A 14 desenho de primers

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

DESENHO DE primers 
GAGATAGAGAGATGGTTTGC
GAGATAGAGAGATGGTTTGC
GAGATAGAGAGATGGTTTGC
GAGATAGAGAGATGGTTTGC
GAGATAGAGAGATGGTTTGC
TICVCKRTGRTGIHGCYTSCRTCCA 
TICVCKRTGRTGIHGCYTSCRTCCA 
TICVCKRTGRTGIHGCYTSCRTCCA 
TICVCKRTGRTGIHGCYTSCRTCCA 
TICVCKRTGRTGIHGCYTSCRTCCA 
TICVCKRTGRTGIHGCYTSCRTCCA 
TICVCKRTGRTGIHGCYTSCRTCCA 
TICVCKRTGRTGIHGCYTSCRTCCA 
TICVCKRTGRTGIHGCYTSCRTCCA 
GAGATAGAGAGATGGTTTGC
Principais estratégias para clonagem; expressão gênica...
Desenho de primers: Amplificação de cDNA/ DNA por PCR a fim de clonar/sequenciar; estudar expressão gênica; produzir proteína recombinante...
1 – Busca em bancos de dados por sequências dos genes de interesse;
... Se não há sequências:
2- Clonagem e sequenciamento de genes a partir de produto de PCR / RT-PCR; (identificação de genes de uma família multigênica, se for o caso);
3- Amplificação de gene/cDNA por PCR objetivando produzir uma proteína recombinante;
4- Desenho de primers para estudo da expressão gênica por RT-PCR
	*** considerações : PCR quantitativa e semi-quantitativa;
	- Um gene isoladamente (específico);
	- cada membro de uma família multigênica (específico);
	- Perfil geral de expressão de uma família multigênica (degenerado).
Desenho de primers degenerados / Específicos
ESTUDO DE CASO: Clonagem de genes da AOX da graviola (Annona muricata L.) objetivando estudar a espressão gênica por RT-PCR semi-quantitativa; quantitativa. 
Condições para atingir os objetivos:
1 – Ter as sequências dos genes para desenhar primers específicos (primers que detectem cada um dos genes) ; 
2- Do que dispomos? Genoma ? ESTs? Ou outras sequências em bancos de dados?
: Nada...
3- Então: Obrigatório clonagem dos genes (identificação / caracterização, sequenciamento);
4) Estratégia para clonagem: Coletar o maior número possível de sequencias da AOX de plantas (filogeneticamente próximas) para fazer alinhamento e detectar as regiões conservadas... 
 
... Se essas regiões são conservadas nos genes/cDNAs da AOX das demais plantas, devem também ser conservadas nos genes/cDNAs da AOX de graviola. 
5) DESENHO DE PRIMERS NAS REGIÕES CONSERVADAS (degenerados)
Clonagem de genes por PCR/RT-PCR
Pesquisa de genes de interesse no GenBank 
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Desenho de primers degenerados/específicos
- Extração de DNA genômico/RNA total
 Estabelecimentos das condições ótimas de amplificação
 Purificação do fragmento amplificado
 Clonagem num vetor específico
- PCR em colônia
 Purificação de clones positivos e sequenciamento
Desenho de primers: Exemplo AOX
Primer F
Primer R
Detecção da temperatura de anelamento dos primers
94°C ------- 3 min
 94°C ------- 1 min
50 –65°C – 1min (gradiente)
*72°C --------1’ 30’’ 
 72°C -------- 5 min 
 
35 ciclos
* Considerar que a Taq DNA polimerase adiciona 1000 nucleotídeos por minuto
50 51,2 52,5 53,8 55 56,4 57,8 59 60,2 61,6 63 64,5
Gradiente de temperatura –
termociclador
Estabelecimentos das condições ótimas de amplificação
Clonagem em E. Coli e purificação de plasmídios
Detecção de clones positivos e purificação de plasmídeos
 Detecção = PCR em colônia
 Figura -Eletroforeses em gel de agarose 1% das etapas de clonagem do gene AOX de graviola: (A) DNA genômico estraído da graviola (B) fragmentos purificados do gene AOX obtidos por PCR usando diferentes pares de primers (1 - primers aox20/aox22 e 2 - primers aox21/aox29); (C) Mini-preparação de plasmídios pGEM-T Easy após clonagem dos referidos fragmentos. 
Sequenciamento
Obtenção de cDNAs completos 
AAAAAAAAA
5’
3’
TTTTTTTTTTT
F
R
PCR
Extração de RNA total: Tecidos ??? (o gene de interesse deve ser expresso) 
RT
RACE 3’
TTTTTTTTTTT
F1
AAAAAAAAA
RACE 5’
R1
Adicionar cauda poli A na extremidade 3’ – terminal transferase + dATP
AAAAAAAAA
5’
3’
TTTTTTTTTTT
R2
F2
5’
3’
F1 e R2 são primers específicos
RACE 5’ e 3’ = Rapid Amplification of cDNA Ends
Obtenção de cDNAs completos 
3- Amplificação de gene/cDNA por PCR objetivando produzir uma proteína recombinante;
Produção da Oxidase alternativa (AOX) recombinante em E. coli
FIGURA 36 – Seqüência nucleotídica do cDNA da oxidase alternativa (Vu-clone 5). Em amarelo – Extremidade não codante 5’; Em vermelho – Sequência codificadora do peptídio sinal; Em azul – Sequência codificadora da proteína MATURA; Em verde – Extremidade não codante 3’. ATG (códon que codifica para a primeira metionina); TGA (códon de terminação da tradução protéica). 
FIGURA 10 – Plasmídio de expressão pQE-30. PT5 (promotor T5); lac O (operador lac O); RBS (sítio de ligação a ribossomos); ATG (códon correspondente a metionina); MCS (sítio de poli clonagem).
FIGURA 37 – Controle da preparação do plasmídio de expressão e do inserto da oxidase alternativa. Eletroforeses em Gel de agarose 0,8%: (A) Digestão por BamHI e PstI e purificação do plasmídio pQE-30; 1- pQE não digerido, 2- pQE digerido por BamH I e Pst I, desfosforilado e purificado. (B) Amplificação por PCR do inserto de cDNA da AOX (Vu-clone 5) correspondente a proteína matura. (C) Digestão por BamHI e PstI e purificação do inserto de cDNA da AOX (Vu-clone 5) correspondente a proteína matura. M – marcador de tamanho molecular (DNA ‘’ladder” 1kb) 
A
B
C
FIGURA 38 – Controle da ligação do plasmídio de expressão ao inserto da oxidase alternativa. Eletroforese em gel de agarose 0,8%: 1- Plasmídio pQE-30 vazio; 2- Plasmídio pQE-30 recombinante; 3 – Plasmídio pQE-30 vazio digerido com BamH I e Pst I; 4 - Plasmídio pQE-30 recombinante digerido com BamH I e Pst I e 5 – PCR do Plasmídio pQE-30 recombinante com os primers aox12 e aox13. 
FIGURA 17 – Etapas de transformação e expressão da proteína recombinante em E. coli. 
FIGURA 39 – Purificação e detecção da oxidase alternativa recombinante de Vigna unguiculata. (A) SDS-PAGE com gradiente phastGel 8-25%: M [marcador de peso molecular LMW (pharmacia)]; 1- Extrato de E. coli M15 (pREP4) transformadas com o pQE vazio (controle negativo) e induzidas por IPTG 1mM; 2- Extrato de E. coli M15 (pREP4) transformadas com o pQE recombinante e induzidas por IPTG 1mM; P1- precipitado bruto obtido das etapas iniciais de purificação; FT- “flow through”; L1, L2 e L3 (lavagens da resina Ni-NTA); E1, E2, E3 e E4 (eluições da proteína recombinante). (B) Western blotting utilizando o anticorpo monoclonal anti-AOX de Sauromatum gutattum . 
A
B
4- Desenho de primers para estudo da expressão gênica por RT-PCR
 Um gene isoladamente (específico);
- cada membro de uma família multigênica (específico);
- Perfil geral de expressão de uma família multigênica (degenerado).
 REGRAS PARA RT-PCR QUANTITATIVA – The Plant Cell 20: 1736-1737, 2008 
1 – Material (3 repetições biológicas) – N2 e estocar a -80°C;
2 – RNA de alta qualidade;
3 – Digerir amostra com DNAse; Verificar com gene marcador;
4 – Fazer reação de RT com uma “SuperScript” transcriptase reversa;
5 – Desenhar primers gene-específicos usando critérios padrões:
 (tamanho: 18 a 25 bases; GC: 40 – 60%; produto de PCR: 60 – 150 pb (Quantitativa) ou 400 a 700 pb (Semi-quantitativa);
6 – Reduzir erros técnicos: Robotizar; Minimizar o número de pipetagens; Fazer mix; ambiente limpo; Verificar contaminação com DNA de soluções; 
7 – Para quantificação relativa (normalização) usar pelo menos 4 genes de referência: fazer ensaios preliminares;
8 – PCR dos genes de referência em paralelo com genes específicos.
QUALIDADE DO RNA ISOLADO
- Abs 260 / 280 : 1,7 a 2,1
- Abs 260 / 230 : > 2,0
Parâmetros de avaliação:
Menor que 1,7: proteínas e ou fenois
Maior que 2,1: carboidratos solúveis
Menor que 2,0: polissacarídeos
- Integridade do RNA: (Gel de agarose)
Razão (28S:18S)= 2:1 (RNA intacto) 
 Um gene isoladamente (específico);
Fazer um BLASTn em bancos de dados do NCBI...
- cDNA é submetido diretamente para se desenhar um par de primers específico usando uma ferramenta. Ex.: PerlPrimer
AAAAAAAAA
AAAAAAAAA
AAAAAAAAA
AAAAAAAAA
Gene 1a
Gene 1b
Gene 1c
Gene 1d
ORF
5’ UTR
3’ UTR
 Gene 1a ATGCGATCCTACTGCCAGACAAGCTT....
 TACGCTAGGATGACGG  
 ****************
Gene 1b ATGCGATCCTACTGCGAGACAAGCTT.... 
 TACGCTAGGATGACGG X
 ***************
Gene 1b ATGCGATCCTACTGCGAGACAAGCTT.... 
 TACGCTAGGATGACGGT 
 *************** *
Família multigênica: primers específicos para cada gene
Cuidado!!!
 UTRs são mais variáveis
 ORF são mais conservadas 
Ideal: desenhar nas UTRs, mas se desenhar nas ORFs... 
- Perfil geral de expressão de uma família multigênica (degenerado).
AAAAAAAAA
AAAAAAAAA
AAAAAAAAA
AAAAAAAAA
Gene 1a
Gene 1b
Gene 1c
Gene 1d
ORF
5’ UTR
3’ UTR
 UTRs são mais variáveis
 ORF são mais conservadas 
 Gene 1a ATGCGATCCTACTGCCAGACAAGCTT....
Gene 1b ATGCGATCCTACTGCGAGACAAGCTT.... 
 
Gene 1c ATCTGAACCAACGACCAGACAAGCTT.... 
 
Gene 1d ACTAGAACCGACCGCAAGACAAGCTT.... 
 
Obrigatoriedade: EM ORFs
Primer1 AYBHGAWCCDACBRCVAGAC 
 
R=A/G, Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, W=A/T, B=C/G/T, D=A/G/T, H=A/C/T, V=A/C/G, and N=A/C/G/T.