Aula Citometria de Fluxo - Adriana Fontes

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNABUCO 
DEPARTAMENTO DE BIOFÍSICA E RADIOBIOLOGIA 
Adriana Fontes 
 
FLUORESCÊNCIA 
O que é fluorescência? 
 
 
emissão 
absorção 
George G. Stokes - Stokes shift 
↓λ	
   ↑λ	
  
E	
  =	
  hf	
  =	
  hc/	
  λ	
  
↓λ	
   ↑λ	
  
Adriana Fontes 
Departamento de Biofísica e Radiobiologia - UFPE 
e-mail: adriana.fontes.biofisica@gmail.com 
Máximo de Absorção e Emissão 
 
 
Ex.: FITC (λabsorção= 400 a 550 e pico em 490 nm e λemissão = 475 a 700 nm e pico em 525 nm 
Laser 488 nm 
(Argônio) 
Pico 
525 nm 
Filtro Ideal: 
Verde 
Pico 
490 nm 
FLUORESCÊNCIA 
 
 
 
- Fluorescência natural - auto-fluorescentes (cristais e clorofila). 
 
-Fluorescência secundária - tratados com fluoróforos (corantes, proteínas fluorescentes, 
nanopartículas). 
Corantes orgânicos 
 
Fluoresceína 
Alexa 
DAPI 
Iodeto de Propídeo 
Rodamina 123, entre outros… 
Proteínas Fluorescentes 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(Genética) 
Nanopartículas 
(Pontos Quânticos) 
CORANTES OU MARCADORES FLUORESCENTES 
TÉCNICAS BASEADAS EM FLUORESCÊNCIA 
O princípio básico das técnicas baseadas em fluorescência é jogar luz na 
amostra permitindo que essa amostra fluoresça e então separar o sinal fraco 
de emissão do sinal forte da luz usada na excitação. Apenas a luz emitida 
pela amostra deve chegar no olho ou no detector. 
FILTROS 
A detecção é controlada por meio de filtros ópticos, que bloqueiam certos 
comprimentos de onda e permitem a transmissão de outros (passagem). 
CITOMETRIA DE FLUXO 
- APLICABILIDADE - 
IMUNOFENOTIPAGEM 
Cell 
Sorting 
 
ANÁLISE DE 
CICLO 
CELULAR 
PROLIFERAÇÃO 
CELULAR 
Linfócitos 
Monócitos 
Neutrófilos 
Fluxo de Ca+2 
intracelular 
VIABILIDADE/
APOPTOSE 
IDENTIFICAÇÃO DE DIFERENTES 
CÉLULAS SANGUÍNEAS 
Citômetros de Fluxo 
-Fabricantes de citômetros de fluxo com representantes no Brasil: 
Beckman-­‐Coulter	
   Cytoma1on	
  
Cell Sorter 
Clínica 
Pesquisa 
Citômetros de Fluxo Becton	
  Dickinson	
  
Citômetros de Fluxo Becton	
  Dickinson	
  
Citômetros de Fluxo Becton	
  Dickinson	
  
FLUXO	
  METRIA	
  CITO	
  
O que é Citometria de Fluxo? 
Célula	
   Medir	
   Movimento	
  
A	
  citometria	
  de	
  fluxo	
  é	
  uma	
  técnica	
  mul1paramétrica	
  que	
  permite	
  uma	
  análise	
  rápida,	
  
obje1va,	
  qualita1va	
  e	
  quan1ta1va	
  de	
  células	
  ou	
  parAculas	
  microscópicas,	
  com	
  tamanhos	
  
de	
  0,2	
  a	
  150	
  µm,	
  suspensas	
  em	
  meio	
  líquido	
  sob	
  um	
  fluxo	
  conAnuo.	
  	
  
SISTEMA	
  DE	
  FLUXO	
  
SISTEMA	
  ÓPTICO	
  
SISTEMA	
  ELETRÔNICO	
  12	
  
µm	
  
8	
  µm	
  
14	
  
µm	
  
6	
  µm	
  
0,5	
  
µm	
  
Componentes do Citômetro de Fluxo 
SISTEMA	
  DE	
  FLUXO	
  
SISTEMA	
  ÓPTICO	
  
SISTEMA	
  
ELETRÔNICO	
  
Aspira	
  e	
   transporta	
   células	
  uma	
  a	
  uma	
  com	
  o	
  auxílio	
  de	
  um	
  
líquido	
   na	
   câmara	
   de	
   fluxo	
   ou	
   “flow	
   cell”	
   para	
   que	
   sejam	
  
posicionadas	
  no	
  centro	
  de	
  um	
  feixe	
  de	
  laser.	
  
Fonte	
  de	
  luz	
  que	
  ao	
  interagir	
  com	
  a	
  célula	
  sofre	
  espalhamento,	
  podendo	
  gerar	
  
fluorescência,	
   que	
   serão	
   coletados	
   por	
   um	
   conjunto	
   de	
   filtros	
   e	
   detectores	
  
óp1cos.	
  
Conversão	
  dos	
  sinais	
  óp1cos	
  →	
  eletrônicos	
  
SISTEMA DE FLUXO 
Canal	
  Central	
  
Solução	
  
Salina	
  
O	
   sistema	
   fluídico	
   cons1tuído	
   por	
   uma	
   câmara	
  
de	
   fluxo	
  que	
   aspira	
   a	
   amostra	
   e	
   gera	
   um	
  fluxo	
  
con.nuo	
  laminar	
  de	
  parAculas,	
  que	
  passam	
  uma	
  
a	
  uma	
  frente	
  a	
  um	
  feixe	
  de	
  laser. 	
  
Fluxo	
  laminar	
  
célula	
  a	
  célula	
  
Diâmetro	
  do	
  oriEcio:	
  
50	
  a	
  250	
  μm	
  	
  
	
  
FEIXE	
  DE	
  LASER	
  
SISTEMA ÓPTICO 
O	
  sistema	
  óp1co	
  gera	
  e	
  coleta	
  os	
  sinais	
  de	
  luz.	
  
	
  
	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Laser	
  
	
  
	
  
Dispersão	
  Frontal,	
  Dispersão	
  Lateral	
  
e	
  Fluorescência	
  
FONTE	
  DE	
  LUZ	
  
FILTROS,	
  DETECTORES...	
  
FL1	
  
FL2	
  
FL3	
  
FL4	
  
FSC	
  
SSC	
  
SISTEMA ÓPTICO 
FSC	
  
SSC	
  
FLUORESCÊNCIA	
  
Câmara	
  de	
  
Fluxo	
  
Propriedades	
  	
  
Físicas	
  
Propriedades	
  	
  
Bioquímicas	
  
Feixe	
  de	
  Luz	
  
Forward	
  Sca\er	
  Channel	
  
Side	
  Sca\er	
  Channel	
  
Forward	
  Sca4er	
  Channel	
  (FSC)	
  X	
  Side	
  Sca4er	
  Channel	
  (SSC)	
  
Neutrófilo	
  
Monócito	
  
Linfócito	
  
FSC	
   e	
   SSC	
   são	
   únicos	
   para	
   cada	
   célula,	
   e	
   uma	
   combinação	
   dos	
   dois	
   pode	
   ser	
   usada	
   para	
  
diferenciar	
  diferentes	
  Ppos	
  celulares	
  em	
  uma	
  amostra	
  heterogênea.	
  
Absorção 
Emissão 
Gates e Regiões 
Um	
   princípio	
   importante	
   da	
   citometria	
   de	
   fluxo	
   para	
   a	
   análise	
   de	
   dados	
   é	
   selecionar	
  
populações	
  de	
  interesse	
  e	
  eliminar	
  populações	
  indesejadas.	
  
Um parâmetro 
HISTOGRAMA 
População 
marcada 
População 
não-marcada 
Dois parâmetros 
A citometria de fluxo pode ser realizada em amostras marcadas com até 17 marcadores 
fluorescentes simultaneamente. Assim, uma única experiência pode gerar um grande 
conjunto de dados para análises, usando vários histogramas de dois parâmetros. 
Aplicações em Imunofenotipagem 
• A aplicação em laboratórios clínicos mais 
comum real izada no c i tômetro é a 
Imunofenotipagem. 
• Geralmente, a análise da expressão 
antigênica das células é através da interação 
antígeno-anticorpo marcado. 
• É útil no diagnóstico e monitoramento de 
terapias de doenças malignas hematológicas, 
tais como leucemia e linfomas. 
Aplicações em Imunofenotipagem 
Paciente Normal 
Paciente com Leucemia 
Hemácias	
  A2	
  
68%	
  
Hemácias	
  A3	
  
11%	
  
Hemácias	
  Ax	
  e	
  Ael	
  
5%	
  
Hemácias	
  A1	
  
97%	
  
NPs HeLa HeLa 
U87 
DBTRG 
É possível separar diferentes tipos de células? 
 
Cell sorting	
  
Separação eletrostática 
Aplicações em Reprodução Assistida 
•  Determinação	
  do	
  sexo	
  fetal	
  
•  IdenPficação	
  e	
  exclusão	
  de	
  gametas	
  danificados	
  
•  Discriminação	
   entre	
   espermatozóides	
   carregando	
  
cromossomos	
  X	
  ou	
  Y,	
  e	
  separação