Eletroforese Gel de Agarose e Acrilamida (Adriana Vieira)

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Aula 3: Eletroforese
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do grego elektronphorese (conduzida pela eletricidade), refere-se ao deslocamento de biomoléculas numa matriz sólida (agarose ou acrilamida) pela ação de um campo elétrico.
O foco principal da técnica é separar os fragmentos por tamanho
ELETROFORESE
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MATRIZES 
Matriz ou gel é o meio sólido onde ocorre a separação das biomoléculas. 
 AGAROSE
ACRILAMIDA  
Formar tramas de poros de tamanhos variáveis, possibilitando a separação dos fragmentos, que terá sua eficiência dependente da concentração do polímero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicada.
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 Agarose: polissacarídeo derivado do ágar que apresenta baixa carga elétrica. 
Ágar: Polímero de dextranas.
Agarose: ágar purificado de algas.
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Agarose:
Polissacarídeo em forma de pó. 
Quando suspenso em solução aquosa e aquecido dissolve-se completamente, solidificando-se vagarosamente conforme a temperatura cai.
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O tamanho das moléculas vão influenciar na concentração do gel, que por sua vez, interfere na porosidade do gel. 
·A porosidade do gel está relacionada com a concentração do componente utilizado.  
·Quanto maior for a concentração do gel, menor a sua porosidade.
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COMO PREPARAR UM GEL DE AGAROSE???
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Tampão da amostra 
1 Agente espessante (ficol,sacarose, glicose)
2 Corante (azul de bromofenol e xileno cianol) 
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PORQUE O DNA MIGRA DO CÁTODO PARA O ÂNODO???
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Eletroforese
Cargas elétricas
Grupamentos com cargas elétricas;
Proteínas e Ácidos nucléicos;
Grupo -NH2 e grupo –COOH;
pH;
DDP
as cargas positivas são atraídas pelo pólo negativo e as cargas negativas, pelo pólo positivo, deslocando-se em direção a eles; 
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Estrutura do DNA
	
	Nucleotídeo: 
	Base nitrogenada: 
		Purinas: 		 adenina (A)/guanina (G). 
		Pirimidinas: 	 citosina (C)/timina (T).
 Açúcar desoxirribose.
	Resíduo fosfato.
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+
Os ácidos nucléicos migram para o pólo positivo 
Amostras de DNA
Gel de agarose
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+
Fragmentos menores migram a frente... 
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+
Carga elétrica superficial também influência na migração 
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+
Fragmentos mais leves também migram a frente 
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O menor sempre ganha!!!
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concentração do gel X intervalo de separação
Agarose (%)	 intervalo ótimo de separação (Kb) 
 0,3			 60 -5,0
 0,6			 20 -1,0
 0,7		 	 10 -0,8
 0,9			 7- 0,5
 1,2			 6-0,4
 1,5			 3-0,2
 2,0			 2-0,1
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	Métodos de Detecção
Brometo de etídeo 
(Estoque 10mg/mL – conc.final 0,5g/mL)
Intercalante no DNA
DNA – absorve luz UV 250 - 270nm
DNA + EtBr – absorve luz UV 300nm
EtBr – absorve luz visível 590nm (vermelho alaranjado)
DNA + EtBr – emite 10X mais que somente EtBr
*Comprimentos de ondas muito altos 
 podem ocasionar quebras e/ou
Dimerização do DNA
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VISUALIZANDO O DNA ATRAVÉS
DO BROMETO DE ETÍDIO
Brometo de Etídio (EtBr) é um agente intercalante amplamente utilizado para visualizar todas as formas de fragmentos de DNA após eletroforese em gel, baseado na sua fluorescência sob luz UV.
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Brometo de Etídeo
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Fornece informações sobre o tamanho, composição e conformação. 
Composto potencialmente deletério, sendo mutagênico e carcinogênico.
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DNA genômico
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RNA de boa qualidade
RNA degradado
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Ladder = Marcador de Peso Molecular
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 100pb M
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Fatores que alteram a migração
Concentração do gel - tamanho dos poros;
Estado do ácido nucléico;
Tamanho da molécula;
Voltagem - DNA normalmente migra com velocidade diretamente proporcional ‘a voltagem aplicada; até um limite de 5V/cm quando voltagens superiores são aplicadas, a linearidade é perdida e moléculas maiores migram mais rapidamente;
Tempo;
Bolhas do gel podem impedir a corrida;
Tampão utilizado - composição e força iônica; maior força iônica pode levar a geração de calor e pode desnaturar o DNA;
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Problemas no gel
Gel ideal
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Acrilamida:
Polimeriza-se a partir da reação da acrilamida (C3H5NO) com a Bis-Acrilamida (N,N´- Metileno-bis-acrilamida) em presença de perssulfato de amônio (APS) e catalisada por TEMED (N,N,N´,N´-Tetrametiletilenodiamino). 
A mistura, dissolvida no tampão de corrida, é posta rapidamente para polimerizar numa cuba de montagem semelhante à utilizada para agarose, mas orientada verticalmente. Também é posto um pente para a formação de poços.
ELETROFORESE
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Rede tridimensional
Concentração de acrilamida determina espessura da rede;
Concentração de bisacrilamida determina comprimento da rede;
Características:
Elasticidade, densidade do gel, tamanho do poro, etc
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Polimerização - Persulfato de amônio (APS) via radicais livres iniciada por adição de catalizadores
Catalizadores - TEMED – N, N, N, N’, N’ – tetrametiletilenodiamina
- Produção de radicais livres de oxigênio
	
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Eletroforese Vertical em Acrilamida
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Eletroforese Vertical em Acrilamida
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Apesar dos géis de acrilamida terem um maior poder de resolução, seu uso é restrito pela sua ação neurotóxica.
 
Sua utilização é preferencial no Sequenciamento do DNA, onde o tamanho dos fragmentos podem ser diferenciados de 1 em 1 base nitrogenada.
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