Extração Digestão Gel Purificação PCR DNA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA
REVISÃO DAS AULAS PRÁTICAS
· Clonagem do gene gfp (Green Fluorescent Protein) de Aequorea victoria água-viva (celenterado,
jellyfish) em E. coli (LE392)
GFP é utilizado como repórter em estudos de expressão gênica e na localização de proteínas em
uma grande variedade de organismos.
A proteína GFP espécie selvagem (uma única cadeia polipeptídica de 238 aa)
A proteína GFP tem dois picos de absorbância máxima: 395nm e 475nm
Excitação a 395nm resulta na fluorescência a 508nm (verde)
· A cepa LE392 é uma E. coli de laboratório auxotrófica, isto é, depende de metabólitos complexos
para sobreviver e, portanto, dificilmente sobrevive fora dos meios de cultura.
1) Extração de DNA total de E. coli
O DNA total de E. coli foi extraído como exemplo pois, em uma situação real, o DNA total de
Aequorea victoria deve ser obtido.
A bactéria E. coli foi crescida em meio de cultivo rico e recuperada por centrifugação.
A escolha da técnica a ser utilizada para romper as bactérias é ditada por 3 fatores: o tamanho do
DNA, a natureza da parede bacteriana e as técnicas a serem utilizadas subsequentemente.
Fragmentos longos de DNA (como o DNA total de E. coli) são facilmente fragmentados e devem
ser liberados das células por um processo brando. As bactérias são ressuspendidas em uma solução
de NaCl e EDTA que deve ter pH 8 [0,9% NaCl (154mM) solução isotônica; EDTA só é
solubilizado a pHs >7).
EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) inibe a atividade de desoxirribonucleases (DNases) pois
atua como agente quelante de íons essenciais para a atividade destas enzimas (Mg2+)
SDS: é um agente detergente que solubiliza lipídeos. É um desnaturante de proteínas e também
rompe ligações não-covalentes inter-subunidades de proteínas oligoméricas. Também é utilizado
para se certificar que nenhuma nuclease que não depende de Mg2+, cause qualquer degradação.
NaCl: íons no meio aquoso podem romper ligações iônicas de cadeias polipeptídicas. Também
auxiliam na dissociação das proteínas ligadas aos ácidos nucléicos.
Solventes orgânicos: que têm uma porção hidrofóbica (lipofílica) e uma porção polar são agentes de
precipitação de macromoléculas. Os grupos polares interagem com grupos polares protéicos em
competição com moléculas de água. Os grupos hidrofóbicos podem romper interações
intramoleculares estabilizantes da estrutura da proteína. Um volume elevado de solvente orgânico
reduz a concentração efetiva da água, deixando menos moléculas de água para hidratação da
proteína. Isto é, modificam a camada de solvatação das proteínas.
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Fenol-Clorofórmio: contaminantes protéicos são desnaturados e há partição das mesmas na fase
orgânica ou interface entre as fases orgânica e aquosa, enquanto que ácidos nucléicos permanecem
na fase aquosa. A utilização de fenol-clorofórmio é mais eficiente do que a utilização de somente
um deles. Lipídeos, grandes polissacarídeos e proteínas complexadas ao SDS permanecem na fase
fenólica.
Etanol: É utilizado para precipitar ácidos nucléicos com mais do que 15 nucleotídeos. Sais e outros
solutos tais como fenol e clorofórmio ficam em solução enquanto que ácidos nucléicos formam um
precipitado branco que pode ser coletado por centrifugação.
Tampões contendo > 1mM fosfato ou > 10mM EDTA não devem ser utilizados para precipitação de
etanol pois estas substâncias co-precipitam com os ácidos nucléicos.
2) Extração de DNA plasmidial
Solução de formação de protoplastos: isotônica (isosmótica) a fim de que não haja o rompimento
das membranas das células bacterianas.
Lisozima: enzima presente nas lágrimas e muco, assim como na clara de ovo. Catalisam a hidrólise
da ligação glicosídica entre N-acetilglucosamina (NAG) e ácido N-acetilmurâmico (NAM).
Consequentemente, tratamento de bactérias Gram(+) com lisozima degrada as suas paredes
bacterianas e resulta na lise das células. Bactérias Gram(-) como E. coli são resistentes à lisozima e
ocorre somente o enfraquecimento da mesma. Peptideoglicano: peptídeo + polissacarídeo b(1----
>4) NAG-NAM Peptideoglicano: Gram(+) ~ 250Å; Gram(-) ~ 30Å + parede externa complexa
Solução de Lise (NaOH e SDS): saponificação de lipídeos e rompimento da parede bacteriana pela
solubilização da bicamada lipídica.
Acetato de Sódio: utilizado para a precipitação de DNA e RNA. É mais solúvel em etanol do que
NaCl.
PLASMÍDEOS: são elementos extracomossomais com capacidade de replicação autônoma.
Características (vetores):
constituídos por uma molécula de DNA de fita dupla circular.
origem de replicação autônoma
possuem genes que conferem resistência à antibióticos.
possuem um sítio de policlonagem.
podem variar de 1000 bp até 200 000 bp.
3) Digestão: enzimas de restrição
Enzimas de restrição são endonucleases que reconhecem e rompem as ligações de fosfato de
seqüências específicas de DNA. Endonucleases de restrição não cortam quando a seqüência
específica de DNA for metilada por uma Metilase. Diferentes espécies e cepas de bactérias contem
pares únicos de sistemas de restrição/metilação. Desta forma, o DNA de outro organismo que
invade uma bactéria é rapidamente degradado enquanto que o DNA do hospedeiro, que é metilado,
não é degradado.
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Uma unidade enzimática de restrição (1U) é a quantidade de enzima necessária para clivar
completamente 1 µg de DNA de bacteriófago l, em 1 hora, na temperatura ótima de atividade
(37°C, em geral).
4) Análise eletroforética em gel de agarose
Agarose é um polímero linear extraído de algas marinhas e basicamente se compõe de D-Galactose
e L-Galactose. Quando a agarose é derretida e então deixada para solidificar, ela forma uma matriz
que serve como uma peneira de separação de fragmentos de DNA de tamanhos diferentes. A
eletroforese em gel de agarose é uma técnica simples, fácil e sensível, capaz de separar fragmentos
com maior resolução do que outros métodos como a centrifugação em gradientes de CsCl (cloreto
de Césio), por exemplo. Outra vantagem é que os ácidos nucléicos podem ser visualizados no gel,
pelo uso do corante fluorescente Brometo de Etídeo (lexc ~300nm; l l ~590nm, vermelho-laranja).
Este corante se intercala entre os pares de bases empilhados da molécula de DNA/RNA. A
fluorescência do Brometo de Etídeo associado a ácidos nucléicos é maior do que livre em solução
permitindo, deste modo, que pequenas quantidades de DNA/RNA sejam detectadas (cerca de 10ng
DNA ou RNA por banda).
Fatores que influenciam a migração em gel de agarose:
Concentração
Tamanho dos fragmentos de DNA: fitas lineares duplas passam através da matriz do
gel a uma velocidade inversamente proporcional ao log pb (fragmento menor é mais
rápido).
Conformação do DNA: o formato do fragmento de DNA de um determinado tamanho
influencia a velocidade de migração (circular fechado: + rápido; circular aberto: mais
lento; linear: intermediário).
Corrente aplicada: maior voltagem resulta em migração mais rápida. (voltagens muito
altas ou muito baixas não são recomendadas). Voltagem normal: 5-10 V/cm
Direção do campo elétrico: DNA migra em direção ao ânodo (carga positiva) devido
aos grupos fosfatos de carga negativa.
Composição do tampão de eletroforese: Na ausência de íons a condutância elétrica é
mínima e o DNA migra bem devagar. Em tampões de alta força iônica a condutância
elétrica é por demais eficiente e uma grande quantidade de calor é gerada - no pior caso
o gel derrete e o DNA desnatura. Também a carga é função do pH do tampão.
5) Purificação e ligação
O fragmento de DNA clivado será purificado do gel de agarosee ligado a um vetor de super-
expressão - que também foi clivado com as mesmas enzimas de restrição.
6) Transformação
O fragmento de DNA ligado a um vetor de super-expressão será introduzido em células bacterianas
hospedeiras.
Transformação é a introdução de moléculas de DNA em uma célula hospedeira (bactérias são
ideais, mas células eucarióticas são utilizadas em alguns casos). Várias técnicas têm sido descritas
para a introdução de DNA em células bacterianas:
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6.1) Choque térmico: incubação de células hospedeiras (preparadas com cloreto de cálcio) com
moléculas de DNA e submetendo a mistura a um choque térmico resulta num aumento da eficiência
da transformação. Os mecanismos envolvidos na transformação de DNA não são completamente
conhecidos. Mas os requerimentos essenciais para uma transformação eficiente são a presença de
cátions multi-valentes, incubação à 0°C, e controle rigoroso do choque térmico à 42°C. A
proporção de células que se tornam "competentes" para transformação é de aproximadamente 10%
da população total. Eficiência: 105 - 106 colônias transformadas/µg de DNA plasmidial.
6.2) Eletroporação: É um processo físico que transitoriamente permeabiliza membranas de células
procarióticas e eucarióticas a partir de um pulso elétrico. Eficiência: 109 - 1010 colônias
transformadas/mg de DNA plasmidial. Eletroporação é feita a baixa temperatura (0-4°C) pois a
eficiência é reduzida em cerca de 100 vezes à temperatura ambiente. 6.3) Choque osmótico:
6.4) Micro-injeção de DNA: O DNA é injetado nas células com uma micropipeta de vidro (ponta de
0,1 mm de diâmetro).
6.5) Balística de Micropartículas: Projéteis de ouro (ou tungstênio) são cobertos com moléculas de
DNA e utilizados para bombardear células hospedeiras.
7) Análise de colônias
As colônias serão analisadas por algum marcador que permita a identificação de células hospedeiras
que possuam o plasmídeo com o gene clonado.
8) O resultado destas manipulações do gene que codifica a GFP é a transferência do mesmo de um
vetor de clonagem para um vetor de super-expressão (com regiões promotoras e terminadoras da
transcrição).
9) REAÇÃO EM CADEIA DA ENZIMA DNA POLIMERASE (PCR)
Introdução:
Em 1985 foi desenvolvida a técnica da Reação em Cadeia da DNA Polimerase (PCR, Polymerase
Chain Reaction). PCR permite a produção de grandes quantidades de um determinado segmento de
DNA a partir de apenas uma molécula de DNA sem haver a necessidade de introduzir esta molécula
de DNA em bactérias.
Os dois desenvolvimentos tecnológicos que melhoraram, simplificaram e reduziram o trabalho
necessário para a execução de PCR são:
1) a utilização da DNA Polimerase termoestável isolada de Thermus aquaticus (Taq
DNA Polimerase) em um tampão que permite a síntese de DNA e que permanece
enzimaticamente ativa à temperatura de desnaturação do DNA (meia-vida de 40
minutos à 94 - 95°C). A Taq DNA Polimerase é formada por uma única cadeia
polipeptídica com um peso molecular de 95 kD. Esta enzima tem máxima atividade à
temperaturas em torno de 75°C e pH 9. Uma unidade enzimática é definida como a
quantidade de enzima necessária para catalizar a incorporação de 10nmol de dNTP
durante 30min à 74°C.
2) o desenvolvimento do termo-ciclador programável permitiu o aquecimento e
resfriamento das amostras automaticamente e, deste modo, eliminou o trabalho tedioso
de ter de transferir os tubos entre blocos de aquecimento de diferentes temperaturas.
Os componentes necessários para a execução de uma reação de PCR são:
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· DNA fita molde a ser amplificado (DNA "template")
· DNA Polimerase
· dois oligonucleotídeos (primers) complementares às fitas opostas do DNA molde
· desoxirribonucleotídeos trifosfato (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
· tampão da DNA Polimerase (MgCl2, DTT)
A reação de PCR propriamente dita
A reação de PCR é baseada no fato de oligonucleotídeos (primers) hibridizarem especificamente a
uma fita molde de DNA. As três etapas contituintes de cada ciclo necessárias para a síntese de
qualquer DNA por PCR são:
1) Desnaturação: a fita dupla do DNA molde é termicamente desnaturada em suas fitas simples (94-
95°C - de 15segundos até 2minutos)
2) Anelamento: os primers (oligonucleotídeos) anelam por complementaridade às fitas do DNA
molde a uma temperatura mais baixa do que a utilizada na etapa anterior (40-60°C - de 30 até
60segundos)
3) Extensão (síntese): primers anelados ao DNA molde servem como ponto de partida para a DNA
Polimerase sintetizar uma fita complementar a uma das fitas do DNA molde incorporando os
dNTPs da mistura de reação. Ao término desta etapa são geradas cópias adicionais da seqüência do
DNA molde situada entre os dois primers. A temperatura para extensão é geralmente de 72°C (1-
2minutos)
Estes 3 ciclos são repetidos várias vezes e ao fim de cada ciclo ocorre a duplicação do número de
DNA fita dupla que havia no ciclo anterior. Isto é, há uma amplificação exponencial da seqüência
do DNA alvo: 2n (n=número de ciclos). Por exemplo: ao término de 20 ciclos haverá 220 (mais do
que 1 milhão) cópias da fita dupla do DNA molde. As quantidades dos primers são altas (em
excesso) o que faz com que a hibridização dos primers ao DNA molde ocorra em segundos. O ácido
nucléico amplificado pode então ser analisado (tamanho, quantidade, seqüência), ou utilizado em
protocolos experimentais posteriores (p.ex., clonagem).
Observação: A DNA Polimerase termo-estável utilizada em PCR utiliza fitas de DNA como molde
e, portanto, esta técnica é limitada à amplificação de DNA. Análises envolvendo a expressão
diferencial de genes durante o desenvolvimento ou a clonagem de cDNA a partir de mensagens
raras necessitam que o RNA seja primeiramente reversamente transcrito em um cDNA a fim de
fornecer uma fita molde de DNA molde necessária para a DNA Polimerase. Este processo é
conhecido por transcrição reversa (RT = Reverse Transcription) e o processo de amplificação
conhecido por RT-PCR.
Cuidados para evitar falsos-positivos
Contaminação com amplicons - cópias idênticas da seqüência nucleotídica do DNA molde - é o
problema mais sério e também o mais provável de ocorrer devido ao grande número de moléculas
de DNA produzidas por PCR.
As seguintes precauções devem ser tomadas a fim de evitar contaminação:
· utilizar material descartável
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· utilizar reagentes previamente aliquotados em lotes submetidos a um controle de qualidade
· utilizar pipetas automáticas (nunca pipetar com a boca)
· analisar os produtos da amplificação em uma área fisicamente separada da área onde reagentes e
amostras são preparadas.
Exemplos de aplicações
· Estudos básicos de estrutura e função gênica (produtos proteicos e suas funções celulares)
· Estudos genéticos e taxonômicos (marcadores moleculares ----> identificação de indivíduos)
· Controle de qualidade (a presença de um microorganismo que pode contaminar uma população
que produz determinado antibiótico)
· Diagnóstico molecular de doenças infecciosas e genéticas (TB, HIV, etc.)
· Melhoramento genético de animais, plantas e microorganismos
Exemplos práticos:
· Diagnóstico de Mycobacterium tuberculosis: a microscopia de escarro seguido pela cultura é o
método tradicional para o diagnóstico da tuberculose. No entanto, estes métodos bacteriológicos são
lentos e caros. Além disto, estes métodos apresentam baixa sensibilidade quando amostras clínicas
têm um pequeno número de organismos patogênicos. A seqüência de inserção IS6110 é específica
do complexo M. tuberculosis e está presente em diversas cópias tornansdo a IS6110 um alvo
excelente para a utilização da amplificação por PCR como método de diagnóstico.Análise do
produto de PCR por gel de agarose indica a presença deste patógeno. (IS são elementos genéticos
transponíveis que carregam apenas a informação genética essencial para transposição: seqüências
terminais de DNA específicas e a região codificante da transposase que reconhece tais seqüências.)
· Diagnóstico do vírus da AIDS (Human Immunodeficiency Virus type 1 - HIV-1) que é um dos
agentes etiológicos desta doença viral.
· Identificação de cepas de Staphylococcus aureus (Gram+) resistentes à meticilina é baseada na
amplificação por PCR do gene mecA que codifica a PBP-2' (Penicillin-Binding Protein) que não
está presente em cepas sensíveis aos antibióticos b-lactâmicos. PBPs são transpeptidases ou
carboxcipeptidases que participam da síntese de peptideoglicanos da parede celular.
Otimização da PCR
· [MgCl2+]
DNA "template", agentes quelantes na amostra (ex. EDTA), dNTPs e proteínas alteram a [Mg2+]
livre.
Ausência de [Mg2+] adequada: Taq DNA Polimerase é inativa.
Excesso de Mg2+ livre: redução da fidelidade enzimática e aumento de produtos não específicos.
Importante: determinar empiricamente [Mg2+] ótima para cada reação.
· Tampão
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Ausência de Triton X-100: pouca ou nenhuma atividade da Taq DNA Polimerase.
· [Enzima]
Recomendado: 1,25U da Taq DNA Polimerase em 50 µl de reação. Adicionando mais enzima não
altera o produto da PCR. Rastro de DNA em gel ("smearing")de agarose: tempo de extensão muito
longo e excesso de enzima ocasionam o aumento da probabilidade da atividade exonucleásica 5'----
>3' da Taq DNA Polimerase.
·
Desenho dos "primers"
Tamanho: 15 - 30 bases
Deve conter: ~ 40 - 60% G+C
Evitar: seqüências que produzam estruturas secundárias ex:
5' CCCCATTGGGG 3'
3'-ends não devem ser complementares a fim de evitar primer-dimers na reação de PCR
5' ATCGTAATGCGC 3'
5' CTAATTGCGCA 3'
____________________________________
5'ATCGTAATGCGC 3'
3'ACGCGTTAATC 5'
Tm similares dos primers: a temperatura de anelamento depende do primer com menor Tm.
·Solução do DNA "template"
Ao purificar DNA deve-se evitar os seguintes compostos pois são fortes inibidores da Taq DNA
Polimerase: sais, guanidina, proteases, solventes orgânicos e SDS.
· Quantidade de DNA
Dois erros muito comuns:
muito DNA plasmidial
muito pouco DNA genômico
Aconselha-se iniciar com mais do que 104 cópias do DNA "template"
(mas manter [DNA] < 10 ng/µl)
(1 µg de 1kb dsDNA = 9,12 x 1011 moléculas)