TECNICAS HISTOLOGICAS

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ÍNDICE
	ASSUNTO
	PAG.
	Métodos de exame....................................................................
	2
	Etapas de preparo dos cortes
	
	 Colheita de material .............................................................
	3
	 Fixação ................................................................................
	4
	 Fixadores simples ................................................................
	6
	 Misturas fixadoras ................................................................
	7
	 Processamento da fixação ..................................................
	11
	 Desidratação.........................................................................
	13
	 Clarificação ou diafanização ................................................
	13
	 Impregnação ........................................................................
	14
	 Microtomia ...........................................................................
	14
	Etapas da coloração .................................................................
	17
	Microscopia óptica
	
	 Histórico ............................................................................... 
	27
	 Poder de resolução ..............................................................
	29
	 Microscopia de contraste de fase ........................................
	30
	 Microscopia de polarização .................................................
	30
	 Microscopia confocal ...........................................................
	31
	 Microscopia de fluorescência ..............................................
	32
	Microscopia Eletrônica ..............................................................
	32
TÉCNICAS HISTOLOGICAS
1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS:
		A maior parte do nosso conhecimento sobre a natureza microscópica do organismo resulta da remoção de pequenas amostras representativas de tecidos ou órgãos, cortadas em fatias muito delgadas, conhecidas como “cortes histológicos”, apropriadas para o estudo ao microscópio. Os cortes devem ser suficientemente finos de modo a permitirem a passagem de feixes de luz. No microscópio óptico comum, o feixe de luz vem de baixo para cima e deve atravessar toda a espessura do corte, antes de atingir a lente objetiva, a lente ocular e, finalmente, o olho do observador. 
 O propósito fundamental da técnica histológica é obter cortes bastante finos para que não haja superposição de componentes celulares do tecido, pois do contrário, não poderiam ser visualizados como entidades separadas. Por isso os cortes são seccionados em fatias mais delgadas do que o diâmetro da maioria das células, e este trabalho de seccionamento é realizado através de um aparelho denominado micrótomo.
	Para serem examinados ao microscópio óptico, em geral os cortes são preparados pela técnica de parafina, cujas seqüências serão descritas a seguir:
2 - MÉTODOS DE EXAME OU MÉTODOS HISTOLÓGICOS 
		São procedimentos diversos que no final os fragmentos de tecidos ou órgãos tornam-se examináveis ao microscópio óptico.
		Os métodos de exame podem ser divididos em imediato e mediato.
2.1. IMEDIATO (IN VIVO)
2.1.1. Sem coloração - é o exame a fresco, sem reativos modificadores. O exame a fresco baseia-se nas diferenças de índice de refração das células ou tecidos. Por exemplo, os protozoários, larvas de insetos, hemácias, leucócitos, células descamadas são interpostas entre a lâmina e lamínula de vidro, com um “líquido indiferente” e observados ao microscópio óptico. 
 Os líquidos indiferentes são isotônicos e podem ser (soro, plasma, líquido amniótico, líquido ascítico, humor aquoso) e artificial (solução salina fisiológica a 0,9%, líquido de Ringer, líquido de Loeke e solução de Tyrode).
 2.1.2. Com coloração - Também conhecida como coloração vital que aumenta o índice de refração de algumas estruturas, realçando-as. A coloração intravital é a introdução de corante vital no animal vivo pela ingestão, inoculação do corante no sangue, linfa ou tecido subcutâneo ou imersão nos corantes (ex.: protozoários). 
 Corantes vitais - São soluções diluídas de corantes naturais ou artificiais atóxicos.
2.2. MEDIATO (EXAME POST-MORTEM)
 		Necessita de: colheita de material, fixação, obtenção de cortes histológicos e coloração. O método mediato permite a preparação de cortes histológicos permanentes.
 
 
3 - ETAPAS DE PREPARO DE CORTES 
 
COLHEITA DE MATERIAL
		Uma das condições básicas para uma boa fixação e consequentemente, preservação do material é que o fixador seja aplicado às amostras coletadas (fragmentos de tecidos ou órgãos) tão cedo quanto possível após a coleta cirúrgica ou post-mortem. Portanto, é particularmente necessário que antes do sacrifício do animal todos os instrumentos de necropsia e fixadores estejam preparados e reunidos no local de trabalho em ordem operacional. Este procedimento facilitará um trabalho rápido e produtivo, evitando alterações das estruturas celulares (autólise).
		Na colheita do material, tão logo o animal esteja anestesiado ou morto deve ser dissecado rápida e cuidadosamente a fim de evitar a autólise. Na obtenção do fragmento deve haver um mínimo de manipulação, evitando-se pensamento ou esmagamento com instrumentos inadequados. Para cortar o órgão ou fragmento de tecido devem ser usadas lâminas bem afiadas. O uso de instrumentos estragados ou cegos comprime o material e distorce a disposição estrutural das células e dos elementos tissulares. Devemos imprimir aos instrumentos cortantes um “movimento de serra” para obtenção de cortes ideais, recorrendo o menos possível à pressão.
		Como já foi salientado, o material colhido, e posteriormente processado, deve ser adequado ao estudo proposto. Assim é conveniente saber, se possível com antecedência, quais os órgãos ou tecidos que devem ser obtidos e nestes, quais as áreas mais significativas para o estudo proposto. Por exemplo, os órgãos, os tecidos ou as áreas prioritárias são aqueles onde há interesse na histologia ou evidência de lesões macroscópicas quando o interesse está voltado a histopatologia. Cortes ou pequenas fatias devem ser retiradas de várias partes normais, lesionadas, assim como das áreas de transição de acordo com o estudo em proposição.
		Quando ocorre a remoção de vários órgãos a serem fixados, cada órgão deve ser dissecado o mais rápido possível e colocado imediatamente no líquido fixador inicial (pré-fixação), tendo-se o cuidado de secciona-lo em fatias. No final da necropsia, os órgãos previamente fixados deverão ser convenientemente recortados em finas fatias e colocados nas soluções fixadoras definitivas. Se possível, as fatias não devem ultrapassar 0,5 mm de espessura; em alguns casos, fatias ainda mais finas são necessárias para que o líquido fixador possa penetrar rápido e homogeneamente.
		Se os órgãos a serem removidos são os do tubo digestivo, devem ser logo recortados e fixados, pois a membrana mucosa é bastante suscetível de sofrer autólise ou alterações post-mortem. Os intestinos são mais bem tratados através de uma irrigação com solução salina, a fim de se remover o conteúdo intestinal e, em seguida, devem ser recortados em porções e mergulhados no líquido fixador. Pode-se também afixar uma porção do órgão à superfície inferior de uma placa de cortiça posta a flutuar na solução fixadora. 
		O processo autolítico post-mortem é mais rápido nos órgãos produtores de enzimas, como a glândula salivar, o estômago, o fígado, o pâncreas e o intestino, sendo mais lento nos tecidos de sustentação, como o conjuntivo. Desse modo, aqueles órgãos suscetíveis à autólise devem ser colhidos e fixados em primeiro lugar.
		Os órgãos ocos devem, depreferência, ser distendidos com o liquido fixador e, em seguida, colocados em um recipiente adequado contendo o fixador. Posteriormente, podem ser recortados em finos fragmentos.
		O excesso de sangue e de muco na superfície dos órgãos forma um filme protetor, impedindo a penetração adequada do fixador nos tecidos. Portanto, estes órgãos devem ser cuidadosamente lavados com salina antes de serem fixados.
		Órgãos ou tecidos encapsulados devem ser abertos para uma boa penetração do fixador. Tecido com tendência a enrolar-se depois de seccionado, deve ser distendido em uma fina placa de cortiça que será posta a flutuar no líquido fixador com o lado contendo o fragmento para baixo.
		Pequenos fragmentos, de um mesmo animal, podem ser colocados em conjunto num recipiente poroso, que é logo depois mergulhado na solução fixadora. Preparações rápidas e adequadas podem ser obtidas de um procedimento denominado “impressão” que consiste em se pressionar, levemente, a superfície de corte fresca de um tecido contra uma lâmina de vidro e, em seguida, fixar e corar as células aderentes com métodos rápidos de coloração (antes retirar o excesso de sangue pressionando levemente a superfície com um pedaço de papel filtro). O fragmento de tecido restante deve ser, como habitualmente, seccionado em fatias e fixados convenientemente.
		Uma boa colheita de material garante uma boa fixação e, essa, dessa forma, garante um ótimo corte histológico, facilitando também a coloração do mesmo.
3.2. FIXAÇÃO 
		A fixação constitui um dos processos fundamentais no exame histológico de organismos animais e vegetais. A fixação depende de processos físico-químicos em que os constituintes químicos dos tecidos, principalmente as proteínas, são coagulados ou precipitados in situ por terem sido, de alguma forma, tornados insolúveis. Uma fixação racional dependerá de um conhecimento preciso das propriedades físicas e químicas dos constituintes a serem preservados e suas interações com as substâncias químicas fixadoras. Daí a razão da química da fixação ser complexa e pouco conhecida.
		Aproximadamente 65 a 70% do corpo animal é constituído de água, 15% de proteínas, 10 a 15% de lipídeos, 5% de material inorgânico, e em torno e 1% de glicídeos. Assim, deve ser considerado que os componentes químicos tissulares são diversos e com diferentes propriedades físicas e químicas, dessa maneira, um fixador ideal ou universal não somente inexiste, porém é impraticável. Os melhores métodos de fixação têm falhas, porém é possível, através de uma escolha adequada de reagentes, atingir resultados que representem satisfatoriamente as condições normais.
		A fixação pode ser realizada por agentes físicos, como o calor que é muito utilizado na fixação de bactérias. Entretanto, usualmente emprega-se a fixação química por meio de substâncias chamadas de fixadores. Alguns fixadores são vapores, porém a maioria é líquida. Um fixador pode ser definido como um fluido no qual se coloca o espécime (tecido vivo ou fresco), para preservar e estabilizar e consequentemente, evidenciar a estrutura dos seus elementos constituintes o mais próximo possível do estado vivo. Desse modo, a fixação tem as seguintes finalidades:
a) Evitar a alteração post-mortem ou autólise, isto é: destruição das células por suas próprias enzimas;
 
 matar as bactérias ou impedir a sua proliferação evitando assim, as alterações as estruturas tissulares decorrentes de sua atividade;
c) endurecer os tecidos para que possam resistir melhor às etapas posteriores da técnica histológica e para serem mais facilmente obtidos cortes delgados;
 
d) aumentar a afinidade de certos componentes tissulares pelos corantes histológicos, tornando as estruturas mais facilmente coráveis.
		O fixador mais comumente usado é a solução aquosa de formaldeído a 10% (formalina ou formol a 10%). No entanto, utiliza-se também, a depender das finalidades, uma grande variedade de outros produtos químicos, tais como: ácido pícrico (trinitrofenol); bicloreto de mercúrio; bicromato de potássio; ácido acético, ácido crômico; álcool (etílico ou metílico); ácido ósmico (tetróxido de ósmio); bicromato de cobre; ácido nítrico.
		Alguns fixadores precipitam as proteínas como o bicloreto de mercúrio e o ácido pícrico, enquanto outros coagulam, como o aldeído fórmico, o ácido ósmico e o glutaraldeido. A formalina e o glutaraldeido fixam os tecidos por se combinarem com os grupamentos amínicos das proteínas, estabelecendo assim pontes entre os aminoácidos da mesma ou de diferentes cadeias polipeptídicas.
		A exceção de formalina, acetona e álcool etílico, os fixadores são usualmente compostos de misturas de substâncias químicas, denominada “mistura fixadora” ou “fixador composto”, formuladas de tal maneira a balancear as desvantagens de uma substância com as vantagens de outra. Estas misturas visam também a limitar as alterações quando os tecidos são processados em líquidos desfavoráveis, como o xilol e a parafina quente.
		Existem várias fórmulas para fixadores na literatura; muitas delas são repetições, desde que contenha os mesmos ingredientes, variando somente nas proporções de cada um. E, dentro de certos limites, as proporções não são críticas nos resultados.
		Geralmente, a solução do fixador simples ou a mistura fixadora contém outras substâncias que visam a proporcionar pH e pressão osmótica adequados à fixação dos tecidos. Alguns fixadores, dos quais a formalina a 10% é um exemplo, preservam satisfatoriamente a maioria dos tecidos de um organismo e são chamados fixadores gerais ou universais. Estes são úteis para estudos preliminares e na preparação de material no qual cada parte ou componente deve ser, o mais possível, preservado. Outros fixadores podem preservar bem um único tipo de célula ou mesmo uma determinada subestrutura celular e estragar completamente o resto do tecido. Apesar disso, sua utilização é indicada para fins especiais. 
		Para melhores resultados, o fixador deve ser escolhido em função tanto da preservação de algum constituinte ou elemento particular do tecido a ser estudado quanto do corante a ser empregado no estudo. Um fato importante é que colorações especiais para determinadas estruturas microscópicas são possíveis, unicamente, se precedidas de uma fixação adequada. Em geral, existem indicações dos fixadores apropriados para as colorações específicas.
FIXADORES SIMPLES
Formaldeído
		O formaldeído é um gás solúvel em água (aproximadamente, 37 a 40%). O termo correto é formalina e não formol, como é conhecido. Na rotina é utilizada uma solução de formalina a 10% (10 ml de formaldeído a 40%, para 90 ml de água - que na realidade a solução se torna a 4% ao invés de 10%). 
		 Entretanto, com o tempo, esta solução oxida-se em ácido fórmico. Para neutralizar esta reação, comumente adiciona-se carbonato de cálcio (GIZ), em excesso, no recipiente. A formalina ácida reage com os tecidos ricos em sangue, produzindo a deposição de cristais de coloração marrom escura (pigmento de formalina). Este artefato pode ser evitado usando-se formalina tamponada. A formalina é um fixador de ação lenta e endurece moderadamente os tecidos. Causa pouco enrugamento dos tecidos, porém este defeito pode aumentar significativamente, durante a desidratação e infiltração, especialmente se a fixação foi incompleta. Tem pouco efeito nas gorduras neutras, não as preservando bem, nem as destruindo. No entanto, enquanto preserva as proteínas, os lipídios podem ser perdidos após uma fixação prolongada. Pela sua simplicidade, a formalina é geralmente usada nos trabalhos histológicos de rotina sendo o líquido de escolha na preservação de peças anatômicas (por manter a transparência e a pigmentação naturais dos tecidos). É extremamente irritante para as mucosas, podendo também causar dermatite; Por isso, o ambiente deve ser bem ventilado no local de estoque da formalina eao manuseá-la, deve-se usar luvas.
		Fixar os tecidos pelo menos 24 horas, em temperatura ambiente (25º C), ou 12 horas a 45º C, ou durante 6 horas a 55º C - se o período for reduzido, por alguma razão importante, deve ser usada solução de formalina ais forte: por exemplo - uma hora em formalina a 20%, em temperatura a 35º C. Entretanto, é possível prolongar esta fixação por maior período de tempo (semanas ou mesmo meses). Há quem recomende remover o fixador dos tecidos, utilizando-se álcool a 70%, durante um dia, e em seguida álcool a 80% durante um a vários dias. É um fixador recomendado para tecido animal em geral, especialmente tecido nervoso, e para material a ser seccionado por congelação, assim como para inclusão em celoidina. Esta fixação permite o uso da maioria dos corantes, porém é menos adequada à coloração com corantes ácidos.
Álcool Etílico e Álcool Metílico
		O álcool é mais utilizado como fixador de vegetais e em citologia. É um agente redutor, incompatível com o ácido crômico, tetróxido de ósmio e dicromato de potássio. Albumina e globulinas são precipitadas; ácidos nucléicos são subsequentemente perdidos; grande parte das gorduras é dissolvida. Os tecidos sofrem grande enrugamento, dificultando a coloração. Os corantes como hematoxilina e carmim são eficazes. Pequenos fragmentos de tecidos devem ser colocados em álcool etílico absoluto, gelado, durante uma a três horas. 
		O álcool metílico e usualmente empregado na fixação de esfregaços de sangue, impressões, e para cortes de tecido em criostato. 
Ácido Pícrico 
		É um agente que penetra lentamente nos tecidos e não os endurece. Causa significativo enrugamento dos tecidos. Parece não ter efeito sobre lipídios, exceto provocar coalescência de pequenos glóbulos de gordura. As proteínas são precipitadas, formando picratos de proteínas, que se admite serem solúveis em água. Os tecidos devem ser lavados em álcool a 70%, pois a coloração amarelada de impregnação nos tecidos fixados deve ser removida por um banho em álcool a 70%, contendo carbonato de lítio saturado (isto durante o banho de hidratação dos cortes).
		O ácido pícrico quando seco é altamente explosivo e deve ser guardado úmido.
Ácido Acético
		É incluído em muitas misturas fixadores a fim de neutralizar o efeito de enrugamento de outras substâncias químicas fazendo parte dessas misturas.
		Como a maioria dos ácidos, causa intumescência dos tecidos, especialmente das fibras colágenas. É raramente utilizado como fixador simples. O tempo de penetração é rápido. Não fixa proteínas; os carboidratos não são fixados, nem destruídos; alguns lipídios são perdidos. Os tecidos devem ser lavados em álcool a 70%, antes da desidratação. É recomendado mais para histologia de vegetais, em citologia e histologia de artrópodes. Amolece o tegumento dos artrópodes, facilitando a penetração de substâncias fixadoras.
MISTURAS FIXADORAS
Formalina Tamponada Neutra (pH 7,0) de Lillie
Uso: Como fixador de tecido animal em geral; para tecidos patológicos e na demonstração de pigmento férrico (hemoglobina, hemossiderina). Previne a formação de precipitado de formalina. Pode ser utilizado na preservação de glicogênio em tecido animal.
Preparação: 
Formaldeido a 40% --------------------------------- 100 ml
Na2HPO4 (anidro) ---------------------------------- 6,5 g
NaH2PO4H2O ---------------------------------------- 4,0 g 
Água destilada --------------------------------------- 900 ml
Procedimento:
Fixar os tecidos durante um a dois dias ou por um período maior de tempo.
Formalina com Cloreto de Cálcio de Baker
Uso: Como fixador geral de rotina para tecido animal. O cloreto de cálcio neutraliza a oxidação de formalina em ácido fórmico e, dessa maneira, evita a formação de pigmento de formalina nos tecidos.
Preparação:
Formaldeido a 40% ------------------------------ 100 ml
Solução aquosa de CaCl2 a 10% --------------- 100 ml
Água destilada ------------------------------------ 800 ml
Procedimento:
Idêntico ao anterior.
Formalina com Salina
Uso: Como fixador geral de tecidos animal. A salina evita a infiltração hidrópica dos elementos tissulares, durante a fixação.
Preparação:
Formaldeido a 40% ----------------------------- 100 ml
NaCl ----------------------------------------------- 8,5 g 
Água destilada ----------------------------------- 900 ml
Procedimento: 
Idêntico ao anterior
Formalina Alcoólica
Uso: Recomendada na preservação de glicogênio.
 
 Preparação:
Formalina a 40% -------------------------------- 15 ml
Água destilada ----------------------------------- 85 ml
NH4Br -------------------------------------------- 2,0 g
Procedimento:
	É um fixador muito ácido (pH 1.5) e, desse modo, os eritrócitos são destruídos. Tempo de fixação: 2 a 25 dias;
Ótimo – 5 dias.
Líquido de Zenker (pH 2,3)
Uso: Para tecido animal em geral, especialmente válido na demonstração de detalhes histológicos. Entretanto mitocôndrias e aparelho de Golgi são destruídos. Quase todas as colorações podem ser usadas em tecidos fixados com este líquido.
Preparação:
Bicromato e potássio (K2Cr207) ---------------- 2,5 g
Bicroreto de mercúrio (HgCl 2) ---------------- 5,0 g
Água destilada ------------------------------------ 100 ml
Ácido acético glacial ----------------------------- 5 ml 
Dissolver os sais na água com o auxílio de aquecimento. O ácido acético deve ser adicionado imediatamente antes de ser usada a solução fixadora.
Procedimento:
Fixar os tecidos durante 2 a 4 horas. Os tecidos fixados devem ser lavados com água corrente e preservados em álcool a 70%; ou lavados, várias vezes, com álcool a 60% e preservados em álcool a 80%. Os depósitos cristalinos de cloreto de mercúrio devem ser removidos dos tecidos antes dos cortes serem corados. Após os cortes terem sido desparafinados devem ser colocados em iodo (lugol) por 5 minutos e, sucessivamente, lavados com água por 5 minutos; em tiosulfato de sódio a 5%, durante 5 minutos e lavados em água corrente.
Líquido de Helly (Formalina de Zenker (pH 4,7)
Uso: Para tecido animal em geral. Citoplasma e mitocôndrias são bem preservados. É o fixador de escolha para órgãos hematopoiéticos, como medula óssea e para tecidos moles onde a descalcificação é indicada.
Preparação:
K2Cr207 ---------------------------------------------- 2,5 g
HgCl2 ------------------------------------------------ 5,0 g 
Água destilada ------------------------------------- 100 ml
Formalina neutra a 40% -------------------------- 5 ml
	O modo de preparar deste líquido é basicamente o mesmo do de Zenker. Adicionar a formalina imediatamente antes de ser usado.
Procedimento:
	Fixar os tecidos durante 2 a 4 horas. Lavar durante 12 a 24 horas, em vários banhos de álcool a 70% e, então transferir para álcool a 80%. 
Líquido de Bouin (pH 1,6)
Uso: Para tecido animal em geral. É um bom fixador para cromossomos. Inclusões citoplasmáticas e muitas outras substâncias na célula tornam-se solúveis em água e a remoção das mesmas, durante o processamento, resulta na formação de vacúolos no tecido. Se corantes básicos são indicados na coloração, os depósitos amarelados do ácido pícrico devem ser removidos, colocando-se os cortes desparafinados numa solução saturada de carbonato de lítio em álcool a 70%, durante alguns minutos.
Preparação:
Solução aquosa de ácido pícrico saturado (aproximadamente a 1,22%) -------- 75 ml
Formalina a 40% ----------------------------------------------------------------------- 25 ml
Ácido acético glacial ------------------------------------------------------------------- 5 ml
O ácido acético deve ser adicionado no momento do uso.
Procedimento:
Tempo de fixação: 6 a 12 horas. Os tecidos após a fixação devem ser lavados em álcool a 70%, até que oácido pícrico seja quase totalmente removido.
Líquido de Carnoy (pH 2,7)
Uso: Para tecido animal em geral. Para glicogênio nos tecidos, após a fixação, especialmente se usado a 3º - 5º C. Citoplasma e núcleo são fixados: lipídios e pigmentos solúveis em ácido são dissolvidos; a mielina é perdida, porém os grânulos de Nissl são preservados. Recomendado como fixador para ácidos nucléicos, a serem evidenciados em cortes de parafina. 
Preparação:
Ácido acético glacial ------------------------------- 10 ml
Álcool etílico absoluto ----------------------------- 60 ml
Clorofórmio ----------------------------------------- 30 ml
Procedimento:
Este é um fixador de ação rápida e, portanto, não deve atuar nos tecidos mais do que 2 horas. Fixar pequenos fragmentos durante 1 a 2 horas, em temperatura ambiente, com álcool absoluto (passar diretamente ao álcool absoluto no processamento da desidratação). Para glicogênio, fixar a 3º - 5º C, durante 24 horas. Na preservação ou estocagem, os tecidos devem ser colocados em líquido de petróleo ou incluídos em parafina.
Formalina - Álcool - Acética de Lillie
Uso: Fixador substituto do líquido de Bouin em álcool a 70%.
Preparação:
Líquido de Orth 
Uso: Para tecido animal em geral; intestino humano, em particular. Especialmente indicado quando uma consistência firme de tecido mole é desejada; também, no estudo de processo degenerativo agudo, com coloração pela eosina - azul.
Preparação:
Este líquido deve ser utilizado fresco. O formaldeído deve ser adicionado no momento do uso.
Procedimento:
Fixar fragmentos de tecido de espessura inferior a 1 cm, durante 2 a 4 dias. Lavar em água corrente, durante 6 a 24 horas e, em seguida, colocar em álcool a 80%.
 
PROCESSAMENTO DA FIXAÇÃO
Na escolha de um fixador devem ser considerados alguns critérios fundamentais:
 
As seguintes regras gerais devem ser seguidas na fixação de órgãos ou tecidos:
 Se for necessário orientar a superfície de corte do tecido a ser processado, a superfície oposta contralateral deve ser marcada com tinta nanquim. Se o fragmento for suficientemente grande, a retirada de uma pequena parte ou fatia em cunha do mesmo pode ser suficiente para esta identificação.
Tratamento Pós-Fixação
	Os tecidos fixados podem ser estocados em soluções apropriadas, porém o melhor procedimento é incluí-los o mais cedo possível.
Lavagem
	Na maioria das vezes, após a fixação, o excesso do líquido no fixador deve ser removido dos tecidos, uma vez que interferência negativa como processamento subsequente. A lavagem é feita, em geral, colocando o tecido em água corrente, durante algum tempo.
	Os tecidos fixados em álcool absoluto ou em Líquido de Carnoy podem ser processados imediatamente, �������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������desde que a desidratação já tenha sido iniciada durante a fixação. A maioria dos fixadores, incluindo a formalina, permite que os tecidos sejam lavados colocando-os em álcool a 70%.
	A exceção desta regra é o tecido fixado em mistura contendo bicromato de potássio ou ácido crômico. Nestes casos, a amostra deve ser lavada em água corrente, durante uma noite, a fim de evitar a precipitação de cristais e, então colocada em álcool a 70%.
Remoção de pigmento de formol em cortes histológicos 
SOLUÇÃO DE ÁLCOOL AMONIACAL 
Amônia PA ........................... 1,0 ml 
Álcool 75% ........................ 200,0 ml 
PROCEDIMENTO 
1. Desparafinizar e lavar em água corrente 
2. Submeter a solução de ÁLCOOL AMONIACAL durante 30 minutos 
3. Lavar por 10 minutos 
4. Seguir a coloração ou reação
Estocagem em Preservantes
	Como foi salientado, após os tecidos terem sido fixados e lavados deverão, preferencialmente, ser desidratados e incluídos imediatamente, para melhor preservação das estruturas microscópicas. Entretanto, ser isto não for exequível, os tecidos podem ser estocados, em geral, em álcool a 70%, durante um curto período de tempo. Se prolongado, muitas das reações de coloração serão prejudicadas. Isto também se aplica ao caso de tecidos fixados em formalina a 10%, durante muito tempo. Daí a razão de se usar a formalina neutra, que supera esta desvantagem.
	Outro meio utilizado na estocagem de tecidos é uma solução aquosa de dietilenoglicol a 10%.
Descalcificação dos Tecidos
	Para o estudo das partes moles dos tecidos contendo sais de cálcio, tais como osso, dente, cartilagem calcificada, etc., necessário se torna a remoção desses sais de cálcio, antes que os tecidos sejam cortados da maneira usual. Caso contrario, as estruturas calcificadas irão interferir negativamente na obtenção dos cortes pela microtomia, estragando definitivamente as navalhas. Este processo é conhecido como descalcificação dos tecidos. 
	A maioria dos métodos de descalcificação envolve tratamento por um ácido, que normalmente é feito após a fixação do tecido, em temperatura ambiente. Embora sob aquecimento a descalcificação seja acelerada, isto deve ser evitado pelo fato de também interferir com a coloração, por provocar intumescência dos tecidos. O vácuo ou a agitação mecânica não parecem acelerar a descalcificação.
	O volume do líquido descalcificador deve ser 100 vezes aquele do tecido. O líquido deve ser colocado em um recipiente com tampa não vedada, devendo ser evitada tampa metálica.
	Os tecidos não devem permanecer nas soluções ácidas além do tempo necessário para uma descalcificação completa. O processo da descalcificação deverá ser controlado durante todo o tempo. 
	 Após a descalcificação, o fragmento de tecido pode ser aparado com uma lâmina cortante afiada, processo esse que também serve para se constatar se a descalcificação foi completa. Um método que também pode ser utilizado para controlar o processo da descalcificação é o seguinte: adicionar ao líquido descalcificador, contendo o espécime, um ml de uma solução aquosa de amônia a 5% ou de oxalato de sódio a 5%, deixando atuar durante 5 minutos. Se a solução permanece clara, isto significa que a descalcificação foi completa. Se há formação de um precipitado, significa que o processo de descalcificação continua.
Líquidos Descalcificadores
	As seguintes soluções são, entre outras, usadas na descalcificação: solução aquosa de ácido fórmico a 5 ou 10%; solução aquosa de ácido nítrico a 7%; solução aquosa de ácido clorídrico, 1 a 8%. Estes ácidos também podem ser preparados em soluções alcoólicas; entretanto, nestas a velocidade de descalcificação é mais lenta. Caso as soluções descalcificantes sejam preparadas em álcool, os tecidos devem ser lavados em álcool a fim de se prevenir intumescência dos tecidos, pela combinação do ácido com a água.
	Para os propostos de rotina, os tecidos devem ser lavados, após a descalcificação, em água corrente, durante 24 horas. 
3.3 - DESIDRATAÇÃO
 		De modo a facilitar a obtenção de cortes finos de tecidos ou órgãos, os fragmentos dos mesmos, devidamente fixados, devem ser incluídos em parafina. Para que isto seja possível é necessário eliminar toda a água do tecido, pois a parafina não é miscível com a água. A retirada da água, denominada “desidratação”, se faz tratando-se os fragmentos de tecidos sucessivamente com agentes desidratantes em concentrações crescentes. 
	Os agentes desidratantes empregados são etanol, butanol, isopropanol, dioxano, etc., porém o mais utilizado é o etanol ou álcool etílico.
	
As etapas da desidratação
3.4. CLARIFICAÇÃO OU DIAFANIZAÇÃO
 	Em virtude de a parafina também não ser solúvel em álcool, há necessidade de tratar os fragmentos previamente desidratados com um solvente de parafina (Xilol, Toluol e Benzeno).
 	Esta etapa é conhecida como “impregnação por solvente de parafina” ou “clarificação”. O solvente maisempregado é o Xilol (xileno) e consiste em passar os fragmentos de tecidos desidratados por algumas trocas de xilol, tendo como resultado que todo o álcool embebido no fragmento de tecido seja substituído pelo Xilol.
As Etapas da Diafanização
 
 1) Xilol - Álcool Absoluto (1:1) ---------------- 1 hora 
 2) Xilol I ------------------------------------------ 2 horas
 3) Xilol II ----------------------------------------- 2 horas
3.5 - IMPREGNAÇÃO 
 É a etapa que permite, finalmente, que o fragmento de tecido ou órgão fique pronto para queseja cortado fino, o suficiente para permitir o exame microscópico. O fragmento impregnado pelo xilol passa então por algumas trocas e parafina para histologia liquefeita (isto se obtém aquecendo-se a parafina na estufa com controle termostático, sendo o ponto de fusão da parafina de 56-58°C. A estufa deve estar regulada a 60ºC). Existem equipamentos denominados “processadores automáticos de tecidos” que realizam todo o processamento, desde a desidratação até a impregnação pela parafina.
As Etapas da Inclusão
 1) 1º banho de parafina liquefeita-------------------- 1 hora 
 2) 2º banho de parafina liquefeita-------------------- 1 hora
 3) 3º banho de parafina liquefeita-------------------- 1 hora 
 4) Inclusão propriamente dita com formação do bloco. 
A parafina fundida será vertida em recipientes próprios ou formas aquecidas fora da estufa. Colocar-se-ão os fragmentos de tecidos ou órgãos no recipiente, orientando-os na posição desejada para efetuar os cortes e identificando-os. Em alguns minutos a parafina ter-se-á solidificado completamente.
Após a inclusão e solidificação completa da parafina deve-se realizar a retirada do excesso de parafina que é melhor executado com uma faca afiada. O processo é denominado desbastamento e os lados opostos dos blocos devem ser paralelos. Os blocos assim desbastados devem assumir uma forma quadrangular, retangular ou pirâmide quadrangular truncada.
 Observações: As parafinas de baixo ponto de fusão não são indicadas para realizar cortes finos. Para os trabalhos de rotina, é desejada a parafina de ponto de fusão entre 56 a 58º C, mas se desejar melhorar as propriedades da parafina como a dureza, adesividade, pode-se adicionar pequenas quantidades de cera de abelha, cera de carnaúba, asfalto, borracha e polímeros de plástico. 
 Existem à venda no mercado parafinas especiais nas quais são adicionados produtos (como o Dimetilsulfato - DMSO) que melhoram o poder de penetração no tecido.
 A parafina é utilizada na impregnação e inclusão dos tecidos e órgãos, deve ser aquecida e filtrada previamente.
		É conveniente que a parafina de inclusão seja nova e aquecida em torno de 2 a 3ºC acima do seu ponto de fusão. 
3.6. - MICROTOMIA
 3.6.1. - Montagem do bloco de parafina no porta-bloco ou suporte. 
	O fragmento e tecido ou órgão incluído em parafina tem de ser montado no porta-bloco ou suporte e adaptado ao micrótomo para ser seccionado. Existem vários tipos de suportes disponíveis, entretanto, a escolha depende da disponibilidade ou preferência, pois o objetivo é fixar o bloco no suporte e adaptar ao micrótomo para obtenção dos cortes finos.
	3.6.2. - Corte do Bloco de Parafina.
 Para obter sucesso na obtenção de cortes histológicos é necessário um técnico experiente, um micrótomo bem regulado e uma navalha bem afiada.
		Os cortes não devem ultrapassar a espessura de 5 micrômetros. Para obter cortes finos na microtomia, dependemos de diversos fatores como: a natureza do tecido, o fio e a inclinação da navalha e a temperatura ambiente. Os blocos de parafina devem ser resfriados no refrigerador ou colocados sobre cubos de gelo, antes de efetuar os cortes. Alguns autores recomendam colocar um papel filtro entre a superfície do bloco de parafina e o gelo, para evitar a formação de cristais de gelo no tecido incluído na parafina. 
		A navalha também pode ser resfriada colocando-se cubo de gelo na sua superfície, poupando-se, entretanto, o fio a navalha. Para efetuar os cortes de tecidos descalcificados é conveniente usar navalhas descartáveis. Se houver estriações contínuas nos cortes, mesmo mudando a posição do fio da navalha, isto indica que há depósito de cálcio no tecido a ser cortado ou presença de sujeiras na parafina do bloco. Encontrando-se depósito de cálcio nos tecidos moles deve-se embeber a superfície do bloco com uma solução de ácido clorídrico a 2%, durante uma hora e, depois, lavar com água. Este procedimento poupará o fio da navalha.
 O micrótomo não deve ser operado com movimentos excessivamente rápidos; a operação deverá ser delicada, contínua e relativamente lenta para obter fitas de cortes uniformes. 
3.6.3. - Problemas na microtomia e Causas
		Dificuldades na obtenção de uma fita contínua de cortes, fitas de cortes encurvadas, enrolamento do corte em torno de si, cortes enrugados e comprimidos, som metálico ou de raspagem durante o corte, variação na espessura dos cortes, fenda dos cortes obtidos, fragmentação de tecido durante a microtomia, aderência da fita dos cortes na navalha, etc., são os problemas encontrados na microtomia. 
As causas são diversas, mas podemos enumerar algumas mais frequentes: a parafina muito dura ou mole, a temperatura ambiente muito fria ou quente, micrótomo não ajustado, navalha cega, blocos não desbastados adequadamente, ângulo da navalha incorreto, fragmento de tecido muito duro, sujeira na parafina, excessiva clarificação dos tecidos, agente clarificador não removido, infiltração de parafina insuficiente, elasticidade estática, umidade excessiva na sala de microtomia, etc., são as causas adversas à microtomia.
	3.6.4. - Colocação dos Cortes em Lâmina de Vidro 
		Consiste em se espalhar o corte de parafina sobre lâmina de vidro. Os cortes obtidos na microtomia apresentam-se ligeiramente enrugados e normalmente são estendidos em uma cuba especial contendo água aquecida (45ºC). Em seguida, são colhidos em uma lâmina de vidro própria para histologia a qual é deixada em uma bandeja de metal na estufa aquecida a 55ºC, onde a água remanescente é evaporada. As lâminas de vidro devem ser “quimicamente” limpas; os cortes devem ser completamente estendidos e em perfeito contato com a superfície da lâmina. 
		Em geral, para uma melhor fixação do corte na superfície da lâmina, utilizam-se soluções com propriedades adesivas, por exemplo, albumina de Mayer (50 ml de clara de ovo; 50 ml de glicerina; um cristal de timol como preservativo). Colocar uma pequena porção deste preparado sobre a lâmina e espalhar com o dedo mínimo colocando-se a seguir os cortes sobre a lâmina. As lâminas com os cortes devem ser identificadas com lápis com ponta de diamante.
4. - ETAPAS DE COLORAÇÃO DOS CORTES
 
4.1. - DESPARAFINAÇÃO E REIDRATAÇÃO
 
	Antes de se corar os cortes, a parafina deve ser removida; para isso usualmente se utiliza como solvente o xilol. Em seguida, se a solução corante a ser usada for aquosa, os corte são reidratados por passagem seriada em soluções alcoólicas de concentração decrescente e água destilada. Caso a solução corante seja alcoólica é necessário hidratar os cortes até a solução alcoólica de concentração correspondente; a menos que cristais de mercúrio ou outros pigmentos devam ser removidos.
 Durante a REIDRATAÇÃO dos cortes, não deixar as lâminas secarem por completo. 
 
 4.2. - TEORIA DA COLORAÇÃO
	A coloração dos tecidos, incluindo seus elementos constituintes e produtos patológicos, em diferentes tonalidades de cores depende de vários fatores, os quais não são totalmente conhecidos. Basicamente existem duas teorias, a física e a química, que tentam explicar os fenômenos que ocorrem na coloração dos tecidos, embora a maiorparte das controvérsias entre elas são, ultimamente desnecessárias, desde que tem sido demonstrado que ocorrem mais fenômenos de natureza físico-química. 
	A teoria física defende o ponto de vista de que o corante penetra nos tecidos por osmose ou capilaridade, por adsorção ou absorção, ou por precipitação pelos ácidos e bases. A teoria química admite que o corante tem certas afinidades químicas por certas porções do protoplasma. Tem sido admitido que certas partes da célula, tal como o núcleo, são de natureza ácida e têm afinidade por corantes básicos e que o citoplasma é básico e, assim, tem afinidade por corantes ácidos.
	A maior parte dos processos que ocorrem na coloração é de natureza complexa. As colorações para gorduras são consideradas de natureza física na reação, na qual os corantes lipossolúveis tem uma maior afinidade pelas gorduras do tecido do que o solvente no qual estão dissolvidos. 
	Nenhum corante isolado ou mesmo uma técnica de coloração tem a capacidade de demonstrar todos os elementos tissulares. A maior parte dos métodos de coloração se caracteriza por combinar dois ou mais corantes misturados em conjunto, ou em uma sequência tal que os vários elementos tissulares são demonstrados pelo contraste de cores. Este processo é conhecido como coloração diferencial. 
	Denomina-se metacromatofilia ou metacromasia, a propriedade que tem uma substância de reagir diferentemente do esperado na coloração. Em geral, os corantes agem ortocromaticamente, isto é: um corante azul vai corar o tecido em azul e um corante vermelho em vermelho. Determinados corantes, tais como violeta de metila ou cristal - violeta, azul de metileno e tionina, coram metacromaticamente quando aplicados em solução aquosa. Na realidade, este tipo de corante existe em duas formas distintas, uma produzindo coloração normal azul e outra produzindo coloração metacromática vermelha. Devido a esta característica, certos elementos tissulares serão corados em azul e outros em vermelho purpúreo. A reação metacromática não é um resultado de impurezas no corante, porém é devida aos vários éteres sulfúricos presentes na mucina, nas granulações de mastócitos e na substância fundamental, os quais são capazes de reagir alterando a cor de um corante metacromático, impregnando-se com o seu componente vermelho. Infelizmente, a propriedade metacromática é parcial ou completamente perdida no processo da desidratação dos tecidos, durante o banho no álcool absoluto ou em outros desidratantes. Para a demonstração da metacromasia nos tecidos é preferível fazer-se o estudo em cortes frescos e não fixados.
 4.3. - MÉTODOS DE COLORAÇÃO 
 
 4.3.1. - Coloração Progressiva 
 Os elementos tissulares são corados até certo ponto. O processo da coloração é interrompido quando a intensidade desejada é alcançada. O grau ou intensidade da coloração é controlado ao microscópio. Este tipo de coloração não requer qualquer diferenciação.
4.3.2. - Coloração Regressiva
 O tecido é deliberadamente supercorado, sendo o excesso de corante lavado em seguida com uma solução adequada, até que se atinja a intensidade ótima de coloração. Neste caso, álcool ácido, outra solução corante ou, em alguns casos, os agentes mordentes são usados como líquidos diferenciadores.
4.3.3. - Coloração Direta
 O corante se fixa diretamente a determinados componentes tissulares, não requerendo qualquer agente mordente. 
 
4.3.4. - Coloração Indireta 
	Muitos corantes não apresentam afinidades para determinados elementos tissulares. Nestes casos, utilizam-se agentes mordentes, que atuam como agentes de ligação entre o corante e àqueles elementos tissulares. Esta operação é baseada no princípio de que o tecido é primeiramente impregnado com um agente químico capaz de se fixar ao mesmo, sendo o corante, subsequentemente, retido. 
	Os agentes mordentes são, em geral, sais de metais, tais como sulfato de amônio e alumínio, sulfato de potássio e alumínio e sulfato de amônio e ferro. Certos procedimentos de coloração requerem um fixador particular, contendo o agente mordente necessário para a reação específica entre o corante e os elementos tissulares. Os agentes mordentes podem ser usados anteriormente à coloração ou mesmo incluídos na própria solução corante.
 4.4. - MÉTODOS GERAIS DE COLORAÇÃO
 4.4.1. - Coloração pela Hematoxilina e Eosina
 A hematoxilina, ou melhor, a hemateina, produto de sua oxidação, pode ser obtida sob várias formas. Para essa dupla coloração, utilizamos a hematoxilina de Delafield, embora outras fórmulas deem bons resultados; a coloração pela hematoxilina + eosina, sendo um método geral, é satisfatória para o estudo dos constituintes celulares e mesmo dos tecidos. 
I - Preparo da solução de Hematoxilina de Delafield
 Solução A: Hematoxilina --------------------- 20 g
 Álcool Absoluto ----------------- 120 ml
 Solução B: Álúmen Amoniacal -------------- 300 g 
 Água Destilada ------------------ 2000 ml
 
Juntar as duas soluções, expondo o líquido à luz solar durante vários dias. Filtrar e adicionar depois à solução C.
 Solução C: Álcool Metílico ------------------ 500 ml
 Glicerina ------------------------- 500 ml
				 Após alguns dias, filtrar novamente e deixar amadurecer por um mês.
II - Hematoxilina Fosfotúngstica 
	Hematoxilina
	 1 g
	Água destilada
	500 ml
	Ácido Fosfotúngstico
	 20 g
	Água destilada
	500 ml
  
Dissolver a Hematoxilina em 500 ml de água destilada com o auxílio de calor, sem ferver e agitando sempre. Dissolver o Ácido Fosfotúngstico em 500 ml de água destilada. Juntar as duas soluções e agitar. Guardar e envelhecer durante 6 meses. 
		III - Hematoxilina de Harris 
  
	Hematoxilina
	5g
	Álcool 95%
	50 ml
	Sulfato de Alumínio e Potássio
	100g
	Água Destilada
	1000 ml
	Óxido de Mercúrio
	2,5g
Dissolver a Hematoxilina no álcool e o Alúmen na água destilada com o auxílio de calor. Misturar as duas soluções e ferver o mais rápido possível. Remover da fonte de calor e juntar o Óxido de Mercúrio aos pouquinhos com cuidado, reaquecer até a fervura e contar um minuto. Afastar da fonte de calor e mergulhar em uma bacia com água e gelo imediatamente. Adicionar 4 ml de Ácido Acético, quando o corante estiver resfriado. 
IV - Preparo da Solução de Eosina 
 Eosina Amarela -------------- 10 g
 Água Destilada--------------- 1000 ml
 
 Técnica de Coloração
			 
	 RESULTADO: Núcleo - azul escuro 
 Citoplasma - fibras do tecido conjuntivo, musculares e hemácias - cor rosa. 
 
 4.4.2. - Tricrômico de Gomori
 Tecido conjuntivo – Fibras colágenas 
 
 Preparo Solução Tricrômico de Gomori
				 
 
Técnica de Coloração
Corar levemente os núcleos pela hematoxilina, após prévia hidratação do corte;
Corar pelo Tricrômico de Gomori de 5 a 20 minutos;
Diferenciar em água - ácido acético a 0,2%;
Lavar em água destilada; 
Desidratar - Clarificar;
Montar. 
 RESULTADO: As fibras colágenas ficam com uma tonalidade verde e as musculares e hemácias em vermelho.
		
		OBSERVAÇÃO: Sendo desejado um tom mais vermelho (por exemplo, no estudo das miofibrilas) a lâmina deve, antes de corada, ser colocada em solução de Bouin aquecida na estufa a 56ºC. Lavar depois ocorte em água destilada até que fique descorado da cor amarela do Bouin.
 4.4.3. - Coloração Tricrômica de Mallory
 A coloração rápida de Mallory é destinada aos tecidos conjuntivo e muscular, bem como para processos de ossificação. 
	 Preparo da Solução de Mallory
Dissolver o ácido em água; juntar o azul e orange G; aquecer até 40º C mais ou menos. Resfriar e filtrar.
 
Técnica de Coloração:
Hidratar o corte;
Corar durante cerca de 10 minutos pela solução (A); 
Lavar em água destilada;
Corar durante 10 minutos pela solução (B);
Banhar em água destilada;
Desejando obter melhor diferenciação do azul, passar corte em solução de água acética;
g) Banhar em água destilada;
h) Desidratar e montar.
RESULTADO: As partes em crescimento das cartilagens e ossos, a mucina e as fibras colágenas coram-se em azul de vários tons; os núcleos e os nucléolos, as fibras da neuroglia e os axônios se coram em vermelho; as hemácias e a mielina se coram em amarelo pálido ou rosa pálido.
4.4.4. - Técnica de Coloração para Fibras Elásticas-Orceína
Orceína de Tanzer 
 Orceína ----------------------------------- 1 g
 Álcool a 70ºGL ------------------------- 100 ml
 Ácido Clorídrico conc.----------------- 1 ml
Técnica de Coloração 
Desparafinizar e hidratar o corte;
Corar pela orceína de Tanzer por 30 minutos;
Lavar em água e descorar pelo álcool clorídrico ou álcool 70ºGL;
Corar os núcleos com hematoxilina por 10 minutos;
Lavar, desidratar e montar.
 	 RESULTADO: Fibras elásticas - castanho negro. 
 
			 4.4.5. - Técnica de Impregnação para Fibras Reticulares – Método de Gomori
				Preparo da solução de Prata amoniacal:
Para cada 10 ml de nitrato de prata em solução a 10% adicionar, lentamente, 2 ml de hidróxido de potássio; o precipitado que se forma deve ser dissolvido com amoníaco concentrado, gota a gota; em seguida adicionar novamente o nitrato de prata a 10% até que comece a se formar novo precipitado; diluir com água destilada em partes iguais.
Técnica
Desparafinizar e hidratar o corte que foi fixado com formol;
Tratar pela solução de permanganato de potássio a 0,5% por 1 a 5 minutos;
Diferenciar pela solução de metabissulfito de potássio a 3% por 1 minuto;
Lavar em água de torneira por 10 minutos;
Tratar pelo alúmen de ferro a 2% (preparado na hora) por 1 minuto;
Lavar com água de torneira por 5 minutos; 
Lavar com duas passagens em água destilada por 2 minutos cada; 
Tratar pela prata amoniacal por 5 segundos a 1 minuto;
Lavar em água destilada por 10 segundos;
Tratar pela formalina a 4 a 10% por 1 minuto;
Lavar em água de torneira por 5 minutos;
Tratar pela solução de cloreto de ouro (5 gotas de cloreto de ouro a 1% e 2 gotas de ácido acético puro para cada 10 ml) por 10 minutos;
Lavar rapidamente em água destilada duas vezes;
Tratar pelo metabissulfito de potássio a 1% por 1 minuto;
Tratar pelo tiossulfato de sódio a 1% por 1 minuto;
Lavar em água de torneira por 5 a 10 minutos;
Desidratar e montar.
 RESULTADO: Fibras Reticulares - negro.
 4.4.6. - Coloração pelo Ácido Periódico - Schiff ( PAS ) 
Soluções:
Ácido periódico (H5 IO6) 1g em 100 ml de água destilada.
A solução pode ser guardada ao ambiente. Convém substituí-la após uso em cem lâminas, para evitar o esgotamento. 
Reagente de Schiff
Água Destilada --------------------------------------- 192 ml
Ácido Clorídrico concentrado ---------------------- 8 ml
Sulfito de Sódio (Na2SO3) -------------------------- 5,0 g 
Fucsina básica (C.I. 42510) ------------------------- 0,5g
	Dissolver em vidro com tampa esmerilada, fechar bem, agitar a cada cinco minutos, até que a solução tenha uma cor entre amarelo e castanho bem clara. Adicionar 0,5 g de carvão ativado. Agitar por dois minutos. Filtrar em papel de filtro 40 ou 50. Manter na geladeira. Duração: vários meses.
- Solução molar de bissulfito de sódio (NaHSO3), 10,4 g em 100 ml de água destilada. Deixar em estoque.
- Solução de bissulfito de sódio para uso: M/20 - diluir 1:20 a solução estoque, poucos momentos antes do uso.
	Alguns autores contraindicam o banho sulfuroso. Hotchkiss trata os cortes em água corrente após o Schiff. Adams propõe o uso de HCL - 3 N.
 Na falta de sulfito de sódio, empregar 3,8 g de metabissulfito de sódio (Na2SO5).
 
Método de Coloração
1) Desparafinizar os cortes, passar pelos álcoois, remover o mercúrio no caso de ter sido usado o Helly ou o Zenker e levar em água destilada.
2) Oxidar por 10 minutos em solução de ácido periódico. Deixar uma lâmina como controle, evitando a oxidação.
3) Lavar em água corrente por 5 minutos e, rapidamente em água destilada.
4) Reagente de Schiff por 10 minutos.
5) Tratar pelo banho sulfuroso: bissulfito M/20, três banhos sucessivos, dois minutos em cada um ou HCl - 3 N, dois minutos ou água corrente por cinco minutos.
 6) Água destilada.
Hematoxilina de Harris, cinco minutos. 
Água rapidamente;
Desidratar e montar com Entellan ou similar.
	 	RESULTADOS: Glicogênio e muco substâncias presentes nas células caliciformes e no epitélio estomacal, por exemplo, coram-se em róseo.
4.4.7 - Método de Von Kossa para Cálcio 
FIXAÇÃO: Formol 10% ou preferencialmente em Álcool, Cortes com 6 m. 
Solução de NITRATO DE PRATA 5% 
Nitrato de Prata...................... 5 g 
Água destilada................. 100 ml 
Solução TIOSULFATO DE SÓDIO 5% 
Tiossulfato de Sódio...............5 g 
Água destilada.................100 ml 
Solução de SAFRANINA 
Safranina............................... 0,1 g 
Ácido Acético Glacial............ 1 ml 
Água destilada..................... 99 ml 
PROCEDIMENTO: 
1. Desparafinar, hidratar 
2. Passar por 3 vezes em água destilada 
3. Gotejar sobre o corte na lâmina o Nitrato de Prata e submeta a luz solar por 30 minutos 
à 1 hora ou luz ultra violeta ou ainda a uma lâmpada de 100 watts 
4. Enxaguar em água destilada 
5. Passar em tiossulfato de Sódio 5% 
6. Lavar em água destilada por 3 vezes 
7. Contra corar os núcleos pela Safranina por 5 minutos 
8. Desidratar, diafanizar e montar 
RESULTADO: Núcleo vermelho 
                      Citoplasma rosa 
                      Cálcio preto 
Técnica de Fontana-Masson para Melanina 
SOLUÇÃO DE PRATA AMONIACAL
Dissolver 10 g de Nitrato de Prata em 100 ml de água destilada. 
Separar 95 ml desta solução e nesta adicionar o Hidróxido de amônio em gotas, tornando a princípio a solução precipitada. Com a adição do Hidróxido de Amônio o precipitado dissolve-se. * Se a solução ficou clara utilize os 5 ml de Nitrato de Prata 10% para torna-la opalescente.
Deixe em repouso por uma noite. Da solução pronta para o uso, utilize 25 ml e acrescente 75 ml de água destilada e filtre. 
SOLUÇÃO CORANTE DE SAFRANINA 
Safranina...................................0,1 g 
Água destilada....................100,0 ml 
Ácido Acético Glacial.............1,0 ml 
SOLUÇÃO DE CLORETO DE OURO 0,2% 
Solução estoque de Cloreto de Ouro 1% ....... 10,0 ml 
Água destilada ............................................... 40,0 ml 
SOLUÇÃO DE TIOSSULFATO DE SÓDIO 5% 
Tiossulfato de Sódio .................. 5,0 g 
Água destilada ..................... 100,0 ml 
PROCEDIMENTO: 
1. Desparafinizar e hidratar até a água destilada 
2. Impregnar na solução de Nitrato de Prata/Amoniacal filtrada para o uso, e por na estufa a 56º C por uma hora. Os cortes tornam-se marrom claro 
3. Enxaguar em água destilada 
4. Submeter em Cloreto de Ouro 0,2% por 10 minutos 
5. Enxaguar em água destilada 3 vezes 
6. Reduzir em Tiossulfato de Sódio 5% por 5 minutos 
7. Enxaguar em água destilada 3 vezes 
8. Corar os núcleospela solução Corante de Safranina por 5 minutos 
9. Enxaguar em água destilada por 2 vezes 
10. Desidratar, diafanizar e montar 
RESULTADO: Núcleos rosa 
                           Grânulos argentafins -  preto
Técnica de Grimelius para grânulos de Neurosecreção 
Solução A (impregnadora) 
150 ml de água destilada 
2 ml de Nitrato de Prata a 2% 
A água deve ser aquecida até a ebulição e separando 50 ml desta água adicionar 2 ml da solução de Nitrato de Prata a 2% e aguardar a temperatura abaixar a 60º C. 
Solução B (reveladora) 
100 ml de água destilada 
5 g de Sulfito de Sódio 
1 g de Hidroquinona 
Aquecer os 100 ml de água destilada até a ebulição e adicionar os sais (Sulfito de Sódio e Hidroquinona) e aguardar a temperatura abaixar até 60º C. 
Corante Nuclear: SAFRANINA 
Safranina .................... 0,1 g 
Água destilada ........... 99 ml 
Ácido Acético ............. 1 ml 
PROCEDIMENTO: 
1. Desparafinizar e hidratar 
2. Lavar em água destilada exaustivamente 
3. Submeter na solução A por 3 minutos a 65º C 
4. Lavar em água destilada a 65º C 
5. Submeter na solução B por 1 minuto 
6. Lavar em água destilada a 65º C 
7. Repetir na solução A por 1 minuto a 65º C 
8. Lavar em água destilada a 65º C 
9. Repetir na solução B por 1 minuto 
10. Lavar em água destilada a 65º C 
11. Lavar em água destilada em temperatura ambiente 
12. Corar os núcleos pela Safranina por 1 minuto 
13. Desidratar, diafanizar e montar com resina 
RESULTADO: Grânulos argentafins impregnados (amarelo/marrom/negro)
 Núcleos em vermelho
Azul de Toluidina para Metacromasia
Fixação: Formalina a 10% 
Cortes em parafina de 6 µm 
AZUL DE TOLUIDINA 
Azul de Toluidina ..................... 0,1 g 
Água destilada ...................... 100 ml 
PROCEDIMENTO: 
1. Desparafinizar e hidratar, após água destilada 
2. Corar pelo Azul de Toluidina por 30 minutos 
3. Enxaguar em água destilada 
4. Cubra o corte com lamínula sobre uma gota de água destilada 
5. Moldure a lamínula com cera aquecida 
Recomendamos usar uma lâmina controle com um corte de cordão umbilical 
RESULTADO: Substância metacromática em róseo
Técnica de PERLS para Hemossiderina 
Fixação: Formalina a 10 % 
Cortes em parafina de 5 µm 
Soluções: 
A- Solução FERROCIANETO DE POTÁSSIO 
Ferrocianeto de Potássio...................... 2,5 g 
Água destilada.................................... 25 ml 
B- Solução ÁCIDO CLORÍDRICO 
Ácido clorídrico.................................. 5 ml 
Água destilada................................. 20 ml 
Misturar a solução A e B em partes iguais (25 + 25) sempre no instante do uso 
Solução corante de SAFRANINA 
Safranina............................. 0,1 g 
Água destilada................... 99 ml 
Ácido Acético Glacial........ 1 ml 
 
PROCEDIMENTO: 
1. Desparafinizar e hidratar 
2. Passar em água destilada 
3. Submeter a solução Cloridríco-Ferrocianeto por 1 hora 
4. Enxaguar em água destilada por 3 vezes 
5. Contracorar pela Safranina por 2 minutos 
6. Passar em água para diferenciar (controle ao microscópio) 
7. Desidratar, diafanizar e montar 
RESULTADO: Pigmento Férrico azul 
   	 Núcleos vermelho
MICROSCOPIA ÓPTICA
HISTÓRICO
 A propriedade de pedaços esféricos de vidro aumentaram imagens já era conhecida pelos assírios antes da época de Cristo. Esta propriedade, no entanto, só passou a ser efetivamente explorada por volta de 1330, quando lentes começaram a ser empregadas para melhorar a visão. Com a invenção dos óculos, as propriedades das lentes passaram a ser muito estudada, e os métodos de fabricação e polimento foram aprimorados. No final do século XVI foi descoberto que, se duas lentes são montadas apropriadamente em um tubo, obtém-se um aparelho que, quando olhado de um dos lados, permite a visualização detalhada de objetos distantes (telescópio de Galileu). O mesmo aparelho, quando olhado pelo lado oposto, permite observar objetos pequenos, invisíveis a olho nu (microscópio de Galileu).
 Este microscópio, constituído por duas ou mais lentes acopladas, denomina- se Microscópio Composto, enquanto aquele em que apenas uma lente é utilizada denomina-se Microscópio Simples.
 A invenção do microscópio composto, que ocorreu em fins do século XVI, é, em geral, creditada aos holandeses Hans Janssen, seu filho Zacharias e Hans Lippershey. No início do século XVII, microscópios compostos produzidos por fabricantes de lentes italianos e ingleses passaram a ser comuns na Europa. 
 Os primeiros microscópios compostos produziam aumentos maiores que os microscópios simples, porém a imagem que forneciam era de péssima qualidade em virtude de aberrações cromáticas. Assim, muitos preferiam utilizar microscópios simples que, quando construídos com lentes cuidadosamente polidas, forneciam aumentos razoáveis sem o problema de aberrações cromáticas. Um exemplo foi Antonie van Leeuwenhoek, um excelente fabricante de lentes que viveu na Holanda entre 1632 e 1723 e que ao falecer deixou mais de 400 modelos diferentes de microscópios. Suas lentes polidas manualmente forneciam aumentos de 40 a 270 vezes.
 Leeuwenhoek é tido como o descobridor dos seres microscópicos como as bactérias e os protozoários, além de descrever os capilares que conectam as artérias e veias, a estrutura microscópica dos músculos, dentes e outros órgãos e a confirmação de que os espermatozóides estão presentes no sêmen dos mamíferos. 
 Outros microscopistas importantes da época foram Marcello Malpighi, Nehemiah Grew e Robert Hook os quais forneceram diversas contribuições para o estudo da anatomia microscópica de órgão de animais e vegetais.
 Após essas primeiras descobertas, os estudos microscópicos progrediram muito pouco; nenhuma descoberta importante foi feita no decorrer dos 200 anos que se seguiram à descoberta da célula, por Robert Hook. O fator limitante neste caso foi, sem dúvida, a qualidade dos microscópios, que continuaram apresentando o fenômeno da aberração cromática.
 Finalmente, a partir de 1830 começaram a serem produzidas as chamadas lentes acromáticas, as quais não produzem aberração. Esta inovação resultou em um enorme progresso da indústria de microscópios, que culminou com a invenção, pelo físico alemão Ernest Abbé, do microscópio acromático com condensador, praticamente idêntico aos utilizados atualmente.
 
MICROSCÓPIO ÓPTICO
 
 
 
	
	
A parte mecânica é também denominada de estativa e serve como sistema de suporte para a parte óptica. Alguns microscópios possuem somente um tubo com uma ocular (monoculares), outros possuem dois tubos com duas oculares (binoculares). O comprimento do tubo é de 160 mm na maioria dos microscópios, porém os fabricantes pela Leitz possuem tubos com 170 mm. 
	O revólver é onde estão encaixadas as objetivas e permite a permuta rápida das mesmas com movimento giratório. Nos casos em que é necessária centralização rigorosa (microscópios de polarização, de contraste de fase, etc.) há um adaptador para uma só objetiva e dispositivo de centralização. 
	A platina ou mesa pode ser quadrada e fixa ou redonda e giratória. A lâmina pode ser presa por pinças ou em charriot que permite movimento contínuo, suave e às vezes com referência de posição (escalas e verniers).
 A luz, fornecida pelo espelho ou pelo iluminador, atravessa o condensadorsendo projetada em cone sobre as células que estão sendo examinadas ao microscópio. Esse feixe luminoso, após atravessar as células, penetra na objetiva. A objetiva projeta uma imagem aumentada, no plano focal da ocular, que novamente a amplia. 
 Finalmente, esta imagem fornecida pela ocular pode ser percebida pela retina como uma imagem virtual e invertida.
 O sistema óptico do microscópio é constituído por lentes compostas, nas quais as aberrações ópticas estão reduzidas ao mínimo, apesar de não existir lente perfeita. Quanto às objetivas, que são as lentes mais complexas, existem à venda os seguintes tipos, na ordem crescente de sua perfeição óptica: objetivas acromáticas (as mais comuns e as mais baratas), semi-apocromáticas (neofluares), planacromáticas, apocromáticas e plano-apocromáticas.
 O aumento final obtido em um microscópio é o produto da multiplicação do aumento da objetiva pelo aumento da ocular.
 As objetivas são utilizadas a seco (com o ar entre a lamínula e a lente) ou em imersão (em óleo de cedro, por exemplo: as objetivas a seco mais comumente utilizadas dão aumento de 3x, 4x, 6x, 10x, 20x e 40x; já as objetivas de imersão em óleo de cedro fornecem aumentos de 100x. 
 As oculares mais comuns ampliam em 10x ou 12x a imagem fornecida pela objetiva.
 
PODER DE RESOLUÇÃO
 Chama-se poder ou limite de resolução de um sistema óptico a sua capacidade de separar detalhes próximos ou em outras palavras: é a menor distância que deve existir entre dois pontos para que eles apareçam individualizados. Por exemplo: duas partículas separadas entre si por 0,3µ aparecem individualizadas quando são examinadas num sistema óptico com limite de resolução de 0,2µ. Mas se forem examinadas num sistema óptico com limite resolutivo de 0,5µ, aparecerão fundidas, como se fossem uma só partícula, de maior tamanho. O limite de resolução das melhores lentes utilizadas nos microscópios ópticos comuns é de 0,2µ.
 O que determina, pois, a riqueza de detalhes a imagem fornecida por um sistema óptico é o seu limite de resolução e não o seu poder de aumentar o tamanho dos objetos. O limite de resolução depende essencialmente da objetiva. A ocular não pode acrescentar detalhes á imagem, pois sua função é aumentar de tamanho essa imagem, que é projetada em seu plano de foco pela objetiva.
 O limite de resolução de uma objetiva é calculado pela fórmula: LR= k x λ 
 A.N. 
sendo k uma constante com valor de 0,61 e λ representa o comprimento de onda da luz empregada que é de 0,55 pois toma-se a faixa do verde-amarelo por ser o olho humano mais sensível a estas cores do que quaisquer outras. Portanto, na prática, o 
 Limite de Resolução = 0,61 x 0,55 
 A.N.
 Limite de resolução para objetos com distância menores que o 0,2µ é conseguido com o emprego a microscopia eletrônica cujo Poder de Resolução vai a 0,2nm.
 As objetivas trazem gravadas, além do aumento, o valor da A.N. e outros dados úteis. Em geral nelas está gravado o número 160 ou mais raramente o 170, o que indica, em milímetros, o comprimento do tubo no qual deve ser usada a objetiva, como também o número 0,17 que significa, em milímetros, a espessura da lamínula para qual as aberrações ópticas da lente foram corrigidas. A espessura da lamínula é muito importante quando usamos objetivas de grande aumento a seco. Nas objetivas de imersão a óleo, como a lamínula; o óleo de imersão e o vidro tem o mesmo índice de refração, a espessura da lamínula deixa de ser fator limitante da qualidade da imagem.
 
					 Desenho mostrando uma objetiva de 25 x, plano acromática.
 		NA = 0,45, construída para tubo de 160 mm e para lamínulas de 0,17mm de espessura. 
 Além do microscópio de campo claro que é o mais comumente empregado, existem outros tipos de microscópios ópticos, tais como: o de polarização, o de campo escuro, o de contraste de fase, etc.
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DE CONTRASTE DIFERENCIAL DE INTERFERÊNCIA
Alguns sistemas ópticos permitem a observação de células e cortes não corados. Espécimes biológicos não corados são geralmente transparentes e difíceis de serem observados com detalhes, pois todas as partes do espécime têm quase a mesma densidade óptica. Porém, a microscopia de contraste de fase usa um sistema de lentes que produz imagens visíveis de objetos quase transparentes.
A microscopia de contraste de fase é baseada no fato de que a luz muda sua velocidade ao atravessar estruturas celulares e extracelulares que tenham índices de refração diferentes. Estas mudanças são usadas pelo sistema de contraste de fase para fazer com que as estruturas apareçam mais claras ou mais escuras e fazem deste tipo de microscopia uma ferramenta poderosa para observar células vivas. 
Outro instrumento para observar células ou secções de tecidos não cotados é a microscopia de contraste diferencial (microscopia de Nomarski), que produz uma imagem aparentemente tridimensional.
MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO: 
Quando raios de luz passam através de um filtro polarizador (como um filtro Polaroid), eles saem vibrando em uma só direção. Um segundo filtro colocado com seu eixo principal perpendicular ao primeiro filtro bloqueará a passagem da luz. Se, porém, um tecido que tiver estruturas formadas por átomos e moléculas com um alto grau de orientação (como celulose, colágeno, cristais, microtúbulos e microfilamentos) for colocado entre os dois filtros, a estrutura molecular repetitiva e orientada modifica o plano de vibração da luz que emerge do primeiro filtro, fazendo com que estas estruturas apareçam luminosas contra um fundo escuro após passarem pelo segundo filtro. A capacidade que estruturas têm de girar o plano de vibração da luz polarizada é chamada birrefringência.
MICROSCOPIA CONFOCAL:
A profundidade de foco no microscópio de luz é relativamente longa, especialmente quando são usadas objetivas de pequeno aumento. Isto significa que uma grande espessura do espécime é vista em foco simultaneamente, causando a superposição da imagem originada de um objeto tridimensional. Uma das características mais importantes do microscópio confocal é o fato de que ele toma possível focalizar um plano de foco muito delgado do espécime. Os princípios nos quais este microscópio se baseia são os seguintes: 
1) O espécime é iluminado por um feixe de luz muito estreito (no microscópio de luz um feixe muito grande ilumina o espécime); 
2) a imagem coletada do espécime deve passar por um pequeno orifício. A consequência deste arranjo é que só a imagem originada do plano focalizado alcança o detector, enquanto as imagens de planos anteriores e posteriores são bloqueadas. A luz proveniente de fora do plano de foco é em grande parte eliminada, a definição do objeto focalizado fica melhor e a localização de componentes do espécime pode ser feita com muito mais precisão que no microscópio de luz.
Por razões práticas o seguinte arranjo é usado na maioria dos microscópios confocais: 
1) A iluminação é provida por uma fonte de laser; 
2) como esta fornece um ponto de iluminação muito pequeno, ele deve ser varrido sobre o espécime para permitir a observação de uma área maior do espécime; 
3) o componente do espécime que é de interesse deve ser marcado com uma molécula fluorescente (isto significa que uma secção rotineira não pode ser estudada); 
4) a luz usada para formar uma imagem é aquela que é refletida pelo espécime; 
5) a luz refletidaé capturada por um detector, onde o sinal é ampliado eletronicamente para ser visto em um monitor.
Como somente um plano focal muito delgado é focalizado de cada vez (também chamado de secção óptica), é possível reunir os vários planos de um espécime e reconstruí-los em um objeto tridimensional. Para realizar todas estas funções, os microscópios confocais dependem de grande capacidade de computação. 
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA 
Quando certas substâncias são irradiadas por luz de certo comprimento de onda, elas emitem luz com um comprimento de onda mais longo. Este fenômeno é chamado fluorescência. Na microscopia de fluorescência as secções de tecidos são geralmente irradiadas com luz ultravioleta e emitem luz na porção visível do espectro, fazendo com que as substâncias fluorescentes apareçam brilhantes sobre um fundo escuro. O microscópio de fluorescência possui uma fonte de luz ultravioleta muito intensa e filtros especiais que selecionam o comprimento de onda dos raios luminosos que atingem o espécime e também dos raios que são emitidos pelo espécime. 
	Substâncias fluorescentes com afinidade por moléculas presentes nas células ou na matriz podem ser usadas como corantes fluorescentes, como o alaranjado de acridina, que pode combinar-se com o DNA e o RNA. Quando observado em um microscópio de fluorescência, o complexo DNA- alaranjado de acridina emite fluorescência de cor verde o complexo RNA-alaranjado de acridina emite fluorescência vermelho-alaranjada. Assim, é possível identificar e localizar os dois tipos de ácidos nucléicos nas células através da microscopia de fluorescência. Outra aplicação importante resulta da combinação química de substâncias fluorescentes (como o isotiocianato de fluoresceína - FITC) com moléculas que se ligam especificamente a componentes das células e tecidos, permitindo assim a identificação destes componentes através da fluorescência que eles irão emitir. 
O MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
 O princípio geral de funcionamento do Microscópio Eletrônico (ME) é o seguinte: um feixe de elétrons incide sobre o objeto e é parcialmente desviado pelas suas estruturas eletro-densas ou, raríssimas vezes, alguns elétrons são incorporados a suas estruturas. O feixe de elétrons, depois de atravessar o objeto, passa por várias lentes, que no caso do ME são lentes eletromagnéticas, e vai impressionar uma tela fluorescente, na qual vemos a imagem, ou uma chapa fotográfica, quando se quer tirar fotografia.
 Para isso, o ME é composto de quatro partes principais:
1) Coluna óptico-eletrônica, na qual estão contidos os sistemas de iluminação e de formação da imagem
2) Sistema de vácuo
3) Sistema Fotográfico
4) Painel de Controle
SISTEMA DE ILUMINAÇÃO
 
 A iluminação no ME é feita da seguinte maneira: o filamento do tungstênio (catodo), aquecido, dobrado em ângulo agudo, formando uma ponta, é a fonte de elétrons que vão formar o feixe. Para formar este feixe, o filamento, e uma placa com orifício central (chamada anodo) estão ligados a uma fonte de alta tensão (gerador) que vai fazer com que se crie um campo elétrico entre eles. Assim, os elétrons serão expulsos da superfície do tungstênio, serão acelerados em direção ao anodo por este campo elétrico, cuja diferença de potencial é de 60 kV no modelo M9, da Zeiss.
 A emissão de elétrons não é uniforme em toda a superfície da ponta do filamento, o que causa um feixe irregular. Além disso, como os elétrons são atraídos imediatamente pelo anodo, qualquer variação da corrente do filamento se manifesta através de variação de temperatura do filamento e consequentemente uma variação na intensidade do feixe. Por isso, é usado o cilindro de Wehnelt, que é um cilindro metálico que envolve o filamento.
 Entre o cilindro de Wehnlt e o filamento há uma resistência R pela qual circula a corrente I, que produz uma queda ôhmica de potencial nos extremos desta resistência (lei de Ohm), no sentido de tornar o cilindro negativo em relação ao filamento. A diferença de potencial entre o filamento e o cilindro aumenta com a corrente i. Quando a corrente i é pequena, o potencial negativo do cilindro de Wehnelt é pequeno e exerce pouca influência sobre os elétrons, que são atraídos até o anodo à medida que são emitidos do filamento e, portanto, o feixe de elétrons vai estar sujeito às variações citadas acima, sendo um feixe irregular. 
 Ao aumentar a corrente i, o cilindro de Wehnelt torna-se mais negativo em relação ao filamento, formando uma nuvem de elétrons que cresce com a corrente i.
 À medida que aumenta a densidade dos elétrons entre o filamento e o cilindro, os elétrons que se dirigem ao anodo já não vão diretamente do filamento, mas sim depois de permanecer certo tempo na nuvem. Os elétrons do feixe são, pois, extraídos na nuvem na região de abertura do cilindro. É como se fossem extraídos de um tanque ou depósito de elétrons e, portanto o feixe é muito mais uniforme e independente das pequenas variações de temperatura do filamento.
SISTEMA DE FORMAÇÃO DA IMAGEM
 Somente podemos obter uma imagem do objeto quando este modifica a distribuição de intensidade do feixe. Esta modificação pode ter lugar por interações dos elétrons do feixe com os núcleos dos átomos da amostra, ou com as camadas eletrônicas dos mesmos. 
 Graças a esta interação, os elétrons são desviados em um ângulo cada vez maior quanto menor for a distância em que passam de um átomo do objeto. No choque do elétron com o núcleo dos átomos, não há perda de energia por parte do elétron (choque elástico). Já no choque do elétron com as partículas da camada eletrônica, o elétron pode perder energia, mudar sua direção e diminuir sua velocidade (choque inelástico). Esta perda de energia por parte dos elétrons é da ordem de 10 a 20 eV que se torna desprezível no ME. 
 Os elétrons muito desviados pelo objeto não participam na formação da imagem eletrônica, uma vez que são absorvidos pelos diafragmas colocados no eixo óptico. 
 A quantidade de elétrons que é desviada de um ângulo maior que o ideal para a construção da imagem, não depende do tipo de átomo do objeto, mas sim da quantidade de matéria (densidade x espessura do corte) que deve ser atravessada pelo feixe. Assim, a intensidade do feixe diminui exponencialmente ao crescer a quantidade de matéria atravessada.
 Existem também elétrons que sofrem dispersões sucessivas e podem sair do objeto em ângulo menor do que a ideal para a construção da imagem. Esses elétrons não contribuirão para aumentar o contraste, mas junto com os elétrons que atravessam o objeto sem desviar-se, produzirão uma iluminação de fundo. 
 As lentes do ME são lentes eletromagnéticas, portanto o seu funcionamento está baseado na ação do campo magnético sobre partículas eletrizadas em movimento, que no caso são os elétrons. Assim, os elétrons têm a sua trajetória modificada pelo campo magnético e com isso vão fazer com que se forme uma imagem ampliada em relação ao objeto.
 São em número de três as lentes: a objetiva, a intermediária e a projetora.
 O aumento da imagem final pode ser mudado de modo contínuo ou em quatro padrões fixos, variando a corrente da lente intermediária. 
 O poder de resolução do microscópio depende de modo decisivo das propriedades da lente objetiva.
 No espaço entre a lente objetiva e a intermediária há dois diafragmas intercalados: diafragma de abertura da objetiva ou de contraste e diafragma de imagem intermediária. 
 O superior exerce a função de um diafragma e abertura para a objetiva, não deixando passar os elétrons que se desviaram muito e que iriam piorar a qualidade da imagem final. Para isso usa-se geralmente um diafragma de abertura fixa (um único tamanho). Este diafragma suja-se