Técnicas em biologia molecular parte 2

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TÉCNICAS DE BIOLOGIA 
MOLECULAR
Técnicas de Biologia Molecular
• Manipulação e caracterização de ácidos nucléicos
• Isolamento e caracterização de proteínas
• purificação de proteínas
• separação de proteínas
• identificação de proteínas
• sequenciamento de proteínas
Todas essas técnicas estão baseadas em princípios fundamentais da fisiologia.
Colocar as técnicas
Purificação de proteínas
Por que é importante 
purificar proteínas?
In this chapter, we first review the basic structures and
properties of DNA and RNA. In the next several sections 
we discuss the basic processes summarized in Figure 4-1:
transcription of DNA into RNA precursors, processing of
these precursors to make functional RNA molecules, trans-
lation of mRNAs into proteins, and the replication of DNA.
Along the way we compare gene structure in prokaryotes
and eukaryotes and describe how bacteria control transcrip-
tion, setting the stage for the more complex eukaryotic 
transcription-control mechanisms discussed in Chapter 11.
After outlining the individual roles of mRNA, tRNA, and
rRNA in protein synthesis, we present a detailed description
of the components and biochemical steps in translation. We
also consider the molecular problems involved in DNA repli-
102 CHAPTER 4 • Basic Molecular Genetic Mechanisms
cation and the complex cellular machinery for ensuring ac-
curate copying of the genetic material. The final section of
the chapter presents basic information about viruses, which
are important model organisms for studying macromolecular
synthesis and other cellular processes.
Structure of Nucleic Acids
DNA and RNA are chemically very similar. The primary
structures of both are linear polymers composed of
monomers called nucleotides. Cellular RNAs range in length
from less than one hundred to many thousands of nu-
cleotides. Cellular DNA molecules can be as long as several
4.1
mRN A translation
mRN A
Ribosomal
subunits
Translation
factors
DN A
virus
tRN A
A m ino acids
Protein
A A A
A A
A A
A A
A
rRN A
RN A
processing
rNTPs
Transcription DN A
Replication
dNTPs
pre-m
RN
A
RN A
virus
4
1
2
3
Cytosol
Nucleolus
Nucleus
! FIGURE 4-1 Overview of four basic molecular genetic
processes. In this chapter we cover the three processes that 
lead to production of prote ins ( 1 – 3 ) and the process for 
replicating DNA ( 4 ). Because viruses utilize host-ce ll machinery,
they have been important mode ls for studying these processes.
During transcription of a prote in-coding gene by RNA polymerase
( 1 ), the four-base DNA code specifying the am ino acid sequence
of a prote in is copied into a precursor messenger RNA (pre-
mRNA) by the polymerization of ribonucleoside triphosphate
monomers (rNTPs). Removal of extraneous sequences and other
modifications to the pre-mRNA ( 2 ), collectively known as RNA 
processing, produce a functional mRNA, which is transported to the
cytoplasm. During translation ( 3 ), the four-base code of the mRNA is
decoded into the 20–amino acid “ language” of proteins. Ribosomes,
the macromolecular machines that translate the mRNA code, are
composed of two subunits assembled in the nucleolus from riboso-
mal RNAs (rRNAs) and multiple proteins (left ). After transport to the
cytoplasm, ribosomal subunits associate w ith an mRNA and carry
out protein synthesis w ith the help of transfer RNAs (tRNAs) and
various translation factors. During DNA replication (4 ), which occurs
only in cells preparing to divide, deoxyribonucleoside triphosphate
monomers (dNTPs) are polymerized to yield two identical copies of
each chromosomal DNA molecule. Each daughter cell receives one
of the identical copies.
Por que é importante purificar proteínas?
Quando pensamos em saúde: amostra pura e efeitos adversos
Mas quando pensamos em experimentos
A purificação de proteínas é fundamental para a compreensão de sua função. Embora em alguns momentos a função de 
uma proteína possa ser estudada em uma mistura complexa, esses estudos podem com frequência gerar ambiguidade. 
Por exemplo, o estudo de uma DNA-polimerase específica em uma mistura de proteínas totais, como um lisado celular, 
pode ser mascarado por outras DNA polimerases e outras proteínas acessórias parcial ou completamente responsáveis 
pelas atividades de síntese de DNA observadas. Assim, a purificação de proteínas é parte importante do entendimento 
de sua função.
Purificação de proteínas
• Como purificar proteínas?
O material ponto de partida para a purificação de proteínas pode ser uma cultura de células ou uma amostra de 
tecido
Vimos que para purificar ou sequenciar o DNA a técnica é uma só, já que diferentes moléculas de DNA 
apresentam a mesma estrutura helicoidal e são diferenciadas apenas por sua sequência. E no caso das 
proteínas, o método de purificação é único?
Não - as proteínas apresentam propriedades únicas que tornam sua purificação relativamente diferente.
Purificação de proteínas
• Como manipular uma amostra biológica para purificação de proteínas?
• Preparação de extratos ou lisados celulares: rompimento da membrana para 
liberacão da proteína
• detergentes
• forças físicas
• tratamento com baixas concentrações iônicas de sais
• alterações rápidas de pressão
Manipulação em baixas 
temperaturas (4oC)
Uma questão importante quando se fala em purificação de proteínas é como manipular essas amostras de forma a 
preservar a proteína que se quer purificar. Por que isso é importante? Ao contrário do DNA, que é muito resistente à 
temperatura, as proteínas são desnaturadas rapidamente em temperaturas moderadas, à medida que são liberadas das 
células.
Preparação de extratos ou lisados celulares
Cromatografia em coluna
• Método mais comum de purificação de proteínas
• A amostra atravessa colunas de vidro preenchidas com pequenas esferas de agarose 
ou acrilamida
• esferas modificadas de formas diferentes
• diferentes técnicas de separação
Cromatografia em coluna
Cromatografia de troca iônica
• separação de moléculas de proteína com base em cargas iônicas superficiais
• esferas modificadas por grupos químicos com cargas positivas ou negativas
Esferas carregadas negativamente
Interação forte com proteínas carregadas 
positivamente
Interação intermediária com proteínas com 
cargas positivas fracas
Sem interação com proteínas carregadas 
negativamente
Eluição ou “liberação” das esferas
Cromatografia em coluna
Cromatografia de filtração em gel
• separação de moléculas de proteína com base em tamanho e forma
• esferas com poros de tamanhos diferentes do início ao fim da coluna
Proteínas pequenas: penetram em todos 
os poros e assim percorrem um caminho 
maior na coluna - maior tempo para serem 
eluídas
Proteínas grandes: acesso limitado aos 
poros e eluição mais rápida
Amostras coletadas em diferentes tempos 
e avaliação da presença da proteína de 
interesse
Esferas: polímeros 
de carboidratos
Pequenas moléculas 
penetram nos poros 
das esferas
Grandes esferas não 
penetram nos poros 
e são liberadas mais 
rapidamente
Limitação da cromatografia por troca iônica e de filtração em gel: em geral é difícil separar uma proteína em uma única 
etapa cromatográfica, pois muitas moléculas diferentes podem “cair” na mesma fração. Assim, várias etapas 
cromatográficas são necessárias para resultar em uma fração que contém muitas moléculas de uma proteína 
especificada.
Cromatografia em coluna
Cromatografia de afinidade
• separação de moléculas de proteína com base em sua afinidade por alguma 
substância
• esferas ligadas a uma substância com afinidade pela proteína que se quer purificar
Depende do conhecimento de características específicas da proteína - afinidade por determinada substância. Como o 
métodose baseia em uma característica específica da proteína, a separação é mais rápida - não há necessidade de 
tantas etapas de purificação.
Cromatografia em coluna
Cromatografia de imunoafinidade
• separação de moléculas de proteína com base em sua ligação a um anticorpo 
específico
• esferas ligadas um anticorpo específico
Limitação: força da ligação antígeno-
anticorpo e necessidade de desnaturação 
da proteína para que seja eluída
!"
Purificação de proteínas
Modificações de proteínas para facilitar purificação
• adição de sequências extras de aminoácidos: “etiquetas peptídicas”
• extremidade N- ou C-terminal
• exemplos
Adição de 6 resíduos de histidina Níquel
Adição de epítopo conhecido
As etiquetas peptídicas criam propriedades conhecidas às proteínas modificadas, que podem ser utilizadas para sua 
purificação.
Os anticorpos podem ainda ser escolhidos para se ligarem com alta afinidade em uma determinada condição (por 
exemplo, ausência de cálcio), mas que sejam eluídos facilmente em uma segunda condição (como adição de pequenas 
concentrações de cálcio). Isso evita a necessidade de se utilizarem condições desnaturantes para a eluição. 
Imunoprecipitação
• Utilização do princípio de imunoafinidade para precipitação de proteínas
!"Esferas ligadas a anticorpos
Extrato de proteínas
Amostra 
Separação da proteína de 
interesse por precipitação
(esferas são mais pesadas)
!"
Separação de proteínas
• Gel de poliacrilamida - separação por tamanho
• Como contornar a influência da estrutura e da carga da proteína?
Tratamento com detergente forte 
(dodecil sulfato de sódio ou SDS)
Tratamento com agente redutor
(mercaptoetanol)
Aquecimento
Íons do SDS recobrem a 
proteína e conferem a ela carga 
negativa uniforme
Rompimento das pontes dissulfeto 
intra e intermoleculares (redução)
Comprometimento da 
estrutura terciária
Separação de proteínas
SDS Mercaptoetanol
-
-
- -
-
-
-
-
-
-
-
- -
-
-
-
-
-
- -
-
- -
- S S
SH
HS
SH-
-
-
-
-
-
-
- -
--
-
HS
-
- --
-
-
-
-
- -
-
-
-
-
----
-
-
Separação de proteínas
Amostra Tampão de 
amostra
Separação de proteínas
-
+
Separação de proteínas
-
+
S S
Separação de proteínas
Separação de proteínas
• Gel de poliacrilamida - visualização de proteínas
• corante azul brilhante de Comassie (ligação a proteínas)
Identificação de proteínas
• Como identificar uma proteína entre tantas outras?
Western blotting
100 KDa
75 KDa
A B C
Albumina sérica humana – 100 KDa
Proteína do capsídeo do HIV – 80 KDa
Western blotting
Placa metálica
Papel de filtro
Membrana PVDF
Gel SDS-PAGE
Placa metálica
Papel de filtro
-
+
• Transferência das proteínas para uma membrana
Western blotting
100 KDa
75 KDa
• Disposição das proteínas na membrana = disposição no gel
Western blotting
Proteína do capsídeo do HIV
Albumina sérica humana
IgG de humana anti-PCHIV IgG de coelho anti-IgG humana
Western blotting
Western blotting
M A B C