Relatório Cromatografia de camada Delgada - extração a partir de urina

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UNIVERSIDADE METODISTA DE PIRACICABA 
FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
CURSO DE FARMÁCIA 
TOXICOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 RELATÓRIO: 
 
 
EXTRAÇÃO DE FÁRMACOS NA URINA, CONFECÇÃO DE PLACAS DE CCD E 
REVELAÇÃO DAS PLACAS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PIRACICABA – SP 
2017
 
AMANDA CASARIM 
BEATRIZ SANTOS DA COSTA 
MAYARA BUENO 
NAYARA FERNANDA ROZAM 
NICOLE RAMOS 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 02 
1.1 CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA – CCD ....................................... 02 
1.2 REVELADORES EM CCD ...................................................................................... 03 
2 OBJETIVO ................................................................................................................. 04 
3 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 04 
3.1 MATERIAIS E REAGENTES .................................................................................. 04 
3.2. METODOLOGIA ..................................................................................................... 04 
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 05 
5 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 06 
 
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1 INTRODUÇÃO 
1.1 CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA - CCD 
A cromatografia de camada delgada é um exemplo de cromatografia de adsorção. 
Esta técnica consiste de uma fase estacionária fixada em uma placa (de vidro ou alumínio) 
e uma fase móvel, que é composta por um solvente ou combinação de solventes, chamado 
eluente. A amostra a ser analisada é aplicada sobre esta fase estacionária, que é um 
adsorvente. Os principais adsorventes utilizados em CCD são sílica gel e alumina. 
A placa de CCD deve ter, geralmente 5 cm de altura e a largura deve variar de 
acordo com o número de amostras aplicadas. 
As amostras a serem analisadas em CCD devem ser previamente dissolvidas em 
um solvente volátil. A aplicação dessa solução sobre a placa cromatográfica deve ser 
efetuada a aproximadamente 0,5 cm da base inferior da mesma. A aplicação pode ser 
realizada utilizando um tubo capilar, cuja extremidade inferior esteja uniformemente 
seccionada. Para aplicação de mais de uma amostra deve-se tomar cuidado com a 
distância entre os pontos. 
As amostras podem ter passado por pré-tratamento como procedimentos 
extrativos afim de purificar e concentrar analitos de interesse. 
Após a aplicação da(s) amostra(s), a CCD deve ser introduzida em uma cuba de 
vidro contendo o solvente apropriado (eluente ou fase móvel). A altura do solvente na 
cuba não pode ultrapassar a linha de aplicação da(s) amostra(s). O eluente deve arrastar 
a(s) amostra(s). 
Para que se obtenha melhores resultados na CCD, é necessário que a cuba fique 
saturada com vapores de mesma constituição da fase móvel. Para isto, as paredes laterais 
internas da cuba são, geralmente, recobertas com papel filtro. Este papel ficará, em 
contato com o eluente, ficando umedecido com o mesmo. 
Uma vez introduzida a placa na cuba, o solvente ascenderá, por fenômeno de 
capilaridade, até a extremidade superior. Ao ascender, a fase móvel arrastará mais os 
compostos menos adsorvidos na fase estacionária, separando-os dos compostos mais 
adsorvidos.
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A placa deve ser retirada da cuba quando a frente do solvente estiver a 
aproximadamente 0,5 cm da extremidade superior da placa. Em seguida, seca-se a placa 
por simples exposição ao ar, ou com ajuda de um secador de ar quente. 
 
FIGURA 1: TÉCNICA DE CCD 
 
 
Fonte: BULEGON BRONDANI, Patrícia. Cromatografia de camada delgada – CCD. Disponível em: 
<http://nuquiocat.quimica.blumenau.ufsc.br/files/2016/07/Cromatografia-de-Camada-Delgada.pdf> 
Acesso em 24/9/2017. 
 
A maioria dos compostos orgânicos são incolores. Com base nisto, um processo 
de revelação deve ser realizado, para que se possa identificar as manchas correspondentes 
aos compostos presentes na(s) amostra(s). 
Após aplicação do revelador, é calculado o rf dos compostos presentes na amostra, 
trata-se do fator de retenção, parâmetro de maior importância na CCD, que é a razão entre 
a distância percorrida pela substância e a distância percorrida pela fase móvel. Esse fator 
determinará se a substância analisada confere com a substância padrão. 
 
1.2 REVELADORES EM CCD 
 Os reveladores utilizados em CCD podem ser físicos, químicos ou biológicos. 
Nesta aula, utilizou-se alguns reveladores químicos: Nitrato mercuroso; 1,5- 
difenilcarbazona; Zwikker; Cloreto férrico com reativo de platina; Cloreto férrico seguido 
de aquecimento e solução de Dragendorff e FPN. Sobre esses reativos pode-se dizer que: 
O Nitrato mercuroso, possui mercúrio, presente na solução de HgNO3, e por 
conta disso reage com compostos que apresentam anel imida em sua estrutura, como os 
fármacos barbitúricos (ex: fenobarbital) 
O revelador Ziwikker também é capaz de identificar compostos barbitúricos. 
O Cloreto férrico é capaz de identificar grupamentos fenólicos (os íons férricos 
presentes na solução de FeCl3 formam complexos coloridos com a maioria dos 
compostos fenólicos). Já a reação de cloreto férrico (FeCl3) seguida da solução de 
Dragendorff é também capaz de revelar compostos alcaloides. 
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No entanto, apesar dos benzodiazepínicos não possuírem grupamentos fenólicos e nem 
pertencerem à classe dos alcaloides, esses reveladores são descritos como eficientes na 
literatura para revelação de benzodiazepínicos 
O FPN é capaz de identificar fenotiazínicos e benzodiazepínicos. 
 A 1,5 difenilcarbazona identifica melhor fármacos ácidos, como barbitúricos. 
2 OBJETIVO 
O objetivo dessa aula prática foi verificar a presença de fármacos tendo como 
amostras extrato ácido e extrato básico de urina, utilizando o método de Cromatografia 
em Camada Delgada. Foram usados como padrões os seguintes fármacos: fenobarbital, 
ácido acetil salicílico, clorpromazina, haloperidol, paracetamol, carbamazepina, 
difenilidantoína, diazepam, imipramina, amitriptilina. 
 
3 MATERIAIS E METÓDOS 
3.1 MATERIAIS E REAGENTES 
 
3.2 METODOLOGIA 
Primeiramente, foram feitas duas amostras de extrato de urina básico e ácido. O 
objetivo de se extrair foi concentrar os analitos de interesse e purificar a amostra. 
 Em um funil de separação, colocou-se amostra de urina e a acidificou com HCl 
6M até atingir pH entre 1 e 2 em seguida, adicionou-se os solventes orgânicos éter + 
clorofórmio (1:2 – 25 mL em cada extração). Homogeneizou a amostra com movimentos 
leves, e abriu a torneira para a liberação dos gases. Extraiu-se duas vezes, colocando no 
funil sulfato de sódio anidro. Dessa forma obteve-se a urina acidificada. 
- 2 funis de separação; - HCl – ácido clorídrico (0,1 e 6M) 
- 2 funis com papel filtro sanfonado; - NaOH – hidróxido de sódio (0,1 e 6M) 
- 1 proveta de 25 mL; - mistura de éter e clorofórmio (1:2) – 
extratores 
- 2 béqueres de 100 mL; - clorofórmio + acetona (9:1) – eluentes. 
- Banho de areia para aquecimento; - metanol e hidróxido de amônio 
(100:1,5) – eluentes 
- 2 placas cromatográficas de sílica; - Revelador 1,5-difenilcarbazona 
- 2 cubas cromatográficas - Revelador FPN 
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Logo após a amostra contida no funil de separação foi basificada com NaOH 6M 
até atingir pH entre 8 e 10. Repetiu-se o mesmo procedimento de extração duas vezes, 
obtendo-se assim a urina basificada. 
As duas amostras
foram colocadas em tela de areia para aquecimento até a 
evaporação do solvente orgânico. 
Foram feitas duas placas de sílica (fase estacionária), uma ácida e outra básica. 
Em ambas as placas foram depositadas, em uma distância de 1,5 cm entre cada, amostra 
de urina básica, de urina ácida e os padrões (fenobarbital, ácido acetil salicílico, 
clorpromazina, haloperidol, paracetamol, carbamazepina, difenilidantoína, diazepam, 
imipramina, amitriptilina). Afim de se buscar na amostra a presença de fármacos que de 
modo geral são ácidos ou bases fracas. 
Após a secagem, colocou-se a placa ácida em uma cuba contendo a fase móvel de 
clorofórmio + acetona (9:1) e a placa básica em outra cuba cuja fase móvel foi metanol e 
hidróxido de amônio (100:1,5). Ambas previamente saturadas. 
Esperou um tempo até os solventes eluirem nas placas e as mesmas foram 
retiradas das cubas. Após a secagem, foram aplicados os reveladores nas duas placas. Na 
placa ácida aplicou-se 1,5-difenilcarbazona e na placa básica aplicou-se o FPN. 
 
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 
Na placa ácida, utilizou-se como revelador 1,5-difenilcarbazona, sabe-se pela 
literatura que este revelador cromatográfico consegue identificar mais fármacos de 
natureza ácida, como os barbitúricos. Na amostra contendo extrato ácido da urina, uma 
mancha apareceu, porém não foi possível caracterizá-la como sendo um dos fármacos 
utilizados como padrões. Houve também o arraste da substância, podendo ser resultado 
de algum interferente e ressaltando a necessidade de melhorar a purificação do método 
extrativo. A mancha obtida na amostra ácida é demonstrada na figura a seguir. 
FIGURA 2: PLACA ÁCIDA REVELADA COM 1,5 DIFENILCARBAZONA 
 
 
 
 
 
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 Na placa básica, cujo revelador cromatográfico foi o FPN, conhecido por 
identificar sobretudo fármacos fenotiazínicos e benzodiazepínicos. Observou-se uma 
mancha de coloração rosa no padrão de clorpromazina (antipsicótico fenotiazínico) e uma 
de cor azul na imipramina (antidepressivo tricíclico). Nenhuma mancha apareceu na no 
extrato básico de urina, excluindo a presença de fármacos de natureza básica, conforme 
demonstrado a figura abaixo. 
FIGURA 3: PLACA BÁSICA REVELADA COM FPN 
 
Logo, nessa amostra de urina há presença de um fármaco ácido desconhecido, 
ressalta-se a importância de se purificar melhor o extrato ácido e testar com novos padrões 
de natureza ácida. Não há presença de fármaco básico. Exclui-se a presença dos seguintes 
fármacos: fenobarbital, ácido acetil salicílico, clorpromazina, haloperidol, paracetamol, 
carbamazepina, difenilidantoína, diazepam, imipramina, amitriptilina 
 
5 REFERÊNCIAS 
ALVES, Sergio Rabello. Toxicologia forense e saúde pública: desenvolvimento e 
avaliação de um sistema de informações como potencial ferramenta para a 
vigilância e monitoramento de agravos decorrentes da utilização de substâncias 
químicas. 2005. Tese de Doutorado. Disponível em : 
<https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/4368/2/280.pdf> Acesso em 25/9/2017. 
 
 
BULEGON BRONDANI, Patrícia. Cromatografia de camada delgada – CCD. 
Disponível em: 
<http://nuquiocat.quimica.blumenau.ufsc.br/files/2016/07/Cromatografia-de-Camada-
Delgada.pdf> Acesso em 24/9/2017. 
7 
 
DE ABREU GADELHA, Julia et al. Desenvolvimento de métodos cromatográficos 
qualitativos para identificação de benzodiazepínicos. Revista Intertox de Toxicologia, 
Risco Ambiental e Sociedade, v. 7, n. 3, 2015. 
 
 
LINI, R. S. et al. Caracterização de fármacos por cromatografia em camada 
delgada. Universidade Estadual de Maringá, Paraná, Brasil, 2014. Disponível em: 
<http://www.rbfarma.org.br/files/567-ARTIGO-ORIGINAL-485-498.pdf> Acesso em 
25/9/2017. 
 
 
SILVA GOULART, Daniel. Aplicações das técnicas de cromatografia no 
diagnóstico toxicológico. Universidade Federal de Goiás, 2012. Disponível em: 
<http://ppgca.evz.ufg.br/up/67/o/Daniel_Goulart_1c.pdf?1349116580> Acesso em 
25/9/2017.