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ARTIGO
Monitorização terapêuticadeanticonvulsivantes
SílviadeOliveiraSantosCazenave'
CristianeLeslieCorrea2
PaulaCristianeSoubhia1
NádiaBarbosaRezende1
VaraAraújo-l
RESUMO
Rejere-sea monitori=açãodeníveisplasmáticosdefârmacoscomouminstrumentovaliosoparaassegurar
umaterapiacomo máximodeeficáciae o mínimodeefeitostóxicos,demaneiraindividual,umave=que
os efeitosterapêuticose tóxicossilo melhoresrelacionadosà concentraçãoplasmáticado queà dose
administrada,Os métodosanalíticosji-eqiientementeutili=adosna determinaçiloe quantificaçãodos
al11iconvulsivantessilo a cromatograjiaemfasegasosa(C'G), a cromatografialíquidadealtaejiciência
(CL IF:)eastécnicasdeimunoen.l'aio(/FP) Reali=ou-seadeterminaçãodeprimidona(PRD);fenobarbital
(FNI3);fenitoína(FN7); carbal1w=epina(CI3Z)ecarbama=epinaepóxido(C'I3Ze)nasamostrasdeplasma
liojili=cldoatravésdeC'C,CLAE eIFP ecomparou-seosresultadosobtidospelosmétodosutili=adosajim
deverificarseháconcordânciaentreosmesmos,Acomparaçãofoireali=adaji-enteaosresultadosenviados
pelo HealthCOl11rol- CardijJ
U"itermos: anticonvulsivos,cromatograjiagasosa,cromatograjialíquida,
INTRODUÇÃO
Amonitorizaçãodeníveisplasmáticosdefármacos
temsido um instrumentovaliosoparaasseguraruma
terapiacomomáximodeeficáciaeomínimodeefeitos
tóxicos,demaneiraindividual,umavezqueosefeitos
terapêuticose tóxicos são melhoresrelacionadosà
concentraçãoplasmáticadoqueàdoseadministrada,
Destaforma,o controleterapêuticodeveser
instituídoemterapiasa longoprazo,quandoa razão
terapêuticaébaixa,quandoacorrelaçãodose/respostanão
é previsível,empoliterapias,quandonãohácorrelação
entrea concentraçãoplasmáticado fármacoe eficácia
e/outoxicidade,alémde outrasindicaçõesclínicas',
(') ProfessoraAdjunta de Toxicologia e Coordenadorado Curso de
Ciências Farmacêuticasda Faculdadede Ciências Médicas da
PUCCAMP,
(') Professorade Toxicologia do Curso deCiências Farmacêuticasda
FaculdadedeCiências Médicasda PUCCAMP,
(') GraduandasdoCursodePós-GraduaçãoemAnálisesToxicológicas
da USp,
(') ProfessoradeToxicologia da FaculdadedeCiênciasFarmacêuticas
da USP,
Devidoao fatodosanticonvulsivantesestarem
relacionadoscomalgumasdascondiçõesclínicascitadas,
verifica-sea importânciada monitorizaçãoterapêutica
paraestesfármacos2,
Os métodosanalíticosfreqüentementeutilizados
nadeterminaçãoe quantificaçãodosanticonvulsivantes
sãoa cromatografiaemfasegasosa,a cromatografia
líquidadealtaeficiênciaeastécnicasdeimunoensaio-l,
Nestetrabalhorealizou-sea determinaçãode
primidona(PRD),fenobarbital(FNB), fenitoína(FNT),
carbamazepina(CBZ) e carbamazepinaepóxido
(CBZe)nasamostrasdeplasmaliofilizadoatravésde
cromatografiaa gás(CG), cromatografialíquidade
altaeficiência(CLAE) e imunotluorescênciapolarizada
(IFP),comparando-seosresultadosobtidospelosmétodos
utilizadosa fimdeverificarseháconcordânciaentreos
mesmos,
MATERIAL E MÉTODOS
Analisou-seamostrasdeplasmaliofiIizadoenviadas
peloHealthControl- Cardiff,asquaisforamressuspensas
RevistadeCiênciasMédicas-PUCCAMP, Campinas,5(2):69-75.maio/agosto1996
70 S. de O. S. CAZENA VE etai.
com5mLdeáguamiliQeaseguirsubmetidasaosmétodos
analíticosIFP. CG eCLAE. As oitoamostrasenviadas.
H80292:H80592:H80692:H80792:H80992:H81192:
H91292e H80193forampreparadascoma adiçãode
fármacospurosemumplasmaisentodosmesmos.ondeos
valoresadicionadosforamcalculadosapartirdopesodas
alíquotasedagravidadeespecíficadoplasma.Todasas
amostrasforampreparadasusando-seplasmadenovilho.
Alémdasamostrastambémforamproces-sados
calibradoresecontroles(baixo.médioealto).Nométodo
IFP os seiscalibradorese controlesde concentrações
conhecidosforamfornecidospeloprópriofabricante.Os
quatrocalibradoresusadosemCG e CLAE. aosquais
adicionaram-seconcentraçõesconhecidasdosfármacos.
forampreparadosemsoluçãometanólica.evaporadose
ressuspensoscom1mLde"pool"deplasmahumano.
Pararealizaçãodascurvasdecalibraçãonosmétodos
deCGeCLAE. soluçõesestoqueforampreparadaspara
cadaumdosfármacosea partirdasquaisforamfeitas
diluiçõesadequadasparaa monitorizaçãoterapêutica
(TabelaI).
CBZ= carbamazepina
CBZe = carbamazepinaepóxido
FNT = fenitoína
FNB = fenobarbital
PRM = primidona
Ostrêsmétodospropostosparaacomparação
têmsidoamplamentecitadosnaliteratura.indicados
à monitorizaçãoterapêuticadediversosfármacos4:
1. Imunofluorescênciapolarizada (IFP): é
umimunoensaiodotipohomogênio.semnecessidade
deumafasedeseparação,empregadonocontrolede
fármacosedousoabusivodedrogas.Nestapesquisa
utilizou-seo equipamentoVitalabEclair@,Merck.
Seufundamentoestábaseadonamonitorizaçãoda
tluorescênciaemfunçãodareaçãoantígeno-anticorpo.
A substânciafluorescenteutilizada,Fluoresceína,é
geralmenteligadaaoantígeno,sendooprodutodesta
ligação chamadode traçador.A intensidadede
fluorescênciaemitidapodeserpolarizada.Quando
umaamostrasemantígenoé colocadaemcontato
com o reagenteobservamosum alto valor de
polarização.No entanto,se na amostraexistirem
antígenos,estesvãocompetirpelossítiosdeligação
doanticorpo,eantígenosmarcadosficarãolivresem
solução.gerandoumadiminuiçãona polarizaçã03
(FiguraI).
Amostra
50flL
1000flL de tampão
homogeneizar
Pré-diluição
50flL
1000flL de tampão
50flL de anticorpo homogeneizar
Leitura1
50flL dotaçador
homogeneizar
incubara 37°Cpor 5 min
Leitura2
Figura1. Fluxogramadatécnicade Imunofluorescênciapolarizada
(lFP). Eclair@
RevistadeCiênciasMédicas-PUCCAMP, Campinas.5(2):69-75.maio/agosto1996
J
Tabela1. Diluiçõesdostannacosutilizadosnasanálises.
Soluçãoestoque DiluiçãoI Diluição2 Diluição3 Diluição4
Fánnacos flg/ mL flg/mL flg/mL flg/ mL flg/mL
CBZ 500 25 20 10 0.5
CBZe 100 5 2 I 0,05
FNT 600 30 24 12 3
FNB 100 50 40 20 I
PRM 100 25 20 10 2
\10NITORIZA('AoTERArtl 'TIL\ Df
71
2.MétodocromatográficoporCLAE:foiutilizada
comofasemóvelasoluçãodeacetonitrila:água(3:7).com
velocidadede fluxo de ImLlmin: colunasupelcosil
\
PlasmaImL
Faseaquosa
rejeitar
LC-ABZ, detectorUV: 5(p-metiltenil)5-fenílhidantoína
comopadrãointernoe equipamentoLKB Bromma
(Figura2).
Tubodecentrífuga(15mL)
HCLO,I N atépH4,5-5,0
1Oflgdepadrãointerno(I OOflL)
5mLclorofórmio
agitar20min
centrifugara2500rpmpor10min
Faseorgânica
Evaporarà secura
sobfluxodeN2
Resíduo
Dissolvercom500flL
dafasemóvel
100flL
Injeçãoautomática20flL
CLAE
Figura 2. FluxogramadatécnicadeCromatogratialiquidadealtaeticiência(CLAE).
3. Cromatografia em fase gasosa: o
equipamentoutilizadofoi umCG modelo370 da
InstrumentosCientíficosCG Ltda.comdetector de
ionizaçãode chamae temperaturasde210°C para
colunae280°Cparavaporizadoredetector (Figura3).
O padrãointernoutilizadofoi 5(p-metilfenil)-5-fe-
nilhidantoínae C1)moagentemetilanteo hidróxidode
trimetilfenilamônio.
RevistadeCíênciasMédicas- PUCCAMP,Campinas.5(2):69-75.maio/agosto1996
72 S deO S.CAZENAVEetal
PlasmaImL
Faseaquosa
rejeitar
Figura 3. FluxogramadatécnicadeCromatografiaemfasegasosa(CG).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultadosobtidosnasanálisespodemser
observadosatravésdasTabelas2,3,4 e5.
Atravésdosdadosobtidospelarelaçãodeáreados
calibradoresanalisadosforamrealizadasas regressões
linearessimples,obtendo-separacadafármacoaseguinte
equaçãodareta:
Tubodecentrifuga(15mL)
HCL0,1N atépH4,5-5,0
10llgdepadrãointerno(IOOIlL)
5mLclorofórmio
agitar20min
centrifugara2500rpmpor10min
Faseorgânica
Evaporarà secura
sobfluxodeN2
Resíduo
Dissolvercom500llL
doagentemetilante
51lL
CG
CBZ: y = 0,0057911x+0,1392057
r = 0,999
FNT: y = 0,0217729x+0,0799191
r = 0,989
PRM:y = 0,0102473x+0,2162038
r = 1,095
RevistadeCiênciasMédicas-PUCCAMP, Campinas,5(2):69-75,maio/agosto1996
J
MONITORIZAÇÃO TERAPÊUTICA DE 73
Tabela2. Análiseatravésdeimunoensaio.
RevistadeCiênciasMédicas-PUCCAMP, Campinas,5(2):69-75,maio/agosto1996
Amostras PRM FNT FNB CBl
ControleI 16,04 32,90 62.44 11,00
Controle2 65,52 51,53 121.00 23,70
Controle3 95,76 126,06186,02 64,34
0292 70,56 27.35 186.02 20,74
0592 10,99 49,95 176.11 9,74
0692 60,94 64,22 46,94 35,98
072 19,70 34,88 152,87 5.50
0992 106,30 94,34 86,12 46,14
1192 103,55 21.41 210,99 60,95
1292 39,86 61.84 129,18 46,98
0193 52,69 50,34 113,25 37,67
CalibradorI O O O O
Calibrador2 9.17 9,91 21,53 8.47
Calibrador3 18,32 19,82 43,06 16,93
Calibrador4 36,65 39,64 86,12 33,86
Calibrador5 73,31 79,28 172,24 50,79
Calibrador6 109,97 158,57 344.49 84,65
CBl= carbamazepina
FNT =fenitoína
FNB=fenobarbital
PRM =primidona
Tabela3. AnáliseatravésdeCG.
Amostras PRM FNB FNT CBl
0292 75,98 - 25,58
0592 0,67 - 47.40
0692 51,54 - 69,56 1,73
0792 3,04 - 37,24 0,78
0992 112,40 - 113,29 92,47
1192 119,57 - 20,00 178,57
1292 41,22 - 86.50 156,06
0193 43,03 - 58,65 87,60
CalibradorI 9,16 - 11,89 2,12
Calibrador2 45,82 - 47,57
Calibrador3 91,64 - 95,13 84,65
Calibrador4 114,55 - 118,92 105,82
CBl= carbamazepina
FNT = fenitoína
FNB =fenobarbital
PRM =primidona
-.--
74 S deU.S CAZ.ENAVEetai
Tabela 4. Anális~atravésd~CLAE.
CBZ= carbamazepina
CBZe = carbamazepinaepóxido
FNT = fenitoina
FNB = fenobarbital
PRM = primidona
Tambémparaestametodologiafoi realizadaa
regressãolinearsimples.obtendo-seasseguintesequações
dareta:
FNB: y =0,0104625x+0.5602907
r =1,077
PRM: y =0,008588x+0,0514395
r =0,995
Tabela 5. Índicesde rejeiçãonasanálisesefetuadas.
A partirdestasequaçõesforam calculadasas
concentraçõesdasamostras.assimcomoarealização
dascurvasdecalibraçãoparacadaumdosfármacos.
Váriasobservaçõespodemser feitasquando
comparamosos métodosutilizados.no entantoum
maiornúmerodeanálisesdeveriatersidoefetuado
paracadaumadasamostrasafimdequepudessemos
verificar precisão. exatidão. reprodutibilidade,
repetibilidadedostrêsmétodos.A comparaçãofoi
realizadafrenteaosresultadosenviadospeloHealth
Control - Cardiff.
Devidoa insuficiênciadedadosnãofoipossível
realizarumtratamentoestatísticoadequado.Atravésdo
valormédiodosfármacos,enviadosporCardiff.foram
consideradososvaloresdentrode3:i:DP (desvio-padrão)
refletindoemíndicesderejeiçãoespecificadosnaTabela5.
CG =cromatografiaa gás
CLAE = cromatografialíquidade alta eficiência
IFP = imunofluorescênciapolarizada.
Revistade CiênciasMédicas-PUCCAMP, Campinas,5(2):69-75,maio/agosto1996
-
Amostras PRM FNB FNT CBZ CBZe
0292 71.2R 327.51 34.70 19.0R 7.66
0592 199.54 IR7.12 44.45 0.65 2.94
0692 12R.RI 6.11 60.54 25.03 3.RO
0792 253.57 167.22 35.R7 6.02
0992 10&.24 62.17 95.16 34.92 3.40
1192 301.09 247.57 19.37 46.39 6.70
1292 129.21 131.95 69.57 36.56 4.73
0193 165.36 100.29 40,93 19.90 2.36
Calibrador 1 9.16 4.31 II,R9 2.12 0,20
Calibrador2 45,&2 R6.12 47.57 42.33 3.96
Calibrador3 91.64 172.24 95.13 &4.65 7.93
Calibrador4 114.55 215.30 11&.92 105.&2 19.&2
CBZ: y =0.0154686x+0.1503367
r =1.003
CBZe: y =0.050359x-0.1093946
r =0.99]
FNT: y =0.0262126x- 0,0432925
r =0.997
Métodos Análisesrealizadas Ana'lisesrejeitadas Percentagemderejeição
CG 22 11 50,0
CLAE 40 13 32,5
IFP 32 5 15,6
L
MONlTORlZAÇÃO TERAPÊUTICA DE... 75
CONCLUSÃO
-O métododeCG mostrou-seinadequadopara
análisedefenobarbital,carbamazepinaecarbamazepina
epóxido;
- A IFP é inadequadaparadeterminaçãode
carbamazepinaepóxido;
- DasanálisesrejeitadaspelaIFP, todasestavam
relacionadasàprimidona,comvaloressuperestimados;
-Todososmétodospodemserutilizadosnaanálise
defenitoínacomresultadossatisfatórios;
-O métododeCLAE apresentouporcentagemde
rejeiçãoelevada,provavelmente,emfunçãodeproblemas
técnicos;
- Nas condiçõeslaboratoriaisnasquaisforam
desenvolvidasasanálises,aimunotluorescênciapolarizada
mostrou-secomometodologiamaisadequada,devidoa
suasimplicidadeerapidezdeexecução.
SUMMARY
Therapeuticmonitoring01anticonvulsantdrugs
Thetherapeuticmonitoringofdrugsinplasmahasbeen
an importantinstrumentto assurea therapywiththe
maximumeflicacyandtheminimumtoxicejJects,inan
individualmanner,sincetherapeuticandtoxicejJectsare
betterrelatedtoplasmaticconcentrationthanto the
administereddose.Analyticaltechniquesfrequent/yused
for thedeterminationof anticonvulsantdrugsare
gas-liquidchromatography(GLC),highperformanceliquid
chromatography(HPLC) and immunologictechniques
(polarisationfluoroimmunoassay- PFIA). Primidone,
phenobarbital,phenytoin, carbamazepineand IO,II
carbamazepine-epoxideweredeterminedinfreeze-dried
samplesofplasmaandGLC, HPLC andPFlA techniques
wereused.Theresultswerecomparedaccordingtodata
reportedtheHealthControlExternalQualityAssessment
Schemein CardifJ.
Keywords: anticonvulsants, chromatography, gas,
chromatography,liquido
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Trabalhorecebidoparapublicaçãoem9 demaioeaceitoem19deagosto
de1996.
RevistadeCiênciasMédicas-PUCCAMP,Campinas,5(2):69-75,maio/agosto1996