H01   Noções Básicas de Microscopia Histologia
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H01 Noções Básicas de Microscopia Histologia


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Arlindo Ugulino Netto ● MEDRESUMOS 2016 HISTO LOGIA
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NOÇÕES B ÁSICAS DE MICROSCOP IA
No estudo da h istologia, tr adicionalmente def inida co mo anatomia micros cópica”, é d e fundam ental importância
o uso do microscópio. Para adquirir conhec imento histof isiológico s obre tecidos, órgã os e sistem as é necessário qu e o
aluno conheça os fundamentos da m icroscopia, um a vez que, o procedim ento mais utilizado no estu do h istológico é a
preparação de c ortes teciduais ana lisados em micr oscópio.
MICRO SCÓPIO ÓPT ICO
Através do m icroscópio óptico (MO), também c hamado de micr oscópio de luz, pr eparações coradas pod em ser
examinadas porque um feixe de luz é transm itido através do corte h istológico.
Um microscópio óptico pode ser simples ou com posto: o micros cópio sim ples poss ui um a única len te e
fornece um a im agem moderadam ente aumentada do objeto que se está estud ando; o m icroscópio com posto consiste
em uma série de lentes e fornece um aumento m uito m aior. Na disciplin a de histologia, gera lmente se utiliza
microscópios ópticos c ompostos, podendo ser m onocular ou bi nocular.
O MO é tradicionalm ente compos to por partes mecânicas e ópticas :
Partes mecânicas
Base ou Pé: estab iliza o MO s obre a bancada.
Braço ou Coluna: se estende da base para c ima (suporte).
Mesa ou Platina: local onde se coloca a lâmina para observaçã o.
Parafuso m acrométrico: botão para m acrofocalização.
Parafuso m icrométrico: botão para m icrofocalização.
Carriot: movim enta a lâmina sobre a plat ina.
Revolver: onde se e ncontram as lentes objetivas.
Canhão ou Tubo: su porte para oculares.
Lâmpada: fonte de luz.
Partes ópticas
Oculares: c onjunto d e lentes de aum ento. Am pliam a im agem form ada pela
objetiva. O a umento final da imagem é dado pela m ultiplicação do aumento da
ocular pelo am ento da objetiva.
Objetivas: captam a luz oriunda do condensador e fo rmam uma im agem am pliada
do objeto , sendo fundam entais par a a dist inção d e d etalhes dura nte a observaç ão.
São em núm ero de quatro: panorâm ica, pequeno aumento, médio aum ento e m aior
aumento ou im ersão. Os aum entos são indicados por anéis color idos:
o Vermelho: 4x
o Laranja: 10x
o Amarelo-verde: 4 0x
o Azul claro 100x
Condensador: com binação de lentes que projeta a luz sobre o o bjeto.
Diafragma ou Íris: contro la a passagem de raios luminosos.
Espelho: reflete os r aios em anados da fonte de luz.
Arlindo Ugulino Netto .
HISTOLOGIA
2016
Arlindo Ugulino Netto ● MEDRESUMOS 2016 HISTO LOGIA
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Um microscópio óptico c omposto é um s istema de aum ento em dois estágios: prim eiro o objeto é aum entado
pelas lentes da objet iva e depois novam ente pelo seg undo conjunt o de lentes da ocular. O aumento total, c om o foi visto,
é o produto dos aum entos de objetiva pelo da ocu lar. O valor gravado num a objetiva (4x, 10x, 40x, 1 00x) indica o
aumento da objetiva; sendo assim , uma objetiva de 40x usada em com binação com uma ocular de 10x d á um aumento
total de 400x. É interess ante observ ar que a im agem proj etada na retina est á invertida da dire ta para a es querda e de
cima para baixo.
A qualidade de um a imagem depende não somente da capacidade da lente de aumentar, m as também de sua
resolução (capac idade de lente de m ostrar que dois obj etos d istintos es tão s eparados por um a distâ ncia). A qualidade
da lente dep ende de quão próxim o sua resolução s e apr oxima do poder de resolução m áximo do MO, isto é, 0,2µm
(restrição esta det erminada pe lo comprim ento de onda de lu z visível); esta r esolução perm ite a obten ção de boas
imagens aum entadas de 1000 a 1500 vezes.
OUTROS TIPOS DE MICRO SCÓPIO
Microscópio de Contraste de Fase e de Co ntraste Dif erencial d e Int erferência: espécim es biológicas não
corados são geralm ente transparentes e difíceis de serem observados com detalhes. A m icroscopia d e contraste
de fase baseia-se no princípio de que a luz muda sua velocidad e ao atravessar estruturas celulares e
extracelulares que tenham índices de refraç ão difere ntes, torna ndo possível a observaç ão de células v ivas e
cortes não corados pro duzindo im agens visíveis de objetos quase trans parentes.
Microscópio d e polarização: “polarização” é um fenôm eno que ocorre quando a luz passa através de certas
substâncias, t ais com o os cristais, e é div idida de m odo que em ergem dos raios lum inosos derivados de um só.
A capacidade que es truturas têm de girar o plano de vibração da lu z po larizada é cham ada de birrefringência. No
microscópio de polarizaçã o, a luz é polarizada em baixo da p latina do m icroscópio por um prism a de quartzo
Nicol cham ado polarizador. Um segundo prism a, cham ado analisador e polarizador, é ajusta do de m odo que os
feixes luminosos tenham um trajeto paralelo e um a imagem norm al pode ser vista através da ocu lar.
Microscópio de Fluo rescência: “f luorescência” é o fenômeno que certas s ubstâncias possuem de quando
irradiadas por luz de um certo c omprimento de onda (invisíve l) passam a em itir luz com com primento de onda
mais longo (visíve l). Neste tipo de m icroscópio, a luz ultraviolet a é utilizada para il uminar as secreções de tecidos
que passam a em itir luz n a porção visível do espectro, fazendo c om que s ubstâncias fluores c entes apareç am
brilhantes sobre um fundo esc uro. O m icroscópio de f luorescência possui um a f onte de luz u ltravioleta muito
intensa e filtros esp eciais que selecionam o c omprimento de on da dos raios lum inosos que atingem o espéc ime
e também dos raios que são em itidos pelo espécim e.
Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET ): este difere do MO pelo fato de usar feixes de elétrons em vez
de feixe de luz. O funcionam ento do MET se baseia no princíp io que e létrons podem ser desviados por c ampos
eletromagnéticos de uma m aneira s emelhante à refração produzida pela luz p or lentes de vidro. Elétrons s ão
liberados pelo aquecim ento deum delicado filam ento m etálico (gera lmente tungstênio) em vácuo. Os elétr ons
liberados por este filam ento (cham ado de c atodo) o então subm etidos a uma diferença d e voltagem de 60
120 k V existente entre o catodo e o a nodo. Desta maneira, os elétrons são atr aídos pe lo anodo e ace lerados,
atingindo altas velocidades , formam feixes e percorrem o tubo do m icroscópio. Alguns elétrons interag em com
átomos do corte ao atravessá -lo e continuam seus trajetos em direção às outras lentes, enquanto outros
simplesm ente cruzam o espécime sem interagir com ele. Pelo f ato de a retina não ser sensível a elétrons, para
se observar uma imagem , eles necessi tam ser projetados sobre um detector uma pl aca fluorescente , um
negativo f otográfico o um a câm era CCD. C omo a imagem no MET é produzida pe lo balanço da quantida de de
elétrons que atingiram o detector e elétrons que fora m retidos no tubo do m icroscópio, a imagem resultante é
sempre em preto-e- branco. As áreas escuras de u ma m icrografia eletrônica c ostumam s er denominadas de
elétron-densas, en quanto as áreas claras s ão chamadas de e létron- lucentes ou elétron-tra nsparentes.
Microscópio Eletrônico de Varredur a (MEV): diferentem ente do MET , no MEV os elétrons não atravessam o
espécime, proporcionando apenas um a visão de superfície. Um f eixe m uito pequeno d e elétrons é m ovido
sequencialmente de m odo a varrer a secção de tec ido. Os e létrons interagem com um a cam a da m uito delgada
do m etal pre viamente aplicada ao espécim e e são refletidos pelos átom os do m etal. Estes e létrons são
capturados por um detector que os trans mite a am plificadores e outros dispositivos d e form a que o s inal é
finalmente projetado em um tubo de raios catódicos (um m onitor), resultando em um a imagem e preto -e-branco.
As fotografias result antes são de fácil interpret ação, pois apresent am imagens que parecem s er iluminadas e
possuem locais claros e outros som breados. A microscopia eletrônica de v arred ura fornece im agens
tridimensionais das s uperfícies de células, tec idos e órgãos.
PREPARAÇÃO DE UM A LÂMINA HIST OLÓGICA
Para estudar tecidos , órgãos e sistem as em histologia, f oram desenvolvidas várias técnicas para manter um
aspecto m uito pr óximo do natural vivo, de tal for ma que, estrutura e com posição m olecular seri am as m esmas
apresentadas no c orpo, porém, o m étodo m ais utilizado é o prepar ado histológico permanente (lâmina histológica
permanente) para an álise em microscópio óptico.
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1ª etapa: Coleta da am ostra.
A coleta da am ostra é realizada através de: Biópsia cirúrgica; B iópsia endoscópica; Biópsia por agulha;
Cirurgias am plas; Necropsia; Cobaias (anim ais de laboratório).
Deve ser processada: im ediatamente; sem choque osmótico; s em “congelame nto”; sem com pressão;
sem trações; sem dessecamento.
2ª etapa: Fixação d o material histológico.
Objetivos da f ixação: Evitar a autólise; Inativar enzimas; Coagul ar proteí nas; En durecer a p eça; Im pedir
contaminação; Fac ilitar a coloração.
Agentes fixadores:
Físicos: calor; radiaç ão.
Químicos :
a) Orgânicos: ácid os (acético, pícrico, cítrico, etc.); aldeídos (f ormaldeído, acetaldeído,
glutaraldeído).
b) Inorgânicos: crom atos e bicrom atos; sais e óxidos de m ercúrio.
3ª etapa: Desidrat ação do m aterial histológico.
Objetivo: substituir a água ou o solvente aquos o do f ixador por um solvente não polar com o prim eira
etapa para a inclus ão de parafina ou em resina.
Agentes desidratant es: álcool etílico; acetona; álcool butírico; álcool isopro pílico; álcool m etílico; éter.
Sequência:
Álcool 70% 1 hora
Álcool 80% 1 hora
Álcool 90% 1 hora
Álcool 100% 2 horas.
4ª etapa: Clarificação ou Diafanização.
Objetivo: rem over o álcool, que s ubstituíra a água no interior dos tecidos, por um solvente que s e ja, ao
mesmo tempo, m iscível com álcool e com a parafina.
Consequências: o tecido to rna-se transparen te; h á remoção da gorduras; o risc o de tornar os tecidos
duros e friáveis.
Clarificadores: xilol; be nzol; tolueno; ciclo -hexanona.
Sequência:
Álcool xiolol 2 horas
Xilol 1 hora
Xilol ½ hora
5ª etapa: Inclusão.
A inclusão é o processo pelo qua l a p arafina em bebe os tecidos, ocupando to dos os locais onde in vivo
havia água e solidifica o material em um bloco sem irrígido d e paraf ina, do qu al podem ser tiradas fatias
delgadas, de cerca de 5µm. O processo de inclusão é dividido em : embebição e inc lusão definitiva.
Embebição ou im pregnação: etapa na qual os tecidos, impregnados de xilol, são imersos em parafina
fundida a 56oC e mantidos em estufa a este temperatura até que se complete e s ubstituição do xilol pela
parafina.
Inclusão definiti va: etapa n a qual os tecidos já impregnados de parafina são postos num a fôrma cheia de
parafina f undida, que se deixa solid ificar a frio para form ação de um bloco. A esta paraf ina geralm ente
são acrescentadas ceras. Obs.: A i nclusão é uma f ase crítica pois, se m uito pida, poderá não retirar
totalmente o xilol e o c alor em dem asia torrará os tecidos, introdu zindo artefatos.
6ª etapa: Microtom ia.
Objetivo: obtenção de um corte de paraf ina con tendo no interi or as part es o aquosas d os teci dos,
posto que a água foi su bstituída pela paraf ina como a m enor distorção possível.
Resultado: cortes agrupados que se põe a distender f lutuando em água qu ente e da qua l os cortes são
individualizados e reco lhidos por m eio de pinça e fixados sobre lâm inas de vidro.
Uma das capacidades mais difíceis, frustrantes e dem oradas, necessárias na histo logia, é aprender a
visualizar um corte de tecido em lâmina, que pode s er longitudinal, oblíquo e transversal.
7ª etapa: Coloração.
Na microscopia óptica usam -se principalmente corantes solúveis em água, por isso, a parafina precisa
primeiramente ser r emovida d os cortes, depois, o tecido é re idratado e corado. Os v ários tipos de
corantes desenvolvidos para a visualização dos m uitos com ponentes d as células e dos tecidos podem
ser agrupados em três classes: