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MICROSCOPIA 
DE LUZ
Dra Shirley Rojas
La microscopía es la técnica de producir imágenes visibles de estructuras o detalles demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista.
Microscopio proviene del griego micrós, ‘pequeño’, y scopéo, ‘mirar’
Qué es Microscopía?
INTRODUCCIÓN
El ojo humano puede detectar diferentes longitudes de onda (colores) e intensidades de la luz visible, directamente o a través de instrumentos ópticos tales como el microscopio.
En la casi totalidad de los microscopios el material biológico debe ser examinado por transparencia, vale decir que la luz debe atravesar los tejidos para formar imágenes, por lo cual es necesario estudiar células aplanadas sobre la superficie de un vidrio, o finos cortes de tejidos lo suficientemente delgados como para ser atravesados por la radiación luminosa.
La baja absorción de luz de la célula viva se debe a su alto contenido de agua, pero aun después de desecada sus componentes presentan muy escaso contraste
Un método para contrarrestar esta limitación es emplear colorantes que tiñan selectivamente los distintos componentes celulares
Sin embargo, las técnicas de coloración tienen el inconveniente de que no se pueden utilizar en células vivas
Los tejidos en general deben ser fijados, deshidratados, embebidos en una sustancia endurecible (inclusón) y cortados en finas láminas antes de colorearlos; todos estos procedimientos son susceptibles de introducir cambios químicos y morfológicos. 
Inventado por Zacharias Janssen en 1590.
 En 1665 aparece en la obra de William Harvey sobre la circulación sanguínea al mirar al microscopio los capilares sanguíneos
En 1665 Robert Hooke observó con un microscopio un delgado corte de corcho y notó que el material era poroso, en su conjunto, formaban cavidades poco profundas a modo de celditas a las que llamó células. Se trataba de la primera observación de células muertas.
Un poco de HISTORIA
Unos años más tarde, Marcello Malpighi, anatomista y biólogo italiano, observó células vivas. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio.
Un poco de HISTORIA
A mediados del siglo XVII, Anton van Leeuwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricación propia, describió por primera vez protozoos, bacterias,
 espermatozoides y glóbulos rojos
Leeuwenhoek, sin ninguna preparación científica, puede considerarse el fundador de la bacteriología.
 Tallaba él mismo sus lupas, sobre pequeñas esferas de cristal, cuyos diámetros no alcanzaban el milímetro (su campo de visión era muy limitado, de décimas de milímetro). 
Con estas pequeñas distancias focales alcanzaba los 275 aumentos. 
Un poco de HISTORIA
Las mejoras más importantes de la óptica surgieron en 1877, cuando Ernst Abbe publicó su teoría del microscopio y mejoró la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos de 2000.
A principios de los años 1930 se había alcanzado el límite teórico para los microscopios ópticos, no consiguiendo estos aumentos superiores a 500X o 1,000X.
 Sin embargo, existía un deseo científico de observar los detalles de estructuras celulares (núcleo, mitocondria, etc.).
Un poco de HISTORIA
El microscopio electrónico de transmisión (TEM) fue el primer tipo de microscopio electrónico desarrollado. 
Utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de 100.000X. 
Fue desarrollado por Max Knoll y Ernst Ruska enAlemania en 1931.
 Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido.
Un poco de HISTORIA
TIPOS DE MICROSCOPIOS
Tipos de
microscopios
Microscopio
óptico
Microscopio
electrónico
Microscopio
Óptico Simple
Microscopio
Óptico
Compuesto
M.O. Normal
Campo oscuro
Contraste de fases
Interferencia
Fluorescencia
Confocal 
Polarización 
Transmisión
Barrido
Digital
Efecto túnel o cuántico
Lupa
Microscopía Óptica
Un microscopio óptico es un microscopio basado en lentes ópticas que nos permiten observar objetos de puequeño tamaño. 
Los microscopios de este tipo generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamaño original. El límite lo tienen en unas 2000 veces. 
Principio de funcionamiento
Las lentes de un microscopio óptico son el 
condensador, 
el objetivo y
 el ocular.
La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso.
El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular.
En el ocular se realiza el aumento final. 
PRINCIPIOS ÓPTICOS DE FUNCIONAMIENTO
Poder de resolución: es la capacidad del instrumento para dar imágenes individuales de puntos situados uno muy cerca del otro
Depende de:
La longitud de onda de la luz utilizada ( λ)
La apertura numérica del objetivo (AN)
 Límite de resolución: es la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para que puedan ser discriminados como tales, es:
	LR= 0,61 λ
		AN
Cuanto mayor sea el poder de resolución, mayor será la definición del objeto.
El poder de resolución es mayor cuanto menor es el límite de resolución (PR=1/LR)
AN= n. sen α
(n es el índice de refracción del medio y α es el semiangulo de apertura)
Seno no puede exceder de 1
El índice de refracción no excede de 1,6
El límite de resolución del microscopio no desciende de los 170nm(0,17μm) usando luz monocromática de  λ=400nm (violeta).
Con luz blanca, el límite resolutivo es de 250nm (0,25μm).
La resolución depende del sistema de lentes del microscopio, no del objeto que se está estudiando; en concreto depende de: 
Tamaño de la primera lente de aumento llamada Objetivo
Longitud de onda de la fuente de iluminación del objeto 
Índice de refracción (capacidad de desviación de la luz) del material que se encuentre entre la lente del objetivo y el especimen 
El límite de resolución disminuye (con lo que el Poder de Resolución aumenta) disminuyendo la longitud de onda (λ) de la fuente de iluminación, lo que puede conseguirse iluminando con luz ultravioleta o con haces de electrones.
El poder de resolución es mayor al aumentar el índice de refracción del medio que atraviesa la luz, y puede aumentarse haciendo que la luz atraviese un medio distinto al aire. 
El objetivo de aceite de inmersión se utiliza sumergido en un aceite especial que se coloca entre el porta y el objetivo. 
El índice de refracción de la luz es mayor en aceite (1,5) que en aire (1,0).
El poder de resolución de un microscopio aumenta considerablemente al utilizar como una fuente de iluminación de menos longitud de onda.
La calidad de la imagen depende de tres factores: 
Aumento
Contraste 
Resolución
Aunque el aumento es muy importante, no siempre es suficiente para que apreciemos los detalles de un objeto.
 Los dos factores que afectan a nuestra capacidad para ver una imagen de calidad son el contraste y la resolución.
El contraste 
Diferencia en la intensidad luminosa que nos permite diferenciar el objeto del fondo o apreciar distintas partes del mismo. 
Depende de la cantidad de luz absorbida por el objeto y la que es transmitida.
 Si un objeto y el medio inmediato que lo rodea transmitieran la misma cantidad de luz, la imagen del objeto no se distinguiría del fondo.
Algunos tipos de microscopios tienen dispositivos para aumentar el contraste (ej. Microscopio de contraste de fases, microscopio de campo oscuro).
MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO
El microscopio de campo claro lleva la fuente de luz incorporada en la base. 
La luz pasa a través de un filtro azul que elimina longitudes de onda largas y entra en el condensador.
 El condensador hace incidir la luz en el espécimen que absorbe parte de la luz.
La luz transmitida por el espécimen entra en el Objetivo y forma la primera imagen
en el tubo del microscopio. 
Posteriormente el Ocular aumenta la imagen y la proyecta en la última lente de la serie, la de nuestro ojo.
PARTES DEL MO
PARTE MECÁNICA QUE SE PUEDE DESMONTAR
Estativo
Oculares
Objetivos
Condensador
Cabezal
Tornillos de la platina
SISTEMA DE SOPORTE O ESTATIVO
Píe
Brazo
Tubo
Platina
SISTEMA DE AJUSTE
Anillo de ajuste de los oculares
Tornillo que permite mover el cabezal
Tornillos reguladores de la platina
Tornillos del condensador
Palanca de cierre del diafragma
SISTEMA DE ENFOQUE
Tornillo micrométrico
Tornillo macrométrico
Freno
PLATINA
Escala
Pinza
PARTE ÓPTICA
Lentes: 
Oculares
Objetivos
Sistema de iluminación:
Condensador
Diafragma
Fuente de luz
SISTEMA DE ILUMINACIÓN:
 FUENTE DE LUZ
Suele ser una lámpara halógena de intensidad graduable
Se enciende y apaga con un interruptor
En el exterior puede tener un filtro
Interruptor y graduación de la luz
Lámpara
Filtro
CONDENSADOR Y DIAFRAGMA
Condensador
Concentra la luz de la lámpara en un punto de la preparación
Diafragma o iris 
Está dentro del condensador, si se cierra mejora el contraste, pero empeora la resolución
LENTES: OBJETIVOS
Están colocados en el revolver
Tienen un sistema de amortiguación
Un anillo coloreado indica los aumentos
Son de 4, 10, 40 y 100 (inmersión) aumentos
OBJETIVOS
Azul
40x
Amarillo
10x
Rojo
4x
Blanco
100x
Amortiguación
LENTES: OCULARES
Ajuste de la distancia interpupilar
Oculares
ACEITE DE INMERSIÓN
Hoy no son de madera de cedro, sino sintéticos
Los hay de baja, media y alta viscosidad
Su empleo es imprescindible con el objetivo de inmersión (100x)
Por Qué?
Para controlar la refracción de la luz…