APOSTILA CICLO DE MICOLCOGIA E MICROBIOLOGIA VETERINÁRIA

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Instituto de Biociências – IBB 
 
Departamento de Microbiologia e Imunologia 
 
 
Disciplina de Microbiologia Veterinária 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aluno (a): _________________________________ 
 
 
 
Botucatu –2012 
ROTEIROS PARA AS AULAS PRÁTICAS 
CICLO DE MICOLOGIA 
– MEDICINA VETERINÁRIA – 
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CICLO DE MICOLOGIA 
 
ASPECTOS GERAIS DA CARACTERIZAÇÃO 
MACROSCÓPICA DAS COLÔNIAS FÚNGICAS 
 
 A cultura de um microrganismo refere-se à capacidade que este 
tem de crescer em meios nutritivos artificiais. Esse crescimento é 
evidenciado macroscopicamente pela formação de uma unidade 
estrutural, denominada colônia. 
 As colônias de determinados fungos geralmente apresentam 
morfologias típicas, quando estes são semeados em meios com a 
mesma composição química e submetidos às mesmas condições de 
incubação. Através dos seus aspectos macro-estruturais de uma colônia, 
é possível sugerir a espécie fúngica presente na cultura. Sendo assim, o 
conhecimento do aspecto macro-morfológico das colônias é de extrema 
utilidade para a sugestão da identificação preliminar de determinada 
espécie fúngica. 
 Na observação das características culturais de determinado fungo, 
devemos ressaltar os seguintes aspectos, segundo proposto por SIDRIM, 
JJC, BRILHANTE, RSN, ROCHA, MFG. (Cap. 8 - Aspectos Gerais de 
fungos filamentosos e dimórficos na apresentação filamentosa. In: 
SIDRIM, JJC, ROCHA, MFG. Micologia Médica ‘a luz de autores 
contemporâneos. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2004, p. 83-86), 
com algumas modificações: 
a) tamanho da colônia: pode ser bastante variável na dependência da 
quantidade e qualidade de substrato ofertado e da espécie fúngica. 
Por exemplo, os fungos zigomicetos apresentam velocidade de 
crescimento rápido e suas colônias tendem a ocupar toda a superfície 
da placa. O mesmo ocorre com as espécies do gênero Aspergillus 
quando cultivadas a 35oC. Já o fungo Piedraia hortae apresenta 
crescimento muito lento, sendo sua colônia restrita ao centro da placa 
de Petri. 
b) bordas: na periferia das colônias fúngicas podem ser observados 
muitos desenhos que vão desde morfologias bem delimitadas até 
achados de projeções irregulares que lembram franjas. Além disso, 
também pode ser observada, nas bordas das colônias uma variação 
da coloração em relação ao centro. Esse achado é peça-chave para 
indicar o possível patógeno implicado, como por exemplo, nas 
colônias de Sporothrix schenckii, onde se observa que as bordas 
tornam-se escuras com o envelhecimento da cultura. 
c) textura: é a característica mais importante utilizada na caracterização 
de uma colônia fúngica. A textura descreve a altura das hifas aéreas. 
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As colônias podem ser classificadas quanto à textura em diversos 
tipos: 
colônias algodonosas: aquelas que se assemelham com 
algodão, 
colônias furfuráceas: aquelas que lembram um punhado de 
substância farinácea espalhada em uma 
superfície, 
colônias penugentas: aquelas nas quais se evidenciam 
estruturas que lembram penas de aves 
dispersas na superfície do meio, 
colônias arenosas ou pulverulentas: aquelas que lembram areia 
de praia, 
colônias veludosas: aquelas que apresentam o aspecto de tecido 
aveludado, 
colônias membranosas: aquelas que são bem aderidas à 
superfície do meio de cultura, recobrindo-o 
como uma película, 
colônias glabrosas: aquelas com aspecto compacto, coriáceo, 
podendo ter superfície lisa ou irregular e 
sempre com ausência de filamento, ou seja, 
não algodonosa, 
colônias cremosas: aquelas que apresentam aspecto visual 
cremoso, sendo comumente observados no 
grupo das leveduras e da maioria das colônias 
bacterianas. 
d) relevo: diz respeito à topografia da colônia e pode ser: 
colônias cerebriformes: apresentam topografia de altos e baixos, 
fazendo circunvoluções que lembram as 
observadas no cérebro, 
colônias rugosas: nada mais são do que variações da 
cerebriforme, porém as pregas 
topográficas são menos evidentes, sendo 
as vezes radiais partindo do centro da 
colônia, 
colônias apiculadas: caracterizam-se pela presença de uma 
saliência na parte central lembrando um 
pequeno cume, 
colônias crateriformes: são aquelas que se aprofundam no meio 
de cultura, assumindo o aspecto de cratera. 
e) pigmentação: quando se fala em pigmentação de uma colônia 
fúngica deve-se levar em consideração alguns aspectos primários: 
 - se o pigmento é encontrado na superfície da colônia ou no 
reverso, 
- se o pigmento é encontrado tanto na superfície quanto no reverso 
da colônia, 
 - se o pigmento é ou não difusível no meio de cultura, 
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- se o pigmento está presente apenas nos esporos e ausente nas hifas, 
como observado na maioria das espécies de Aspergillus e Penicillium, ou 
em ambos (hifa e esporos), como observado nas espécies de fungos 
causadores de cromoblastomicose (Ex. Fonsecae pedrosoi). 
 Observa-se uma grande variedade de cores na pigmentação 
fúngica que passam pelos tons de verde, amarelo, vermelho e castanho 
até ao preto. 
 
 Portanto, a caracterização de uma colônia visando a auxiliar a 
identificação de determinada espécie fúngica, nada mais é do que um 
conjunto de características subjetivas, de expressão fenotípica, 
encontradas em determinada espécie. Dessa forma, deve-se sempre ter 
em mente que, embora a colônia fúngica possa sugerir, indicar e muitas 
vezes até acertar o caminho da identificação, não se deve, contudo, 
considera-la como única ou principal forma de identificação fúngica. 
Quando empregada como único critério pode levar a diagnósticos pouco 
precisos ou errôneos. 
 
 
PRÁTICA 1 – CARACTERÍSTICAS GERAIS 
DOS FUNGOS 
 
 
EXERCÍCIO 1 – ASPECTOS MACROSCÓPICOS DE CULTURAS 
DE FUNGOS LEVEDURIFORME E FILAMENTOSO 
 
a) finalidade: auxiliar na identificação das colônias fúngicas. 
 
b) fundamento: As colônias de determinados microrganismos 
geralmente apresentam morfologias típicas, quando estes são 
semeados em meios com a mesma composição química e submetidos 
às mesmas condições de incubação. Através do aspecto macro-
morfológico da colônia é possível sugerir a espécie fúngica presente 
na cultura. Entretanto, antes de se determinar as características da 
cultura de determinada colônia, é preciso certificar-se de que a cultura 
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está pura, ou seja, não deve ser evidenciada a presença de outros 
microrganismos através da observação de colônias diferentes em uma 
mesma placa ou tubo. Os estudos macroscópicos devem ser 
baseados nas seguintes características: tamanho, bordas, textura, 
relevo (no verso e reverso da colônia) e pigmentação. 
 
Exemplo: 
Frente: colônia de fungo (Filamentoso ou Leveduriforme), de 
textura (algodonosa, aveludada, pulverulenta, glabra, cremosa, 
etc), de relevo (cerebriforme, rugoso, crateriforme, apiculado, 
liso) de coloração (...), com bordos (regulares ou irregulares). 
Verso: (presença ou ausência) de fendas ou dobras, coloração 
(...), e (ausência ou presença) de pigmento difusível no meio de 
cultura. 
 
Descrever as características coloniais das culturas de Aspergillus sp. e 
Sacharomyces sp., conforme o modelo que segue. 
 
����Aspergillus sp. 
 
 
 
 
 
 
����Saccharomyces sp. 
 
 
 
 
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EXERCÍCIO 2 - ASPECTOS MICROSCÓPICOS DAS CULTURAS 
DE FUNGOS -COLORAÇÃO COM LACTOFENOL AZUL 
ALGODÃO 
 
a) finalidade: O método de coloração com Lactofenol Azul Algodão é 
usado para preparar exame microscópico de colônias de fungos. É 
uma técnica que tem a finalidade de visualizar o micélio vegetativo 
e reprodutor de um fungo filamentoso, como também as 
características da célula vegetativa e reprodução por brotamento 
de leveduras. 
 
b) técnica: 
 
1. Colocar uma gota de lactofenolazul-algodão sobre a lâmina. 
2. Retirar pequeno fragmento da cultura de bolor ou uma 
alíquota da cultura de levedura, utilizando alça ou fio de 
platina. 
3. Colocar o fragmento da cultura ou a alíquota de levedura 
sobre a gota de lactofenol.e homogeneizar. 
4. Cobrir com lamínula e examinar ao microscópio nas objetivas 
de 10 e 40 vezes. 
 
Desenhar as estruturas observadas: 
 
 Aspergillus sp. Saccharomyces sp. 
 
 
 
 
 
 
 
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c) interpretação 
 
Na coloração com lactofenol azul algodão é possível observar que 
existem dois tipos morfológicos de fungos: as leveduras e os filamentos 
(bolores ou micélios). 
As leveduras são unicelulares e podem ter diferentes formatos (oval, 
circular, naveta, etc) e se reproduzem por brotamento (únicos ou 
múltiplos) ou por fissão (mais raro). 
Os bolores são fungos filamentosos possuindo hifas septadas ou 
cenocíticas. Na sua reprodução assexuada, é possível visualizar no 
micélio vegetativo os clamidósporos e artrósporos, e no micélio 
reprodutor, os esporos endógenos (esporangiósporos) em esporângios 
(estrutura fechada) e esporos exógenos (conidiósporos, também 
denominados simplesmente conídios ou conídias) em conidióforos. 
A vantagem desta técnica é de ser fácil e rápida a sua preparação, e 
a desvantagem é que em muitos fungos não se observa os órgãos de 
frutificação. 
 
 
CULTURA EM LÂMINA PARA FUNGOS FILAMENTOSOS 
(MICROCULTIVO) 
 
a) finalidade: Utiliza-se este método quando se deseja evidenciar, com o 
mínimo de deterioração, o arranjo das estruturas de frutificação e 
ornamentação para estudo morfológico detalhado. 
 
b) fundamento: Essa técnica é amplamente empregada para a 
confecção de lâminas de boa qualidade para fungos filamentosos. 
Consiste no preparo de placas de Petri contendo lâminas, as quais 
são apoiadas em um pequeno bastão de vidro e, após esterilização, 
coloca-se um bloco de 1-2 cm3 de meio de cultura que servirá de 
substrato para o crescimento fúngico. A cultura cresce ao redor do 
bloco de Agar e também adere à lâmina e lamínula. Essa placa é 
incubada à temperatura ambiente até o aparecimento visual evidente 
do crescimento fúngico sob a lamínula. Se o micologista julgar 
necessário, antes de desmontar a preparação, pode-se fazer a 
observação da placa, em microscópio de campo claro em pequeno 
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aumento ou em estereomicroscópio, para se certificar que as 
estruturas de frutificação e ornamentação foram produzidas, caso 
contrário, aguarda-se mais alguns dias até que as mesmas sejam 
obtidas. Dessa maneira o micologista ganha tempo por não ter que 
refazer a técnica novamente, o que ocorre quando a placa é 
desmontada antes do tempo requerido pelo fungo para que as 
estruturas que auxiliarão na sua identificação sejam produzidas. A 
observação final se faz como descrito no item anterior sobre o 
preparo de lâmina com latofenol-azul-algodão. 
 
c) material: 
- Placas de Petri com lâminas dispostas sobre bastão de vidro em 
“U” ou “V”, esterilizadas; 
 - Lamínulas; 
 - meio de cultura; 
 - lâmina e cabo de bisturi; 
 - pinça; 
 - alça de platina; 
 - Água destilada esterilizada; 
 - Algodão; 
 - rolinho de filme plástico; 
 - Formol; 
 - pipeta; 
 - Lactofenol-azul-algodão; 
 - Culturas fúngicas 
 
d) técnica - Método de Riddel (Ridell RW. Permanent stained 
mycological preparations obtained by slide culture. Mycol 1950; 
42:265-270). 
 
1. Cortar o meio de cultura, com auxílio de lâmina de bisturi estéril, 
em pequenos fragmentos (± 1 cm2); 
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2. Colocar, com assepsia, um bloco do meio de cultura sobre a 
lâmina esterilizada; 
 3. Semear o fungo em cada lado do bloco do meio de cultura; 
4. Colocar uma lamínula limpa e previamente flambada sobre o 
referido meio; 
5. Adicionar, à placa, algodão embebido em água destilada estéril, 
a fim de manter a umidade no meio; 
 6. vedar a placa com filme plástico; 
7. Incubar a temperatura ambiente e observar diariamente o 
crescimento; 
8. Quando houver desenvolvimento satisfatório, submeter à ação 
do formol (adicionar 1,0 mL sobre o algodão e deixar agir por 1 
hora); 
 9. Retirar a lamínula e o fragmento do meio; 
10. Corar a lâmina, colocando-se uma gota de lactofenol-azul- 
algodão; 
 11. Depositar a lamínula e fechar com esmalte; 
 12. Observar ao microscópio os órgãos de frutificação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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PRÁTICA 2 – LEVEDURAS DE IMPORTÂNCIA EM 
MEDICINA VETERINÁRIA 
 
 
1 – Descrever as características coloniais de Cryptococcus neoformans 
cultivado em agar Sabouraud (SAB) e Agar Semente de Niger (NSA). 
Observar as características microscópicas de esfregaço de cultura 
corado pelo Nankin. 
 
����Cryptococcus neoformans (cultivado em Agar Sabouraud) 
 
 
 
 
 
����Cryptococcus neoformans (cultivado em Agar Semente de Niger) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 coloração pela tinta da China (Nankin) 
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2 – Diferenciação entre C. neoformans e C. gattii pelo método de CGB 
(Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol) 
 
Teste CGB positivo Teste CGB negativo 
 
Cor:____________________ Cor: _________________ 
Espécie: ________________ Espécie: ______________ 
 
3 - Descrever as características coloniais, observar e desenhar as 
estruturas microscópicas de Candida spp. 
 
����Candida spp. 
 
 
 
 
 
 
 
4 - Diferenciação de Candida albicans de outras espécies de Candida 
pelo método de CHROMagar-Candida®. Observar o crescimento das 
colônias e diferenciar pela coloração: 
Candida albicans – cor:_______________________ 
Candida tropicalis – cor:_______________________ 
Candida spp. – cor: __________________________ 
 
 
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5 - Descrever as características coloniais, observar e desenhar as 
estruturas microscópicas de Malassezia pachydermatis e Trichosporon 
asahii: 
 
���� Malassezia pachydermatis 
 
 
 
 
 
 
 
���� Trichosporon asahii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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PRÁTICA 3 – FUNGOS CAUSADORES DE 
MICOSES CUTÂNEAS - DERMATÓFITOS 
 
 
EXERCÍCIO 1 - CULTURA DE PÊLOS DE ANIMAIS SUSPEITOS DE 
DERMATOFITOSE EM PLACAS DE AGAR MYCOSEL® (MYC) e 
SABOURAUD (SAB) 
 
a) Finalidade: esta técnica é utilizada para pesquisar fungos 
causadores de micoses cutâneas, presentes nos pêlos, escamas 
de pele e unhas de humanos e animais. 
 
b) Coleta do Material Clínico 
 
1. Pêlos: com auxílio de pinça estéril, coletar os pêlos da área 
afetada, preferencialmente pelas bordas da lesão, e 
acondicioná-los em placas de Petri estéril; 
 
2. Pele: com auxílio de lâmina de bisturi estéril, fazer raspado de 
pele da área afetada, preferencialmente dos bordos da lesão, e 
acondicionar o material em placas de Petri estéril; 
 
3. Unhas: com auxílio de lâmina de bisturi estéril, espátula ou 
punch, coletar amostra da porção interior da lesão e 
acondicioná-la em placa de Petri estéril. 
 
c) Processamento Laboratorial do Material Clínico 
 
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1. Abrir cuidadosamente a placa de Petri próximo ao bico de 
Bunsen, 
 
2. Com o auxílio de uma pinça ou alça estéril, colocar a amostra 
em contato com o meio de cultura MYC e SAB, 
 
3. Identificar corretamente as placas com o número da amostra, 
meio de cultura e data, 
 
4. Vedar as placas com filme plástico, 
 
5. Incubar as placas em estufa à 25ºC, por um período de 7-10 
dias. 
 
d) Interpretação 
 
Observar as placas semeadas com os pêlos e verificar se houve o 
crescimento de fungos dermatófitos. Selecione uma colônia isolada 
em MYC e outra em SAB e faça a descriçãomacroscópica no 
quadro abaixo. 
 
MYC SAB 
 
 
 
 
 
 
 
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 Prepare lâminas coradas com LFAA das culturas selecionadas e 
observe ao microscópio. Desenhe as estruturas observadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MYC SAB 
 
Resultado: _________________________________________________ 
 
 
EXERCÍCIO 2 - DESCREVER AS CARACTERÍSITICAS 
MACROSCÓPICAS DAS CULTURAS 
 
���� Microsporum canis 
 
 
 
 
 
 
���� Microsporum gypseum 
 
 
 
 
 
 
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���� Trichophyton mentagrophytes 
 
 
 
 
 
 
���� Epidermophyton flocosum 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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PRÁTICA 4 – FUNGOS CAUSADORES DE 
MICOSES SUBCUTÂNEAS 
 
1. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as 
estruturas microscópicas dos seguintes fungos: 
 
����Sporothrix spp. (Fase Micelial) 
 
 
 
 
 
 
���� Sporothrix spp. (Fase Leveduriforme) 
 
 
 
 
 
 
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���� Pythium insidosum 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Coloração com LFAA produção de esporângio em 
material vegetal 
 
 
EXERCÍCIO 3 - OBSERVAR A PREPARAÇÃO HISTOLÓGICA, 
CORADA COM PRATA, DE LESÃO DE PACEINTE COM LACAZIOSE. 
DESENHE AS ESTRUTURAS VISUALIZADAS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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PRÁTICA 5 – FUNGOS CAUSADORES DE 
MICOSES SISTÊMICAS 
 
1. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as 
estruturas microscópicas dos seguintes fungos: 
 
����Paracoccidiodies brasiliensis (Fase Micelial) 
 
 
 
 
 
���� Paracoccidiodies brasiliensis (Fase Leveduriforme) 
 
 
 
 
 
����Histoplasma capsulatum (Fase Micelial) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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���� Histoplasma capsulatum (Fase Leveduriforme) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Você já agradeceu aos fungos hoje?!