 
para a simples marcação foram realizadas como procedimento pré-analítico da 
citometria. 
 
 
4.3. CARACTERIZAÇÃO ÓPTICA E ESTRUTURAL DOS QDs 
 
Para confirmar a formação dos QDs, bem como a sua qualidade, é 
necessário caracterizá-las óptica e estruturalmente. 
 
 
4.3.1 Caracterização Estrutural 
 
Para confirmar a cristalinidade, a distribuição de tamanho e a geometria 
desses QDs, é necessário caracterizá-las estruturalmente. Para esta finalidade 
duas técnicas foram aplicadas: Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e 
Difração do Raio-X em pó (DRX). 
A microscopia foi realizada através de MET de alta resolução em 
Microscópio Eletrônico de Transmissão Tecnai - G2 - 20 - FEI 2006, 200 KV no 
Laboratório Nacional de Luz Sincrotron (LNLS). É indicado que as amostras 
tenham uma espessura de 500 a 5000 Å e estas são depositadas em um suporte 
de carbono apoiados em pequenas grades de níquel e cobre. A amostra é diluída 
em água deionizada na diluição 1:5 e deixada em ultra-som por 15 minutos para 
redispersão. Apóseste passo, 12 µL são pingados nas grades e espera-se secar 
após 24 h em dessecador. 
Os difratogramas foram obtidos no difratômetro da Siemens Nixford D5000 
digital (com biblioteca cristalográfica), com radiação incidente Kα(Cu) = 1,542 Å, 
voltagem de 40 KV e corrente de 40 mV. Os difratogramas de Raios-X foram 
obtidos entre 2 = 10 e 60º. 
A preparação das amostras para esta técnica foi processada com a 
precipitação dos nanocristais utilizando isopropanol na proporção 3:2 - 
isopropanol:QD - (v/v) seguido de centrifugação por 15 minutos e g = 1585. 
Posteriormente o sobrenadante é desprezado direto do tubo centrifugado 
vertendo-o e o pellet foi ressuspenso no volume residual. O material ressuspenso 
é então gotejado em uma lâmina fosca e é deixando secar lentamente dentro de 
um dessecador para minimizar processos oxidativos das partículas. 
Os difratogramas foram utilizados para calcular o diâmetro médio das 
partículas a partir da largura da linha mais intensa dos difratogramas através da 
fórmula de Scherrer (WEST, 1997) 
 
0,9. = d.B.cos
 
onde: 
 
d = diâmetro médio das partículas (em nm) 
 = comprimento de onda utilizado pelo instrumento ( = 0,1542 nm) 
B = largura de linha do pico de difração na metade da intensidade máxima 
(em radianos) 
 = ângulo de incidência do feixe de raios-X no pico do difratograma de 
máxima intensidade 
 
 
4.3.2 Caracterização Óptica 
 
Através de espectroscopias de absorção e emissão, as nanopartículas 
foram caracterizadas química, física e estruturalmente. Estas medidas foram 
realizadas utilizando o instrumento UV/VIS Spectrophotometer, Perkin-Elmer, 
modelo LLS 55, e o espectrofotômetro Ocean Optics, modelo HR4000, utilizando 
a água ultra-pura como referência. Uma estimativa de tamanho das partículas 
pode ser realizada através da interpolação com dados empíricos de outras 
sínteses descritas na literatura. Para o tamanho das nanoestruturas de CdS foi 
utilizada a relação experimental feita por Vossmeyer et al. (1994) enquanto que 
para CdTe foi utilizada a relação empírica de Dagtepe et al. (2007). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO 5: RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
 
5.1 CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E ÓPTICA DOS QDs 
 
 Para calcular o tamanho médio das nanopartículas sintetizadas através da 
Difração de Raios - X foi aplicada a fórmula de Scherrer e em 
complementaridade, a análise morfológica através da Microscopia Eletrônica de 
Transmissão. 
 
 
 5.1.1 Caracterização Óptica e Estrutural do CdS/Cd(OH)2 
 
A Figura 19 mostra um difratograma representativo das amostras 
sintetizadas. Comparando os dados de difração com o banco de dados 
internacional, JCPDS nº 75 – 2086 observou-se que a estrutura cristalina é cúbica 
tipo blenda de zinco com picos de difração intensos em 2: 26,5; 32,29; 44,09; 
52,16, correspondendo, respectivamente, aos planos cristalinos (111), (200), 
(220) e (311) do semicondutor CdS (CHAVES, 2011). 
O plano (111) foi utilizado para estimar o tamanho médio dos cristais 
utilizando-se a equação de Debye-Scherrer resultando em um tamanho médio (d) 
das partículas de d = 7,5 nm. Os picos alargados são característicos de amostra 
de dimensões nanométricas. 
10 20 30 40 50 60
0
10
20
30
40
(311)
(220)
(200)
 
 
In
te
ns
id
ad
e
2(Graus)
(111)
 
Figura 19: Difratograma de raios-X de pó representativo de amostra de CdS/Cd(OH)2. 
 
A Figura 20 mostra os espectros de absorção e emissão da suspensão de 
CdS/Cd(OH)2-Glut utilizada nas marcações. Os espectros de absorção 
concordam com dados anteriores obtidos na literatura para partículas com 
diâmetro médio em torno de d = 6 nm (SANTOS, 2002). Observa-se que a banda 
de emissão apresenta um máximo em  = 493 nm, mas com um comportamento 
log normal estendendo sua banda de emissão até a região do vermelho distante. 
400 450 500 550 600400 600
A
bs
or
ça
o 
Comprimento de Onda (nm)
In
te
ns
id
ad
e 
N
or
m
al
iz
ad
a
 
 
Figura 20: Espectros de Absorção e emissão normalizada do CdS/Cd(OH)2 (excitado em 
337 nm) . 
O espectro de emissão mostra emissão com coloração azul turqueza, com 
uma largura de banda em torno de FWFH = 29 nm. 
 
 
 5.1.2 Caracterização Óptica e Estrutural do CdTe - AMS 
 
A Figura 21 mostra o difratograma das amostras sintetizadas de 
CdTe- AMS cujo pico mais intenso encontra-se em 2 = 23,8o. 
20 30 40 50 60
0
5
10
15
20
25
30
35
 
 
2 (Graus)
In
te
ns
id
ad
e 
(u
.a
.)
(111)
(220)
(311)
 
Figura 21: Difratograma de Raios-X de pó do CdTe - AMS. 
 
 
Aplicando-se a equação de Scherrer, obteve-se o tamanho médio das 
partículas de d = 3 nm. E através da equação de Dagtepe et al, (2007) cuja 
estimativa é obtida empregando o valor do primeiro máximo de absorção, o 
diâmetro estimado foi de d = 3,2 nm, em concordância com o resultado obtido 
através de DRX. 
 A Figura 22 mostra os espectros de absorção e emissão representativos de 
uma suspensão de CdTe - AMS sintetizada. 
0.0
0.5
1.0
1.5
450 500 550 600 650 700 750
0.0
0.5
1.0
1.5
A
bs
or
bâ
nc
ia
 
In
te
ns
id
ad
e 
N
or
m
al
iz
ad
a
Comprimento de Onda (nm)
 
Figura 22: Espectros de absorção e emissão normalizados da suspensão de CdTe - AMS 
sintetizada. 
 
Tomando como base o primeiro máximo de absorção em 551nm essas 
nanopartículas apresentam um diâmetro aproximado de d = 3,2 nm (DAGTEPE, 
2007; ROGACH, 2007) em concordância com as técnicas anteriores. O espectro 
de emissão mostra emissão de coloração vermelho alaranjado e com largura de 
banda FWHM = 49 nm. 
 
Após análise das imagens obtidas a partir de MET das suspensões de QDs 
(Figura 23) foi estimado uma faixa de dimensão de partículas d = 3 - 5 nm apesar 
do difícil contraste e grande superposição das partículas. 
 
Figura 23: Imagem HR-MET de nanopartículas de CdTe - AMS. Barra: 5 nm. 
 Nas imagens observadas na Figura 23 podemos notar, apesar dos 
aglomerados mais escurecidos, que existem arranjos definidos e lineares de 
átomos em alguns pontos (círculos vermelhos denotando planos cristalinos 
regulares) diferente das regiões mais claras e sem organização do fundo da 
imagem que corresponde ao suporte usado para a análise. O arranjo de 
pequenos pontos ordenados é indicativo da presença de planos cristalinos e 
consequentemente, da presença de cristais bem definidos na amostra de CdTe - 
AMS. 
 
 
 5.1.3 Caracterização Óptica e Estrutural do CdTe - AMP 
 
 Através da Figura 24, que representa o difratograma dos nanocristais de 
CdTe - AMP sintetizados, obtivemos os dados estruturais dessa amostra: fase 
cúbica, tipo blenda de zinco e com planos (111), (220) e (311)) característicos do 
semicondutor CdTe. 
 
20 30 40 50 60
0
5
10
15
20
25
 
 
In
te
ns
id
ad
e 
(u
.a
.)
2 (Graus)
(111)
(220)
(311)
 
Figura 24: Difratograma de Raios X de pó de CdTe - AMP. 
 
Aplicando-se a equação de Scherrer, obteve-se um diâmetro médio das 
partículas em torno de d = 2,6 nm. As imagens obtidas através de HR-MET 
evidenciam partículas cristalinas e com dimensão nanométrica (Figura 25). 
 
 
Figura 25: Imagens HR-MET de nanopartículas de CdTe - AMP. Os círculos verdes 
delimitam o diâmetro das nanopartículas evidenciando os planos cristalinos. Barra: 2 nm. 
 
 Em ambas as imagens da Figura 25 os planos cristalinos são melhor 
visualizados em contraste