Biotecnologias da reprodução animal

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Biotecnologias da reprodução animal
→Transferência de embriões 
- TE ou inovoluação é a prática da deposição de embriões no estágio inicial de desenvolvimento no útero de fêmeas receptoras com o intuito de obter uma nova prenhes 
- Permite colher embriões de uma fêmea doadora e transplanta-los em uma fêmea receptora para completarem o período da gestação 
- A TE é o correspondente feminino da inseminação artificial 
- Fêmeas de qualidade genética superior são superovulada com hormônios gonadotróficos e seu oócitos são fecundados “in vivo” ou “in vitro”; os embriões resultantes são transferidos para receptoras, mães substitutas com potencial genético inferior 
• Importância: 
- Produzir um número maior de descendentes de uma fêmea de alto valor genético 
- Feito para o melhoramento zootécnico, acelera o processo de seleção zootécnico 
Primeira etapa: Obtenção de oócitos
- Poderá ser obtido de animais vivos, ou animais mortos 
Animais vivos – Se for para obter de animais vivos é necessário superovular as doadoras com os protocolos hormonais 
- Poderá ser feito por laparoscopia 
- Poderá ser feito por Ovum pick-up(OPU)
Animais mortos – Obtenção de oócitos de ovários de abatedouros 
Segunda etapa: Maturação dos oócitos
- A maturação dos oócitos poderá ser “in vivo” ou “in vitro” 
Se for “in vivo” - Após a coleta dos oócitos das doadoras, você fará a maturação dos oócitos in vivo, isso é, introduzirá o oócito em alguma receptora para que este seja maturado 
Se for “in vitro” – Após a coleta dos oócitos, você fará a maturação deste em algum meio de cultivo
Terceira etapa: Fecundação/Fertilização 
Se for “in vivo” – Após a maturação dos oócitos no organismo da fêmea, você irá retira-los, fará a fecundação com o sêmen do animal selecionado 
Se for ‘in vitro” – Após a maturação do oócito você selecionará o sêmen capacitado e realizará a fecundação desse oócito em algum meio de cultura
Primeira etapa: Obtenção de oócitos 
1) Métodos de obtenção de oócitos 
∆ Cuidados na obtenção de oócitos:
- Temperaturas abaixo de 36°C despolimerizam a tubulina. A tubulina é uma proteína globular presente em quase todas as células eucariontes responsável pela meiose 
- Tempo, os oócitos tornam-se velhos e inviáveis para maturação e posterior fertilização 
- Necessário a utilização de materiais estéreis
- Os oocitos coletados são primários e precisarão chegar até a metáfase II 
- Coletamos oócitos dos folículos antrais!!!
→ Animais mortos: Ovários de abatedouros 
- Pode-se coletar oocitos em até 6h 
Vantagens: 
- Facilidade de coleta 
- Pode-se utilizar com ou sem superovulação
- Obtenção de material em quantidade 
Desvantagens: 
- Tomar cuidado com a assepsia dos materiais e locais de coleta
- Avaliar a qualidade do material, como são animais de descarte normalmente os oócitos coletados serão utilizados mais para pesquisas do que para fecundação previamente 
• Técnica de Slicing
- Fatiamento do ovário para a obtenção dos folículos mais profundos 
Desvantagens: Técnica demorada e pode gerar debris
• Coleta por aspiração folicular 
- Consiste em uma agulha, acoplada em uma bomba de sucção á vácuo
Vantagens: Rápida, simples e possibilita a obtenção de folículos de melhor qualidade
→ Animais vivos: 
• Laparoscopia 
- É feita por aspiração folicular guiada pelo laparoscópio
- A aspiração cria um vácuo para aspirar os oócitos
- O aparelho é inserido no reto do animal e guiado utilizando a mão do veterinário até o ovário 
Vantagens: 
- Permite colheitas sucessivas, a cada 2 meses 
- Comum em animais silvestres
- Melhor aproveitada com a superovulação 
Desvantagens: 
- É um procedimento cirúrgico necessária anestesia do animal (epidural)
- Necessita mão de obra especializada 
- Necessita de equipamento adequado 
• Ovum Pick-Up(OPU)
- É a técnica de aspiração folicular transvaginal guiada por US com palpação transretal 
Vantagens: 
- Pode-se fazer colheitas sucessivas
- Feita em animais vivos 
- Procedimento pouco invasivo 
- Pode ser utilizado com ou sem superovulação 
Desvantagens: 
- Necessidade de equipamento especial 
- Precisa de mão de obra especializada
- Resultados variáveis pois o técnico precisa perfurar o folículo exercendo pressão negativa e aspirando o oócito 
2) Avaliação da qualidade dos oócitos adquiridos 
→ São avaliados pelas características e qualidades do complexo Cumulus Oophorus
∆ Cumulus Oophorus: 
- É um conjunto de células adjacentes ao folículo e ao oócito ovulado 
- Produz uma matriz mucosa
- Faz a nutrição do oócito, promove glicose 
- Faz a coordenação do desenvolvimento do folículo e da maturação do oócito 
- Esta camada de células precisa ser penetrada pelos espermatozoides para que o oócito seja fecundado 
OBS: Em equinos as células da Cumulus Oophorus estão mais intimamente aderidas a parede do ovário o que torna a sua recuperação mais difícil 
→ Classificação: 
- Oócitos degenerados ou envelhecidos tem viabilidade alterada 
- Os oócitos vão estar imaturos pois coleta dentro do folículo 
- Após a coleta dos oócitos será necessário expandir as camadas de Cumulus para que o espermatozoide possa fecunda-lo 
• Grau I – Presença de camadas compactas do Cumulus e oócitos com citoplasma compacto 
• Grau II – Presença de 5 ou mais camadas de células do Cumulus com citoplasma homogêneo ou com alguma heterogeneidade 
• Grau III – Menos de três camadas de células do Cumulus, ou citoplasma heterogêneo 
• Grau IV – Cumulus parcialmente ou totalmente expandido, está relacionada a atresia e apoptose das células da granulosa 
OBS: Expansão das células da Cumulus Oophorus 
- Quando o oócito está maturado as camadas de células da Cumulus Oophorus se expandem para que os espermatozoides possam passar por ela e adentrar no oócito para realizar a fecundação 
Segunda etapa: Maturação de oócitos 
→ Os oócitos podem ser maturados “in vivo” e “in vitro” 
• “in vivo” – Na maturação in vivo os embriões desenvolvem-se a após a fecundação de ovócitos originados a partir de folículos ovulatórios que sofreram um processo de seleção, crescimento e dominância antes da etapa final de maturação 
• “in vitro” – Na maturação in vitro os ovócitos utilizados são derivados de folículos imaturos, subordinados ainda, posteriormente maturados fora do folículo
OBS: Não se congela oócitos pois a viabilidade do embrião é muito maior que a do oócito 
1) Maturação oocitária “in vivo” 
- É a sequência de eventos que ocorrem desde o estágio de vesícula germinativa até o término da segunda divisão meiótica, com formação do segundo corpúsculo polar 
- Ocorrem eventos nucleares, citoplasmáticos e moleculares 
• Maturação nuclear
- A retomada da meiose é iniciada pelo pico pré ovulatórios de LH 
- Ativação das proteínas do complexo MPF, fator promotor de maturação 
- Ativação das proteínas da família MAPK, proteína cinase ativada por mitógenos, ativadas com a ruptura da vesícula germinativa 
- Ruptura da vesícula germinativa, os oócitos são mantidos no estado de vesícula germinativa no ambiente folicular até que ocorra o pico pré ovulatórios de LH o que estimula a maturação deste e alterações na conformação da Cumulus Oophorus 
- O oócito vai se dividindo até a metáfase II da segunda divisão meiótica 
- Ocorre a manutenção da meiose pelas proteínas quinases MOS, elas são ativadas pelo complexo MAPK 
• Maturação citoplasmática 
- Modulação da tradução 
- Modificação do número, tamanho e/ou posição das organelas 
- Aumento do número de grânulos corticais 
2) Maturação oocitária “in vitro” 
- Será necessário simular o que ocorreria dentro do animal vivo
- Será necessário expandir as camadas de Cumulus Oophorus 
- Somente folículos dominantes tem receptores para LH e apenas ele vai entrar em meiose II 
- Nutrientes, atmosfera, osmolaridade e PH são fatores que devem ser controlados para o sucesso da maturação “in vitro”
- Após a retirada do oócito do ambiente folicular este perde contato com os fatores inibidores do oócito,então ocorre a retomada espontânea da meiose independente do estágio de maturidade citoplasmática 
- O pico de LH fará a reativação da meiose, então o meio de cultivo necessitará de LH
• Etapas: 
→ Maturação para expansão das células da Cumulus Oophorus 
- 39°C, em 5% de CO2 e 95% de ar com alta umidade por no mínimo 2h 
- Após a maturação, isso é a liberação da Cumulus Oophorus estes são selecionados, os que não expandiram as células da Cumulus Oophorus serão descartados
- Após a seleção os que expandiram as células da Cumulus Oophorus são colocados em microgotas do mesmo meio sob óleo de parafina(para preservação) em placas de Petri
- Colocar todos os oócitos selecionados em uma gota deste meio, distribui 10 gotas deste meio na placa de petri e com uma pipeta vai passando os oócitos pelas gotas na placa, depois distribui 10 oócitos por gota 
- Essa lavagem é necessária para retirar todos os resíduos de fluido folicular 
- Depois da lavagem dos oócitos estes são colocados no meio de cultivo e levados para a incubadora para maturação final 
→ Maturação nuclear e citoplasmáticas
- Incubadora a 39°C, em 5% de CO2 e 95% de ar com alta umidade por no mínimo 24h 
- Após as 24h de maturação observa-se no microscópio quais oócitos estão com as células da Cumulus Oophorus expandido, quem não expandiu é descartado 
• Meios de cultivo: 
- Mais utilizado TCM199 (Tissue Culture Medium) 
- Este meio pode ser modificado de acordo com a rotina do laboratório, podem ser adicionados tampões, aminoácidos, vitaminas, nutrientes, hormônios e soro sanguíneo 
- Composição do meio: LH, FSH, Estradiol, BFS(soro fetal bovino) 
Terceira etapa: Fecundação/Fertilização 
- Na TE a fêmea é inseminada após a fecundação do óvulo, este então é introduzido no animal e quando chega no útero é feita a lavagem para coleta dos embriões para posterior implantação no útero da receptora selecionada 
Por que escolher a FIV ao invés da TE?
- A TE é uma técnica mais barata e fácil de ser feita, porem o número de embriões conseguidos é pequena 
- Já a FIV o número de embriões recuperados é muito grande mesmo sendo mais cara, o Brasil é o maior produtor de embriões pelo método da FIV 
1) Fertilização “in vitro”
- A FIV prioriza a genética da mãe, enquanto a IA prioriza a genética do pai 
- Foi a técnica que possibilitou outras biotécnica como clonagem e animais transgênicos 
- Produção de animais geneticamente superiores 
- Tratamento de infertilidade adquirida, devido a algum problema no útero do animal, como endometrite. Você coleta os oocitos e fertiliza fora do animal com problemas
- Grande produção de embriões, de 20 a 40 embriões 
- Uma vantagem é não precisar esperar o tempo de gestação de um animal de pista por exemplo. Não posso esperar ele gestar o filhote, mas posso recuperar o oócito deste e implanta-lo em uma receptora para gerar filhos de genética superior 
→ Como funciona? Já possui os oócitos maturados e tudo mais, agora precisamos dos espermatozoides para realizar a fecundação: 
- Realizar o exame andrológico no macho e fazer a coleta do sêmen 
- Os espermatozoides após a ejaculação ainda não estão prontos para fertilizar, ele adquire esta capacidade após passar pelo sistema reprodutivo da fêmea
- O espermatozoide deve sofrer modificações fisiológicas antes de conseguir penetrar a zona pelúcida e fundir-se com o vitelo do oócito 
- O sêmen adquirido deverá ser avaliado pela sua motilidade progressiva 
- Se for utilizado sêmen congelado a motilidade poderá ser intensificada utilizando-se métodos físicos ou agentes químicos 
× Capacitação espermática: 
- Durante a gametogênese o epidídimo produz substancias que inibem os sítios de receptores da membrana plasmática que impedem que o espermatozoide fecunde o ovulo 
- Essas substâncias (espermina e caltrin) tem a função de proteger o espermatozoide do ambiente hostil que é o trato reprodutor feminino, com Ph ácido e células imunes de defesa 
- Essa capacitação ocorre ao longo do trato reprodutivo feminino, o contato dos espermatozoides com as secreções uterinas e Ph próprio promove a exposição dos sítios receptores bloqueados 
- É necessário eliminar as substancias inibitórias contidas no plasma seminal que impedem que o espermatozoide se movimente 
1- Ocorre a eliminação do colesterol contido no espermatozoide, a albumina(glicosaminoglicanos) presente no trato reprodutivo feminino sequestra o colesterol do espermatozoide, ocorre um efluxo de colesterol do espermatozoide 
2- Ocorre também a remoção dos fatores de decapacitantes o que resulta na desestabilização da membrana (da bicamada fosfolipidica) e hiperativação espermática e a reação acrossomal 
- A desestabilização da bicamada de fosfolipídios do espermatozoide é um pré requisito para que ocorra a reação acrossomal 
× Hiperativação espermática: 
- Na capacitação espermática foram retirados todos os fatores inibitórios da cauda do espermatozoide, então ocorrerá a hiperativação espermática 
- É o aumento da motilidade espermática com batimentos vigorosos da cauda do espermatozoide
- Após a ejaculação o espermatozoide fica preso nas fimbrias do ovário, a hiperativação espermática consiste também no desprendimento do espermatozoide das fímbrias e sua migração até o ovulo 
- O desprendimento é feito com o chicoteamento da cauda do espermatozoide em direção ao ovulo 
× Reação acrossômica: 
- Ocorre quando o espermatozoide encosta na proteína ZP3 do ovulo que é a mais externa 
- E então o espermatozoide faz a fusão da membrana plasmática e da membrana externa do acrossomo o que forma pequenas vesículas e minúsculas aberturas por onde a enzima acrosina irá sair para digerir a zona pelúcida do oócito 
→ Fecundação 
- O espermatozoide já sofreu as reações de capacitação e hiperativação ao decorrer no trato reprodutivo feminino, este então está se aproximando do ovulo 
- Na aproximação ocorrem modificações na permeabilidade da membrana da cabeça do espermatozoide havendo a liberação da enzima hialuronidase que reage com o ácido hialurônico da corona radiata do ovulo digerindo suas células e penetrando no espaço correspondente 
- Na membrana plasmática do espermatozoide existe uma proteína receptora de cálcio que é ativada e a consequência de complexos sistemas iniciados a partir da hialuronidase. Ao se ligarem ocorre o influxo de cálcio na cabeça do espermatozoide promovendo o aumento do Ph local 
- Essa mudança de Ph faz com que ocorra a fusão da membrana plasmática e da membrana externa do acrossomo formando pequenas vesículas com minúsculas aberturar por onde a enzima acrosina irá sair 
- A penetração nos envoltórios do ovulo se dá quando há a fixação do espermatozoide na zona pelúcida através do reconhecimento pelas enzimas do acrossomo que contem receptores específicos de glicoproteínas (ZP1, ZP2, ZP3) da zona pelúcida 
- A glicoproteína ZP3 é responsável pela fixação e reação acrossomal 
- A acrosina digere a zona pelúcida possibilitando a entrada do espermatozoide no espaço perivitelínico (entre a zona pelúcida e a membrana plasmática do oócito) 
- O espermatozoide penetra então no citoplasma do oócito 
- Essa entrada faz com que a membrana do oócito despolarize mudando a configuração de seus receptores para o espermatozoide 
- Ocorre então a mudança de Ph dentro do oócito pela liberação de cálcio do reticulo endoplasmático e mitocôndrias do oócito 
- Essa mudança de Ph faz com que os grânulos corticais do oócito liberem seu conteúdo para o espaço perivitelínico 
- Essa secreção reage com outras enzimas presentes e forma uma estrutura solida que impede que outros espermatozoides adentrem o espaço perivitelínico 
- Após a penetração ocorre a segunda divisão meiótica com a saída do segundo corpúsculo polar 
- Ocorre a formação dos dois prónucleos masculino e feminino e a singamia(fusão) 
- Em 4/5 dias ocorre a clivagem de mórula até blástula no oviduto da fêmea 
× Reação cortical ou da zona:
- São eventos que ocorrem no oócito para a fim de impedir a polispermia(fecundação do oócito por mais de um espermatozoide)
Bloqueio primário - Após o espermatozoide penetrar no citoplasma do oócito ocorre a despolarização da membrana do oócito, com mudança de Ph, o que estimula a desgranulação dos grânulos corticais do oócito, estes reagem com outras enzimas e criam uma barreia solida que impede a entrada de outros espermatozoides 
Bloqueio secundário - Os grânulos provocam hidrolise parcial das proteínas da zona pelúcida, perdendo os receptores espermáticos tornando-se assim resistente a entrada de outros espermatozoides 
→ Protocolos da FIV
1- Preparação dos espermatozoides 
- Separação dos espermatozoides vivos dos demais componentes do sêmen 
- A separação pode ser feita por dois métodos:
• Swim-up: 
- Método de sedimentação-migração tradicional 
- Consiste em colocar a amostra de sêmen em um tubo de ensaio, coloca-se então o meio de cultivo aquecido a 37°C dentro do tubo com os espermatozoides e leva à estufa por 1h30min
- Os espermatozoides capacitados irão boiar, irão para cima do tubo, e os não capacitados ou mortos irão sedimentar no fundo do tubo de ensaio 
• Percoll: 
- Separação por gradiente de densidade
- Consiste em depositar a amostra de sêmen em um tubo de ensaio e adicionar o Percoll 
- Após isso colocar na centrifuga por 5min
- Os espermatozoides incapacitados, mortos e componentes celulares do plasma ficaram na superfície do tubo, e os vivos e capacitados estarão no fundo do tubo 
2- Capacitação “in vitro”
- Após a seleção dos espermatozoides vivos coloca-los na heparina 10microgramas
- A heparina é um glicosaminoglicano presente no trato reprodutor feminino responsável pela capacitação espermática, ela retira as moléculas de colesterol do espermatozoide 
3- Fertilização 
- Retirar da estufa os oócitos com a Cumulus Oophorus expandida na placa de petri 
- Passar os oócitos para uma gota de fertilização 
- Meio de fertilização: Fert-Talp, na estufa de 5% de CO2 a 39°C por 24h 
- Pegar o tubo de ensaio que contém os espermatozoides capacitados na heparina, pipetar e transferir um pouco deles para cada gota de oócito no meio de fertilização, 2 milhões de espermatozoides por mL
- Colocar a placa de petri novamente na estufa por 24h, após isso retirar a placa e analisar com a lupa 
- Retirar as células da Cumulus Oophorus e retornar a placa para a estufa por mais 24h 
- Após decorrido o tempo analisar a placa de petri novamente 
- Se tiver ocorrido a fecundação o segundo corpúsculo polar vai ter sumido e dará para visualizar os dois prónucleos 
- Após isso esse material será passado para outra gota que será o meio de desenvolvimento embrionário, este material ficará na estufa até ser depositado na receptora 
- Durante o tempo que o embrião permanecer na estufa será necessário ir adicionando mais meio de cultivo pois o metabolismo do embrião é altíssimo 
- A deposição na receptora deverá ser feita 7 a 9 dias após ela ter manifestado os sinais de estro, pois esta precisará ter uma alta de progesterona para poder dar andamento na gestação 
- É imprescindível sincronizar o cio da receptora para que ela esteja produzindo progesterona no momento que for realizada a TE 
- O embrião será depositado no corno uterino em que o ovário tiver ovulado, isso é, onde tiver o corpo lúteo funcional secretando progesterona 
∆ Para éguas não é utilizado a FIV, os espermatozoides não são maturados direito, não são capacitados corretamente. A FIV é utilizada para ruminantes e outros animais. 
2) Injeção intracitoplasmática de espermatozoides – ICSI
- É uma variação da FIV, ocorre naturalmente 
- Essa técnica apareceu na década de 70 para os homens que produziam ejaculados com poucos espermatozoides ou com muitos defeitos 
- No Brasil essa técnica só se iniciou na década de 90 
- Muito utilizada em grandes felinos, baleias, animais em extinção, equinos de alto valor genético porém com péssimo sêmen 
- Nessa técnica foi constatado o nascimento de mais machos do que fêmeas 
Vantagens: 
- Pode ser utilizado em espermatozoides já mortos ou com baixa motilidade, baixa capacidade. A técnica consiste em romper a zona pelúcida e inserir o espermatozoide dentro do óvulo, é necessário somente o material genético dele
Desvantagens: 
- É uma técnica muito cara, 20mil reais, enquanto que a TE é somente 2mil 
- É necessária mão de obra muito especializada e treinada 
- Necessário material caro e altamente especializado para realizar 
→ Como é feita: 
- Faz a obtenção do oócito do animal doador 
- Utiliza ou laparoscopia, Ovum-pick-up, ou outra técnica disponível 
- Normalmente são utilizados folículos pré ovulatórios pois ai não é necessário fazer todo o processo de maturação do oócito 
- O problema de selecionar somente o folículo pré ovulatório é a taxa de recuperação de oócitos, normalmente recupera 1 no máximo 2 oócitos. Mas alguns aspiram os folículos antes da dominância, podendo aspirar até 20 folículos. Após a aspiração deverá ser feita a maturação, porém a taxa de recuperação ainda é baixa 
- Após o oócito estar maturado e pronto, você perfura a zona pelúcida deste e insere o espermatozoide do macho escolhido, coloca na incubadora e quando o embrião estiver formado você insere na receptora 
- Ou também dá para perfurar o ovário da fêmea, insere o espermatozoide dentro dela mesma e pronto 
∆ O processo em si: 
- Os oócitos precisam estar desnudos, sem as camadas da Cumulus Oophorus 
- Precisam estar maduros, em metáfase II
- Esse desnudamento é feito colocando o oócito em um meio repleto de hialuronidase por um período muito breve 
- Depois é feita a pipetagem mecânica até que fique somente a zona pelúcida do oócito 
- Depois disso a agulha injetora injeta o espermatozoide dentro do ovulo, isso é, no citoplasma do oócito e este conjunto irá para incubadora por algumas horas 
- Depois é feita a checagem com lupa igualmente na FIV, se houver os dois prónucleos a fertilização está completa e a receptora poderá receber o embrião em seu corno uterino que ovulou 
→ Transferência de oócitos – TO 
- A transferência de oócitos é feita em éguas 
- Usa-se oócitos advindos de éguas com alto padrão genético que possuem algum problema para gestar o embrião, éguas subférteis 
- Problemas uterinos, ovarianos, cervicais 
- Ocorrerá a maturação in vitro e a transferência do oócito para a fêmea receptora 
- A TO pode auxiliar no uso de garanhões com baixa qualidade de sêmen através da Transferência Intrafalopiana de gametas(GIFT)
- A desvantagem da TO é seu alto custo 
- Os oócitos transferidos de uma doadora para uma receptora deverão estar no estágio de desenvolvimento adequado, pode ser conseguido in vitro ou in vivo 
- A TO não é uma boa escolha quando há muitos folículos ovarianos, pois desta forma coleta-se muitos folículos imaturos 
- O melhor seria superovular a fêmea doadora e coletar seus oócitos antes da ovulação 
• Obtenção dos oócitos
- Podem ser utilizados protocolos hormonais para superovular as fêmeas doadoras com hCG
- Fazer a coleta por aspiração, lavagem, punções pelo flanco, laparotomia 
- Ovários advindos de abatedouros também são ótimas fontes de oócitos 
- Quando ocorre a coleta de folículos pré ovulatórios é conseguido oócitos em metáfase I ou II 
- Faz-se a remoção do complexo da Cumulus Oophorus com micromanipulação deixando os oócitos livres 
∆ A técnica em si: 
- Coleta oócitos de doadoras de alto padrão genético que não conseguem gestar seus filhotes 
- Faz a maturação do oócito in vitro ou in vivo
- Transfere os oócitos para as éguas receptoras 
- Insemina as éguas receptoras com o sêmen do garanhão previamente escolhido 
- Assim os oócitos das doadoras serão fertilizados naturalmente nos cornos uterinos das receptoras 
- Para transferir os oócitos é necessário fazer a contenção no tronco, sedação e analgesia, a técnica é feita cirurgicamente por laparotomia através do flanco 
- São depositados um ou mais oócitos na tuba uterina 
- Depois é feita duas inseminações artificiais intrauterinasnas receptoras 
- Lembrando que as receptoras devem ter seus próprios folículos aspirados para que não haja gestação destes 
× Éguas utilizadas nos protocolos de superovulação: 
- Folículos com diâmetro maior que 35mm
- Edema uterino 
- Útero e cérvix relaxados 
- Após a utilização do protocolo ovulam em até 48h 
- Já os coletados com 24h após a administração do hCG precisam ser cultivados in vitro antes da transferência 
→ Transferência Intrafalopiana de gametas (GIFT)
- Essa técnica consiste na deposição dos oócitos e espermatozoides na ampola ou infundíbulo de um dos cornos uterinos da égua receptora 
- Isso permite utilizar sêmen de baixa qualidade em fêmeas subférteis
- Essa técnica é a TO associada a espermatozoides 
- Pode-se usar sêmen congelada ou sexado previamente 
- A técnica da GIFT é a mesma utilizada na TO, o que muda é a adição dos espermatozoides no meio de cultura junto com os oócitos minutos antes de realizar a sua deposição no corno uterino 
→ Congelação de embriões – Criopreservação 
- Utilizada muito associada as outras biotecnologias por aumentar o tempo de vida dos embriões e gametas 
- A refrigeração tem como limitação o curto período de tempo que os embriões se mantem viáveis 
- Os embriões congelados com glicerol e etilenoglicerol resultaram em taxas aceitáveis de gestação 
- Reduz o metabolismo e a divisão celular e permite o transporte de embriões entre propriedades 
- Pode-se fazer a importação e exportação de embriões 
- Preservação de material genético 
- E a redução do número de receptoras necessárias em um programa de TE 
- Existem dois métodos: 
• Congelamento lento de embriões: 
- É um método clássico de criopreservação 
- Utiliza baixas concentrações de crioprotetores, utilizados para diminuir os danos causados pelo procedimento de preservação 
- Utiliza-se as soluções crioprotetoras presentes nos kits de congelamento que são disponíveis comercialmente 
- Após isso os embriões são depositados em pellets juntamente com a solução crioprotetora 
- São resfriados pelo nitrogênio líquido 
- No momento do congelamento os embriões são removidos do meio de cultivo para o interior de outros pellets e transferidos para a câmara de armazenamento 
- A queda de temperatura no interior da câmara de armazenamento ocorre gradativamente 
- Após um tempo é induzido a formação de cristais de gelo com uma pinça envolta em algodão e embebida no nitrogênio líquido(seeding)
- Essa técnica faz com que a água sai lentamente, não haja formação excessiva de cristais de gelo e preserve o material 
- O descongelamento do material é feito gradativamente também, com banhos para ocorrer a remoção do crioprotetor
• Vitrificação: 
- Este método utiliza altas concentrações de crioprotetores 
- As altas concentrações de crioprotetores criam uma viscosidade na amostra impedindo que esta forme cristais de gelo excessivos 
- Nesse método a queda da temperatura é feita rapidamente por meio do uso de nitrogênio líquido, essa queda brusca de temperatura evita a formação de cristais de gelo 
- A desvantagem é que a alta concentração de crioprotetores pode induzir a injurias toxicas e osmóticas no embrião 
→ Sexagem de espermatozoides 
- Essa técnica consiste em escolher o sexo do bezerro antes mesmo da gestação ou da produção do embrião 
- Possibilita ao produtor planejar os nascimentos de machos e fêmeas de acordo com as necessidades do rebanho e do mercado
- Pré requisito para a sexagem, possuir MRP maior que 60% 
Vantagens: 
- Ganho genético, não terá descarte de animais nascidos com o sexo indesejado 
- Redução do tempo de seleção
- Direcionamento nos testes de progênie, para fazer a avaliação sem a sexagem é necessário avaliar 200 filhas, com a Sexagem não precisa avaliar 
- É uma técnica acessível economicamente 
- Essa técnica agrega valor ao produto sobretudo a pecuária leiteira, o maior nascimento de fêmeas implica em uma maior produção leiteira 
• Separação dos espermatozoides 
- Feito através de máquinas 
- O gene X das fêmeas tem 4% mais material genético que o Y dos machos, portanto é maior e mais pesado 
- Como os espermatozoides vão passar por vários processos sua viabilidade diminui, assim a máquina trabalha em 4°C para refrigerar o sêmen e diminuir seu metabolismo 
- O sêmen será refrigerado e congelado 
- Índice de prenhez, 51,4% a 58,6% é mais baixo que o do sêmen convencional devido os processos que o material precisa passar para ser sexado 
- Como a viabilidade já é baixa a fêmea será inseminada no corno uterino onde houve a ovulação para facilitar o processo de fecundação 
× Citometria de fluxo – Sexagem pelo conteúdo de DNA 
- O citômetro de fluxo emite um feixe de laser com sensor para medir a fluorescência e a dispersão de luz 
- Quando os espermatozoides passam pelo raio lazer a tinta fluorescente é identificada 
- Necessário fazer a incubação do sêmen com uma tinta fluorescente e levar ao citômetro
- Como o cromossomo X é maior os espermatozoides femininos emitem maior quantidade de luz que os espermatozoides masculinos
- A fluorescência é proporcional a quantidade de DNA 
- Os detectores medem a quantidade de fluorescência emitida e detectam cargas negativas e positivas em cada gota contendo um espermatozoide, analise uma célula por vez 
Como ocorre: 
- Um cristal elétrico vibra e quebra a corrente em microgotas contendo um espermatozoide por gota 
- Um raio laser emite luz UV sobre os espermatozoides 
- A fluorescência é detectada e classifica os espermatozoides como X, Y ou duvidosos 
- Aplica-se então uma carga negativa, positiva ou nenhuma carga as microgotas 
- As microgotas carregadas são desviadas quando passam frente ao campo elétrico gerado por placas 
- Os espermatozoides são então depositados nos recipientes de X, Y, ou descarte de duvidosos 
× Sensibilidade ao Ph do meio: 
- Consiste em selecionar o espermatozoide baseando-se na sua resistência ao meio que este foi colocado 
- Cromossomos X possuem maior resistência ao meio ácido 
- Cromossomos Y possuem maior resistência ao meio alcalino 
- O teste é feito utilizando muco cervical 
- Não possui acurácia alta 
× Sexagem por densidade: 
- O espermatozoide com cromossomo X é mais pesado do que o cromossomo Y 
- Então coloca-se o sêmen em uma solução de Percoll e centrifuga para separa-los por densidade 
- A acurácia deste método também não é alta 
× Sexagem por velocidade de migração:
- Consiste em avaliar o MRP dos espermatozoides X e Y no mesmo meio de cultura 
- Por ser mais leve o espermatozoide que contém o cromossomo Y chega mais rapidamente na trompa do que o X 
- Coloca-se o sêmen juntamente com o meio, centrifuga e anota-se os resultados 
- Avaliação feita com o meio contendo albumina sérica, o Y possui maior velocidade de migração 
→ Sexagem de embriões
- Na Sexagem de embriões a taxa de descarte é maior do que na Sexagem de espermatozoides já que se o embrião não for do sexo pretendido este será descartado, abortado 
- A Sexagem visa o intuito da criação, criação leiteira necessitam de fêmeas, já criação de corte necessitam de machos
- Essa técnica agrega valor ao produto 
- Faz a produção dos embriões in vivo ou in vitro, realiza-se então a coleta dos embriões e então a sexagem destes 
- Pela FIV faz o cultivo do embrião e é realizado a biopsia deste pelo PCR 
× Realizando a biopsia do embrião: 
- Primeiro faz a biopsia depois faz o PCR do embrião para descobrir o sexo 
- Faz a coleta convencional do embrião no útero da fêmea
- Faz a lavagem do embrião em solução de salina fosfatada e soroalbumina bovina 
- Coloca-se essa solução em uma placa de petri, 10 gotas por placa 
- Então coloca-se todos os embriões na primeira gota e vai passando de gota em gota, ao final deste processo o embrião estará limpo do liquido uterino 
- Após a lavagem é feita a avaliação do embrião
• Avaliação dos embriões 
∆ Para realizar a sexagem dos embriões será necessária fazer a sua congelação, toda a vez que o embrião écongelado ele perde um grau. 
- Para transferir os embriões só serão utilizados de grau I e II
Grau I – Excelente ou bom: 
- Estágio de desenvolvimento correspondente ao esperado
- Massa embrionária simétrica e esférica 
- Blastômeros individuais e uniformes em tamanho, cor e densidade 
- Zona pelúcida regular 
Grau II – Regular: 
- Estágio de desenvolvimento correspondente ao esperado 
- Forma regular 
- Zona pelúcida intacta ou não 
- Irregularidade moderada da massa embrionária 
Grau III – Pobre: 
- Estágio de desenvolvimento não correspondente ao esperado 
- Irregularidades maiores da massa embrionária 
Grau IV – Morto ou degenerado: 
- Estágio de desenvolvimento não correspondente ao esperado 
- Embrião em degeneração 
- Zona pelúcida apresenta lesão 
• A biopsia em si: 
- Utilizado um aparelho de micromanipulação 
- Essa técnica depende muito da experiência do técnico, pois é necessário movimentos finos e objetivos para não danificar o embrião 
- O aparelho possui duas micropipetas 
- A maior possui uma pressão negativa que segura o embrião, a menor possui uma ponta pontiaguda que irá perfurar a zona pelúcida do embrião e aspirar algumas células de dentro dela
- Após a aspiração as células serão colocadas em um tubo de ensaio com uma solução tampão e serão enviadas ao laboratório para realizar o PCR 
× Técnica do PCR – Reação em cadeia da polimerase 
- Realizada para a amplificação da PIV
- A vantagem é fazer a sexagem com um número mínimo de células 
- Utiliza-se uma enzima que vai reconstruir um gene a partir dos primers, iniciadores 
- Os primers são moléculas simples de DNA produzidas em laboratório 
- Pega o começo e o final do gene e produz uma fita simples a partir dele 
- Se ocorrer a reação a enzima irá completar o gene inteiro
- O laboratório possui o primer, um pedaço do gene que codifica o cromossomo Y por exemplo 
- Esse primer possui uma sequência de oligonucleotídeos que codificam o gene Y 
- A reação é feita em progressão geométrica, amplifica a quantidade de células, por isso pode ser feita com o mínimo de material genético 
Etapas: 
- Incubação do tecido com uma enzima proteolítica para romper a célula 
- Purificação do DNA 
- Precipitação do DNA em álcool frio 
- Pipeta a amostra e coloca em uma solução tampão para manter o Ph 
- A amostra então é levada ao termociclador para avaliação 
- O termociclador irá alterar a temperatura da amostra 35 vezes, são 35 ciclos 
- Primeiro ciclo, aquece a amostra e a fita dupla se separa 
- Depois resfria 50°C e os primers procuram a correspondência, encontra a correspondência se for macho, se for fêmea a reação não ocorre 
- Depois aquece a 72°C a enzima TAC polimerase completa o gene que foi encaixado 
- De uma fita dupla, faz duas fitas duplas no primeiro ciclo e assim por diante, uma vira duas, duas virão 4....... 
- O termociclador separa e depois pareia as fitas com os primers das amostras 
• Aplicação das amostras amplificadas no gel de agarose: 
- É a visualização das amostrar por eletroforese 
- O gel faz as proteínas correrem de um polo para o outro, dependendo do tamanho as proteínas correm mais e umas correm menos 
- Gens grandes são mais lentos e correm menos, genes pequenos são mais rápidos e correm mais 
- Como é um gene conhecido o laboratório manda quantas kilobases esta amostra precisa correr para dar positivo, então quando houver bandas nos locais corretos tem grandes chances de ser o sexo que foi buscado no PCR 
- Porem se não aparecer não pode dizer que seja negativo para este sexo, somente que a reação não ocorreu 
- Não há falsos positivos, mas pode haver falsos negativos 
× Citogenética: 
- Avaliação de aberrações cromossômicas 
- Vai contar pelos cromossomos e visualizar o cromossomo X e Y
- Nesse exame dá para buscar os casos de trissomia e assim por diante 
- Feita por amostras de sangue 
× Determinação enzimática: 
- Machos possuem enzimas diferentes das fêmeas 
× Sondas de DNA: 
- É a determinação pelos primers
- Mas a desvantagem é que será necessário várias células pois não amplifica igual ao PCR 
- Risco de morte do embrião 
× Sexagem por técnicas imunológicas: 
- Fácil de fazer mas a eficácia não é tão grande 
- Células masculinas possuem um antígeno de superfície chamado HY
- Se pegar algumas células masculinas e incubar com anticorpos anti HY e corar com tinta fluorescente quando o anticorpo encontrar o antígeno na superfície este irá brilhar 
- As células que brilham são masculinas 
- Porem somente 70% dos embriões possuem essas células então acurácia é baixa 
→ Clonagem
- É a produção de indivíduos idênticos 
- É a técnica de reprodução assexuada por brotamento com capacidade de produzir indivíduos geneticamente idênticos
- Possui alto custo 
- Definição de clones: População de moléculas, células ou organismo que se originaram de uma única célula e que são idênticas a célula original e entre elas 
- Clones são indivíduos geneticamente idênticos 
- Primeiro usou mórula, blastocistos, células germinativas, depois que começaram a clonar germinativas(2n) e depois fibroblastos 
Finalidade:
- Melhoramento genético, multiplicação de animais com características genéticas desejáveis 
- Pesquisas fundamentais, herança do DNA mitocondrial, reprogramação do DNA, métodos de ativação, diferenciação celular 
- Clonagem de espécies em extinção, preservação de raças ou espécies em risco de extinção 
- Clonagem de animais transgênicos 
• Métodos de clonagem: 
- Clones naturais: Gêmeos idênticos, univitelínicos 
Clones artificiais: 
- Separação de blastômeros, bipartição(bissecção) dos blastômeros de embriões nos estágios iniciais de desenvolvimento: Numero de clones é reduzido 
- Transferência nuclear 
× Transferência nuclear: 
- Consiste na transferência de núcleos de um oócito maduro e a sua introdução no núcleo de uma célula somática(2n) 
Etapas: 
- Fazer a preparação dos oócitos receptores, maturação dos oócitos até metáfase II
- Retirar as células da Cumulus Oophorus com hialuronidase e fica pipetando e soltando 
- Depois fazer a seleção, se houver a presença do primeiro corpúsculo polar está ok, já sofreu a meiose I e está em metáfase II
- Os que não tem o corpúsculo polar descarta 
1- Enucleação do oócito (citoplasma receptor): 
- Tem 4 técnicas: 
- Consiste em retirar o núcleo do oócito, sobrando apenas o citoplasma mais a zona pelúcida 
a. Corar o núcleo 
- Cora o oocito com uma tinta e expõem a uma luz fluorescente
- Brilhou o núcleo, você pipeta o material genético 
- É a mais nociva 
- É fácil 
b. Democolcina 
- Incuba no meio com essa substância 
- O núcleo do oocito ele vai para a periferia e forma um calombo 
- Forma um falso corpúsculo polar, um pseudo corpúsculo polar 
- Pipeta o citoplasma do calombo, é o material genético 
c. Secção do oócito
- Cortar o oocito ao meio e desprezar onde não estiver o corpúsculo polar 
- Agressivo 
- Corta a célula ao meio 
d. Ativação com cálcio 
- Incubar o oócito em cálcio para ele continuar a divisão da segunda meiose 
- Quanto o espermatozoide entra no oócito ele leva para dentro cálcio e esse cálcio degrada a enzima que está parando o núcleo em metáfase II 
- Então você coloca cálcio no oócito para ocorrer a meiose e sair o segundo corpúsculo polar 
- Então você pipeta próximo ao segundo corpúsculo polar para retirar o material genético de dentro 
- Menos agressiva, mais natural 
2- Preparação da célula doadora de núcleo:
- Embriões no estado de mórula fazer a retirada da zona pelúcida com pronase 
- Células somáticas, colocar em solução de tripsina 
3- Reconstrução – Fusão da célula doadora com o oócito receptor: 
- Feita por eletrofusão, as células são estimuladas por corrente elétrica 
- Colocar em uma placa de petri e adicionar um meio de baixa condutância para evitar a produção e dispersão de calor 
a- Correntes alternadas 
- As correntes alternadas alinham as membranas que serão fundidas 
b- Correntes diretas
- As diretas abremporos na membrana o que leva a fusão entre as células 
→ Animais transgênicos 
- Organismo que teve seu patrimônio genético alterado com a introdução de um DNA exógeno 
Importância: 
- Xenotransplante: Criação de porcos “humanamente genéticos”, utilizado para transplantes de órgãos 
- Modelo de estudos para doenças genéticas 
- Melhora de características produtivas 
- Biologia básica, mecanismo da expressão gênica 
- Produção de animais mais resistentes a clima, doenças e enfermidades 
Etapas:
- Construção do vetor, inserção do vetor na célula, seleção das células geneticamente modificadas, criação do transgênico 
Técnicas: 
• Microinjeção
- Mais utilizado em camundongos 
- Fez a microinjeção do material genético e este se integra ao DNA do receptor 
• Vetores virais 
- Injeta um retrovírus 
- O retrovírus possui RNA como material genético e ao infectarem as células estes tem seu material genético convertido para DNA 
- Retira-se a parte infectante do vírus e insere um gene de interesse 
• Transferência nuclear(clonagem)
- Gerou a Dolly 
- Faz a enucleação do oócito maturado e é adicionada a célula doadora de núcleo no citoplasma e ocorre a fusão das membranas por eletrofusão 
• Eletroporação
- O uso de detergentes ou pulsos elétricos induz a formação de poros na membrana permitindo a entrada de DNA e sua integração ao genoma 
• Biobalística
- Consiste em dar um tiro de DNA nas células alvo que empurram o DNA de interesse para dentro das células alvo 
• Espermatozoides 
- Associada a FIV
- Incuba os espermatozoides com solução de DNA 
- Faz a eletroporação para estes entrarem na membrana 
• Produção por células tronco
- Celulas tronco são de origem embrionária e permanecem indiferenciadas, podem se diferenciar em qualquer tipo de tecido 
- Pode-se fazer a produção de animais transgênicos, tratamento de doenças degenerativas, lesões medulares por trauma, lesões cardíacas como infarto 
Quimeras: São formadas de células do embrião recipiente e das células tronco recombinantes 
Duas formas: 
• Injeção de células tronco em blastocistos:
- Faz o isolamento de células tronco, transferência e seleção 
• Agregação de mórulas com células tronco 
- Faz a injeção das células tronco e depois a transferência para a receptora(um animal vivo) 
 
:
→ Superovulação de doadoras 
- Estimulação de diversos folículos terciários a se desenvolverem até o estágio de pré-ovulação 
- É o aproveitamento mais racional das ondas foliculares, onde os folículos iriam ficar atrésicos 
- É o aumento do número fisiológico de ovulações da própria espécie, provocada mediante estimulação com gonadotrofinas 
- O tratamento para a superovulação deverá ser feito antes da seleção do folículo dominante, no começo da onda folicular 
- É necessário acompanhar os folículos superestimulados por meio da palpação