Aula 4 Cultivo e crescimento microbiano

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Aula 9: NUTRIÇÃO E CRESCIMENTO 
MICROBIANO
• Nutrição microbiana
– Componentes necessários às células
– Meios de cultura
– Condições ambientais
• Crescimento populacional
– Velocidade de crescimento
– Tempo de geração
– Medidas do crescimento
Fisiologia microbiana:
nutrição e crescimento
Introdução
• De todos os organismos vivos, os microrganismos são os mais 
versáteis e diversificados em suas exigências nutricionais.
• Alguns são tão exigentes quanto o homem e outros animais.
• Todos os organismos vivos compartilham algumas necessidades 
nutricionais em comum:
- carbono
- nitrogênio
- água
NUTRIÇÃO MICROBIANA
• Em algumas situações os microrganismos são estudados em 
seu hábitat natural.
Ex.: Fendas termais, sistemas de tratamento de resíduos, solo
• Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e 
bioquímicas) é necessário o cultivo em laboratório.
Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais 
Cultivo in vivo: quando exigências nutricionais específicas são 
desconhecidas.
NUTRIÇÃO MICROBIANA
NUTRIÇÃO MICROBIANA
Para o cultivo in vitro são utilizados meios de cultura que simulam 
e até melhoram as condições naturais.
Os elementos químicos principais para o crescimento das células 
incluem C, N, H, O, S e P e são denominados de macronutrientes.
• O carbono é um dos elementos mais importantes para o 
crescimento microbiano – todos requerem carbono
• Os compostos orgânicos são os que contém carbono
• Exceção para o dióxido de carbono que é considerado como 
inorgânico.
NUTRIÇÃO MICROBIANA
MACROnutrientes: necessários em grande quantidade. Tem papel 
importante na estrutura e metabolismo.
MICROnutrientes: quantidades mínimas. Funções enzimáticas e 
estruturais das biomoléculas
Uma célula típica
Matéria seca
Água
C
N
H
P, S, K, Na ...
Componentes necessários às células
• Fonte de Carbono
Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos):
- Carboidratos
- Lipídeos 
- Proteínas
Deles se obtém energia e unidades básicas para o crescimento celular.
Utilização de CO2 (microrganismos autotróficos) 
É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia provém da 
luz.
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Preferência da fonte de Carbono por fungos filamentosos
1- Metano
2- Hidrocarboneto de cadeia longa
3- álcool
4- Glicerol
5- açúcar alcoólicos
6- dissacarídeos
7- monossacarídeos
8- amido
9- celulose e hemicelulose
10- lipídeos e proteínas
11- quitina
12- queratina
13- lignina
Complexidade química
Pr
op
or
çã
o 
d
e
 u
so
13
7
1
Lignina
Glicose
Fonte de Carbono Grupo nutricional
CO2 Autotróficos
Compostos 
Orgânicos
Heterotróficos
Classificação Nutricional dos Organismos
Fonte de Energia
Grupo 
nutricional
Compostos orgânicos/ 
inorgânicos
Quimiotróficos
Luz Fototróficos
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Fonte de 
Carbono
Grupo 
nutricional
CO2 Autotróficos
Compostos 
Orgânicos
Heterotróficos
Classificação Nutricional dos Organismos
Fonte de Energia
Grupo 
nutricional
Compostos orgânicos/ 
inorgânicos
Quimiotróficos
Luz Fototróficos
Fonte de Energia Fonte de Carbono
C. orgânicos/ inorgânicos CO2
C. orgânicos/ inorgânicos Compostos Orgânicos
Luz CO2
Luz Compostos Orgânicos
Grupo nutricional
Quimioautotróficos
Fotoautotróficos
Quimioheterotróficos
Fotoheterotróficos
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•Fonte de Nitrogênio
- É elemento mais abundante depois do C, cerca de 12%
(constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.)
► Moléculas orgânicas (aminoácidos, proteínas, 
etc.)
► Moléculas inorgânicas (NH3, NO3
-, N2)
Componentes necessários às células
• Hidrogênio
- Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos 
(água, sais e gases) 
• Função do H:
– Manutenção do pH
– Formação de ligações de H entre moléculas 
– Serve como uma fonte de energia nas reações de oxi-redução da respiração
Componentes necessários às células
• Oxigênio
- Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, 
nucleotídeos, glicerídeos ...)
- É obtido a partir das proteínas e gorduras.
► Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os 
processos de geração de energia.
• P – Sínese de ácidos nucléicos, ATP;
• S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas; 
• K – Atividade de enzimas;
• Mg – Estabilidade dos ribossomos;
• Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de 
endósporos;
• Na – Requerido por microrganismos marinhos;
• Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e 
das proteínas envolvidas no transporte de elétrons.
Componentes necessários às células
Outros macronutrientes:
15Fonte: Madigan et al., 2010
• Traços dos seguintes METAIS são necessários na 
composição de um meio de cultura:
Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B
► Exercem função estrutural em várias enzimas
- Nem sempre sua adição é necessária
- Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza
e água ultra pura podem apresentar deficiências desses 
elementos.
Requisitos nutricionais - Micronutrientes
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Geralmente não é preciso adicionar: presentes na água;
se água desmineralizada: adicionar solução elementos
traços.
Nem todos os nutrientes listados são requeridos por todas as células
Elemento Função Celular
Cobalto Vitamina B12; transcarboxilase (bactérias que metabolizam ácido propiônico)
Cobre Respiração; citocromo c oxidase; fotossíntese; plastocianina e algumas 
superóxido dismutases.
Manganês Ativador de muitas enzimas; presente em certa superóxido dismutases e na 
enzima que cliva a água em fototróficos oxigênicos (Fotossistema II)
Molibidênio Certas enzimas contendo flavina; nitrogenase, nitrato redutase
Niquel Maioria das hidrogenases; Coenzima F430 de metanogênicos, monóxido de 
carbono desidrogenase; urease
Selênio Formato desidrogenase; algumas hidrogenases; no aminoácido 
selenocisteína
Tungstênio Algumas formato desidrogenases; oxotransferases de hipertermófilo
Zinco Vanádio nitrogenase; bromoperoxidase
Ferro Citrocromos; catalases; peroxidases; proteínas contendo ferro e enxofre; 
todas as nitrogenases
MICRONUTRIENTES
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MICRONUTRIENTES
Fonte: Madigan et al., 2010
Nem todos os nutrientes listados são requeridos por todas as células
• Água
- Componente absolutamente indispensável 
(com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas)
► Laboratório: destilada, filtrada, deionizada
• Outros aditivos
Funções: aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, 
controlar a espuma, provocar inibição, estabilizar o pH. 
►Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos 
metálicos
Ex.: EDTA, ácido cítrico, polifosfatos
Água e outros aditivos
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Fatores de Crescimento
- São compostos orgânicos que alguns microrganismos necessitam
em pequenas quantidades.
- Vitaminas, aminoácidos, purinas e pirimidinas.
- A maioria dos microrganismos conseguem sintetizá-los
- Porém, alguns requerem um ou mais desses fatores, pré-
formados no meio
- Vitaminas – Mais comumente requerido
- Atuam como coenzimas
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Fonte: Madigan et al., 2010
Fatores do ambiente que afetam o crescimento 
microbiano
a) Atmosfera
b) Temperatura
c) pH
d) Disponibilidade de água
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Classificação quanto a exigência de oxigênio
(A) Aeróbios estritos
(B) Anaeróbios estritos
(C) Anaeróbios facultativos
(D) Microaerófilos
(E) Anaeróbios aerotolerantes
Formas reativas do oxigênio
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Alguns procariotos 
anaeróbios obrigatórios não 
possuem superoxido 
dismutase, havendo uma 
enzima exclusiva asuperoxido redutase, que 
remove o superoxido sem a 
produção de O2
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Anaeróbios- uma grande variedade de procariotos, alguns fungos e alguns protozoários
Cultivo em anaerobiose
jarra de anaerobiose
câmara de anaerobiose
Teste de uma cultura microbiana para detecção de catalase 27
Temperatura
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Classificação dos microrganismos quanto à 
temperatura de crescimento
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Estratégias de adaptação dos organismos às altas
Temperaturas
- Membranas- Variação no conteúdo e tipos de lipídeos e
proteínas;
- Parede celular- Variação nas moléculas básicas (ex: tipo de
ligação, tipo de aa, etc) que compõem a parede;
– Velocidade de renovação das estruturas e moléculas;
- Proteínas termoresistentes:
✓ Taq polimerase (Thermus aquaticus)
✓ Pfu polimerase (Pyrococcus furiosus)
– Ácidos nucléicos por exemplo com maior concentração de
bases C≡G
Efeito do pH no crescimento microbiano
1 3,5 7 9 14
pH
Acidófilos
Ex:
Acidithiobacillus sp.
Neutrófilos
Ex: Escherichia coli
Alcalófilos
Ex: Bacillus sp.
T
a
x
a
 d
e 
cr
es
ci
m
en
to
pH = Acidez ou alcalinidade de uma solução.
A maioria dos microrganismos cresce melhor perto da neutralidade.
Poucas bactérias são capazes de crescer em pH ácido (como pH 4,0).
Bactérias: faixa entre pH 7,0. Exceções:Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com ótimo
entre 2 e 3,5), Bactérias alcalifílicas: (Bacillus e Archaea) (pH 10 – 11)
Fungos tendem a ser mais acidófilos que as bactérias (pH <5).
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Disponibilidade de água/Concentração do íon sódio
Atividade de água (aw): quantidade de água livre, disponível para o uso por parte
dos microrganismos. Pode variar de 0 a 1.
Microrganismos marinhos tem necessidades especificas de íon sódio sendo
denominados halófilos.
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Não halófilos – 0 a 1,5%
Halófilos discreto-1 a 6% de NaCl
Halófilos moderado -6 a 15% de NaCl,
Halófilos extremos -15 a 30% de NaCl.
Halotolerantes – crescem em maiores
concentrações de sais mas preferem
concentrações inferiores a 9%
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Cultivo de microrganismos
em laboratório
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Meios de cultura ou Meios de cultivo
Meios de cultura:
- Soluções nutrientes utilizadas para promover o crescimento de
microrganismos em laboratório
- Fornece os nutrientes indispensáveis ao crescimento do microrganismo
fora do seu habitat natural.
- São preparados em laboratório
com água destilada ou deionizada,
- Podem também ser adquiridos
prontos para uso.
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Meio líquido: nutrientes são dissolvidos em água e esterilizados.
- Usados em estudos de crescimento, cultivo em fermentação e na
produção de biomassa
Consistência ou estado físico dos meios de cultivo
Meio sólido: são preparados a partir da adição de um agente solidificante,
antes da esterilização do meio.
- Usados para contagem e isolamento de microrganismos (1,5% Agar)
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Consistência ou estado físico dos meios de cultivo
Meio semi-sólido: são preparados pela adição de uma quantidade menor
do agente solidificante (0,7% Agar).
- Usados para a detecção de placas de lise em culturas
bacterianas infectadas por vírus e microrganismos microaerofílicos ou
móveis
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Meios sólidos e semi-sólidos
Ágar: polissacarídeo complexo extraído de algas marinhas com
propriedade de fundir a 96oC e solidificar a 45oC. Não é usado
como fonte de nutrientes pela maioria dos microorganismos
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Meio Mínimo (MM): é sintético e fornece somente nutrientes essenciais
ao desenvolvimento da célula.
Meio Completo (MC): é sintético e fornece todos nutrientes para o
desenvolvimento da célula.
Definidos: são preparados pela adição de quantidades precisas de
compostos químicos inorgânicos ou orgânicos altamente purificados a uma
determinada quantidade de água destilada.
- A composição química exata é conhecida
Indefinidos ou Complexos: A composição exata de cada nutriente não é
conhecida.
-Ex: peptona, extrato de levedura, soja, carne, entre outros
Quanto à composição os meios podem ser classificados em:
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Meios definidos
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BDA (batata-dextrose-ágar- fungos)
Batata (caldo) 200g
Dextrose 20g
Ágar 15g
Água dest. 1000mL
Caldo Nutriente (bactérias)
Extrato de carne 3,0g
Peptona 5,0g
Água dest. 1000mL
Meios complexos são altamente nutritivos, geralmente mais fáceis de preparar,
são os mais usados ( composição exata não é necessária), mais adequados para
fastidiosos (microrganismos nutricionalmente exigentes).
Meios indefinidos ou complexos
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Substratos para meios complexos
- Extrato de Carne: extrato aquoso de tecido muscular, concentrado
sob a forma de pasta, contém carboidratos, N orgânico, vitaminas
hidrossolúveis e sais.
- Peptona: produto da digestão da carne (enzimática ou ácida), fonte de
nitrogenio orgânico e vitaminas.
- Triptona: hidrolisado pancreático de carne , rica em nitrogênio-
amínico; destinado ao isolamento de organismos de difícil crescimento.
- Extrato de Levedura: extrato aquoso de células de leveduras lisadas,
fonte excelente de substâncias estimulantes do crescimento como
vitamina complexo B; contém compostos orgânicos de N e C.
- Extrato de malte: extrato aquoso de cevada malteada. Rica em
carboidratos, contém material nitrogenado, vitaminas e sais minerais.
-Tripticase: peptona derivada da caseína por digestão
pancreática,fonte rica em nitrogênio de aminoácidos
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- Meios formulados para objetivos específicos, utilizados principalmente nos
trabalhos de identificação de microrganismos. Podem ser:
- Enriquecimento: Favorece o crescimento de determinada população.
- Multiplicação dos microrganismos de interesse quando estes estão
em pequeno número.
Ex: Meio contendo celulose como fonte de carbono ou meio com fenol
para microrganismos que degradam essa fonte.
Meios Especiais
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Meios Especiais
Ágar sangue - diferencial
Diferencial: contém substâncias químicas mais complexas e permite
diferenciar os microrganismos quanto ao seu crescimento e morfologia.
Ex: EMB – Colônia de E. coli verde escuro e Salmonela incolor.
- Meio agar-sangue, identificação de bactérias patogênicas produtoras de
hemolisinas.
- Ex: Streptococcus e Staphylococcus (anel claro em torno da colônia).
E.coli em EMB
Seletivo: Favorece um microrganismo e inibe o crescimento de outros.
- Ex: Adição de um antibiótico específico
- pH específico para determinados microrganismo
- Ágar Sabouraud: pH 5,6 e alta concentração de glicose (seletivo para
fungos)
- Ágar verde brilhante: seletivo para
enterobactérias Gram - (Salmonella)
 o corante verde brilhante
adicionado ao meio inibe as bactérias
Gram (+)
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Ágar MacConkey
Ágar MacConkey
- Contém sais biliares e corante cristal
violeta, que inibem o crescimento de
Gram + e permitem o desenvolvimento
de Gram –
- E lactose (diferenciar bactérias que
utilizem este carboidrato).
- Colónias bacterianas que fermentam
lactose tornam o meio rosa choque
- As bactérias que não são
fermentadoras de lactose tornam o meio
amarelo claro.
Seletivo/diferencial: diagnóstico de patogênicos (coliformes fecais). :
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Cultivo de Microrganismos
-Isolamento - Contagem - Identificação
-Segurança de águas potáveis públicas
-Diagnóstico, tratamento e prevenção de doenças
-Selecionar linhagens de interesse industrial
Importância da Caracterização dos Microrganismos
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Isolamento dos Microrganismos
• Para se caracterizar um microrganismo ele deve estar em cultura
pura, ou seja, ele precisa ser isolado dos demais microrganismos do
meio onde se encontra
• Cultura pura: quando uma colônia ou cultura é originada de uma únicacélula.
• Cultura mista: se a colônia ou cultura é originada de mais de uma
célula.
Técnica de esgotamento por estrias
Estria compostaEstria simples 
Isolamento do Microrganismos
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Métodos Contagem
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Contagem de colônias em placas diluição seriada
Contagem de colônias em placas 
diluição seriada de fungos 
filamentosos
UFC/mL= nº colônias x fator 
diluição / aliquota plaqueada
UFC=Unidades Formadoras de 
Colônias
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Contagem microscópica direta
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Turbidez medida em um espectrofotômetro ou em um fotômetro
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Curva de crescimento típica de uma população bacteriana
Crescimento bacteriano-Aumento do número de células
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Formas de multiplicação
•Exosporulação (assexuada): Ex: 
Streptomyces
•Fragmentação de filamentos: Ex: 
Nocardia
•Brotamento: Ex: 
Rhodopseudomonas
•Fissão binária: Ex: Escherichia coli
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Cultura contínua- Quimiostato
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Tempo de geração: é o intervalo de
tempo necessário para que uma célula
se duplique.
- É variável para os diferentes
organismos, podendo ser de 10, 20
minutos até dias.
- O tempo de geração não
corresponde a um parâmetro
absoluto, uma vez que é dependente
de fatores genéticos e nutricionais,
indicando o estado fisiológico da
cultura.
Taxa de crescimento (velocidade
específica de crescimento): é a
variação no número ou massa de
microrganismos por unidade de tempo.
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• O tempo de geração pode ser calculado quando uma cultura encontra-se em fase
exponencial, pela fórmula:
• g = t/n
• g = tempo de geração
• t = tempo de crescimento
• n = número de gerações dentro
de um tempo de crescimento dado pela equação:
• N=No.2n
• N= número final de células
• No= número inicial de células
• n= número de gerações
• Como o crescimento é exponencial
então:
• n= log(N) - log(No)/0,301
Cinética do crescimento 
microbiano
1 - 2 – 4 - 8 ... 2n
n = número de gerações
N = número final de células
No = número inicial de células
N = No x 2n
Crescimento exponencial
Cinética do crescimento microbiano
N = No x 2n
Log N = Log No + n log 2
n = Log N - Log No
0,301
Log 2 = 0,301
Cinética do crescimento 
microbiano
G = t
n
Tempo de geração (G)
Taxa de crescimento 
exponencial
R = n
t
t = tempo de duração do crescimento final;
n = número de gerações;
R = Taxa de crescimento exponencial (gerações/h).
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