Patologia Clínica de Análises Clínicas

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Patologia Clínica - Aula 1 – 21/08
 Existem algumas normas gerais para colheita de amostras biológicas para análises clínicas. O sangue é a amostra principal usada em laboratórios para análises clínicas, também são usadas outras amostras como a urina, líquido cavitário e em alguns laboratórios fazem citologia. O exame de sangue precisa de uma preparação prévia que é o jejum, no laboratório veterinário o animal geralmente não vem em jejum. 
 O hemograma avalia a quantidade de hemácias, plaquetas e leucócitos. 
*Como o jejum pode interferir no hemograma? A concentração de glicose não interfere na quantidade de hemácias, plaquetas e leucócitos. O jejum é indicado para que o animal não tenha uma hiperglicemia e nem apresente uma lipemia (aumento de lipídeo). 
Se o animal tiver uma dieta rica em quantidade de gordura, ela vai para o sangue. A glicose é uma substância hidrossolúvel no sangue, ou seja, ela vai estar diluída no sangue. Já a gordura é lipossolúvel, ela altera a densidade, quando tem muita gordura ela deixa a amostra turva e estando turva ela interfere em alguns métodos de determinação: refratometria e espectrofotometria. Quando a gordura deixa a amostra turva o aparelho entende que tem mais hemoglobina e a concentração de hemoglobina vai estar alterada falsamente. Além disso, se o lipídeo estiver em alta concentração ele vai interferir na membrana das hemácias, porque a membrana das células é composta por uma camada fosfolipídica.
 A colheita deve ser atraumática, principalmente quando falamos de sangue. A colheita é traumática quando o animal não colabora (felinos) ou quando quem está colhendo o sangue não tem prática. O problema da colheita ser traumática é que a amostra pode coagular e ficar toda sólida ou ela pode coagular e começar com alguma ação mas não terminar, causando uma agregação plaquetária. A agregação plaquetária dificulta a contagem das plaquetas (não pode confiar no resultado), e esse bolo de plaquetas podem entupir o aparelho porque ele possui uma cânula fina.
 O que fazer para não ter uma colheita traumática? Ter experiência, e em alguns casos quando o animal está muito agitado fazer contenção química.
 Quais problemas podem ocorrer na avaliação histopatológica das amostras? Má qualidade das amostras, porque tem amostras que chegam com agregação plaquetária, coagulada ou hemolisada, e tudo isso interfere no resultado. Isso pode ser causado através da colheita, do transporte e da conservação da amostra.
O que pode interferir antes da colheita é o jejum, o tempo (quanto tempo o animal ficou em jejum, quanto tempo de exercício físico) e a dieta (alimentação, medicamento, exercício físico). 
 Problemas que acontecem com o animal trans (durante a colheita): o tempo excessivo de garrote deixa o sangue parado, ativando os fatores de coagulação e causando a agregação de plaquetas. Se o garrote for feito e não conseguiu colher, espera um tempo para o sangue voltar a circular e tenta novamente.
 Quando for fazer a colheita, faz uma pressão negativa na agulha e quando ela entra no vaso o sangue começa a aparecer na seringa e é possível ver o que está dentro do vaso. Quando faz essa pressão negativa (vai e volta), a agulha perfura o tecido e destrói um monte de células, esse tecido tem líquido tissular que entra na agulha, e quando o sangue entrar na agulha, ele vai entrar em contato com esse líquido tissular e vai causar coagulação e agregação plaquetária. Então se perder o sangue quando for fazer a colheita, a agulha e a seringa tem que ser trocadas porque o sangue que está ali começou o processo de coagulação.
 Em relação ao transporte, é importante se preocupar com as condições de armazenamento (uso de isopor, gelo), principalmente com a temperatura e a distância. Algumas amostras precisam ser protegidas da luz com o papel alumínio porque a luz ou a luz solar degrada a bilirrubina.
 Que cuidados devem ser tomados ao solicitar o exame? Tem que ter uma suspeita clínica correta sabendo o histórico do animal e fazendo um exame clínico. É preciso saber o que altera aquela doença, qual o exame a ser solicitado e qual amostra e anticoagulante vão ser usados. O sangue não pode ser colocado no gelo seco senão congela. Pra hepatozoon ou erlíquia pode congelar pra fazer PCR (PCR avalia DNA).
 Qual a diferença do plasma e do soro? Os dois são a parte líquida do sangue. A diferença entre eles é o tempo de processamento, o plasma é obtido mais rápido que o soro, ele é a parte líquida que não coagulou e o soro é da parte que coagulou. 
Para obter o plasma a amostra não pode coagular e por isso é usado um anticoagulante. Depois pode ser levado para o laboratório e centrifugar. Se tiver anticoagulante dentro, tem que homogeneizar por inversão, de preferência deixando o tubo inclinado.
Em cada análise bioquímica possa ser que o anticoagulante interfira na reação. Quando quiser obter o plasma, mas estiver fazendo fator de coagulação é usado o citrato de sódio. Para a glicose é usado o fluoreto de sódio. Para fazer várias análises bioquímicas é preciso saber se o anticoagulante interfere em cada uma dessas análises, na dúvida é enviado o soro porque ele não tem nenhum anticoagulante.
Para obter o soro tem que colher a amostra, esperar coagular (deixa a amostra paradinha) pra depois liberar o soro. O sangue é colhido e colocado no frasco, espera ele coagular, gelatinizar e retrair o coágulo. Depois que retrair pode centrifugar porque o coágulo já vai estar estabilizado. Se o coágulo não estiver estabilizado na hora da centrifugação, as hemácias vão ser rompidas (hemólise) e vai ter um monte de hemoglobina no soro porque tudo o que estava dentro da hemácia foi para o soro, e isso interfere na análise bioquímica. Uma maneira rápida de separar o soro é colocando em banho-maria. 
ANTICOAGULANTES
 A função do anticoagulante é impedir a coagulação. O EDTA pode estar líquido ou em pó. Quando o volume de anticoagulante é muito grande, o EDTA pode ser colocado na estufa e ele vai evaporar, se o frasco do anticoagulante for velho ele também pode evaporar e ficar o salzinho ali, o problema é que vai ter que homogeneizar mais para diluir. 
 A diminuição da temperatura conserva a amostra. O formol é a substância utilizada para preservar a amostra, existem hemácias que tem uma fragilidade maior e se rompem. Quando for feito o hemograma das espécies que tem a hemácia nucleada, tem que fazer a contagem manual porque o equipamento automático não conta hemácias nucleadas. Como geralmente essas coletas são longe e a hemácia é mais frágil, tem que preservar essa hemácia para que seja possível fazer a contagem delas, para preservar é utilizado formol+citrato.
 Para dosar glicose não pode colocar no banho-maria porque quando aumenta a temperatura, também aumenta o metabolismo da célula que vai usar essa glicose como energia, e com isso, vai baixar a concentração da glicose. O ideal é centrifugar na hora e usar o fluoreto de sódio associado ao EDTA, porque o fluoreto impede a glicólise e o EDTA impede a coagulação.
Então o EDTA é usado na amostra, homogeneíza, coloca na centrífuga na mesma hora e vai haver a separação do líquido com o contato das células que degradam a glicose. Já o fluoreto, ele impede que as células que estão em contato com a glicose captem ela, as células não vão conseguir utilizar a glicose porque não vai ter fonte de energia e ATP para manutenção das bombas, e a célula vai acabar morrendo e liberando todo o conteúdo. 
Quando a amostra for colhida com o fluoreto de sódio, tem que tirar rapidamente esse plasma porque tem a glicose em contato com as células e essas células morrem e liberam todo o seu conteúdo. O fluoreto sempre vem associado ao EDTA, e esse EDTA pode ser sódico ou potássico.
PREPARAÇÃO DO PACIENTE
 O animal tem que estar em jejum para prevenir o aumento de lipídeos e da glicose. O jejum interfere no resultado porque o lipídeo pode estar aumentado no sangue devido ao animal ter comido muita gordura. 
Se o animalfica em jejum prolongado ocorre uma hipoglicemia e o organismo busca a segunda reserva que é a gordura, devido a isso o lipídeo está no aumentado no sangue. Então pode haver uma lipemia mesmo que o animal esteja em jejum prolongado.
Quando o animal está no período pós-prandial é só mandar o animal de volta para casa pra ele voltar outro dia em jejum, ou esperar no máximo 4 horas e colher o sangue novamente. 
Se tiver em jejum prolongado, pode utilizar heparina intravenosa, ela ativa a lipase endotelial. Pra a gordura sair do sangue e entrar no tecido adiposo, ela precisa ser quebrada pela lipase, então a heparina ativa a lipase na célula endotelial, quebra gordura e armazena nos adipócitos. Administra a heparina e espera 15 minutos, e ela vai limpar/clarear a amostra, diminuindo a concentração de gordura.
 Se o animal tiver problema de absorção ou digestão intestinal ele pode ter uma hipoglicemia, hipoproteinemia, anemia, albumina e a creatinina baixa. O animal caquético altera mais o hemograma do que um animal obeso.
 Se o paciente fez um exercício agudo ou se o cavalo foi treinado e o sangue foi colhido logo em seguida, vai ocorrer uma resposta esplênica por causa da liberação de adrenalina e devido a isso o baço contrai e libera as hemácias, plaquetas e leucócitos. O ideal é fazer vinte minutos depois de ter parado o exercício, porque esse tempo já é o suficiente para colher o sangue e não ter esse efeito da resposta esplênica. O problema do exercício agudo pode ser revertido em vinte minutos.
Se o animal fez um exercício físico durante muito tempo vai ter a liberação de enzimas. O exercício prolongado não é possível reverter, nesse caso, CK, AST e a ALT vão estar aumentados porque o animal teve uma miopatia.
 O estresse emocional aumenta o cortisol. O cortisol altera principalmente as enzimas hepáticas. É importante saber a idade e a raça do animal porque ele pode ter predisposição para algumas doenças. A quantidade de algumas substâncias no sangue é diferente de acordo com a faixa etária e a raça. 
 O problema do gato é que ele é uma espécie que não colabora durante a contenção e a colheita de sangue, isso faz com que a colheita seja traumática e a colheita traumática faz com que haja a agregação plaquetária e a amostra coagule.
 Se o paciente estiver tomando alguma medicação tem que saber à quanto tempo está tomando. O medicamento pode alterar as enzimas, a função renal e hepática, mas dependendo do medicamento eles afetam mais a parte da bioquímica do que a do hemograma, a não ser que o medicamento cause uma supressão da medula óssea, pois é ela que produz as células. Esse animal pode ter uma diminuição da ureia, creatinina e albumina.
 Na hora da colheita, as plaquetas, macrófagos e monócitos se aderem ao vidro causando uma diminuição na concentração. O ideal é fazer o hemograma usando frasco de plástico ou tubo de vidro siliconizado, e para o soro tubos de vidro. 
Quando a amostra de sangue é colhida sem anticoagulante para obter soro e é colocada no frasco de plástico, esse coágulo gelatiniza grudando na parede do tubo e não solta mais, e o coágulo não retrai. Quando isso acontece, pode pegar uma ponteira, colocar na pipeta, passar na borda e desgrudar. Quando não for glicose pode colocar em banho-maria para acelerar a estabilização. Depois que o coágulo estiver estabilizado coloca na centrífuga.
 Não pode colher sangue para hemograma e congelar (para bioquímica pode). Na hora da identificação dos tubos, pode escrever diretamente no tubo com caneta permanente, utilizar um adesivo mais resistente (esparadrapo) e colocar o gelo dentro do saquinho para que não molhe o adesivo. Identificar na ficha de qual animal é a amostra, qual a espécie e a suspeita clínica.
Para fazer a colheita, é melhor colher da jugular porque o animal não vai ter o reflexo de retirada, o calibre e a velocidade é maior e a possibilidade de agregação plaquetária é menor. 
Diferença do sangue arterial e venoso: a quantidade de gás carbônico. O sangue arterial é um vermelho mais vivo e o venoso é mais escuro. A oxigenação não interfere no hemograma. O sangue arterial não é colhido por causa da localização, a veia pode ser localizada quando faz garrote e a artéria dá pra ser localizada pela pulsação. A vantagem de colher sangue da artéria é que não precisa fazer pressão negativa, só que é mais difícil de encontrar.
ARMAZENAMENTO E CONSERVAÇÃO
 A urina pode ser colhida através de micção espontânea, pode passar uma sonda ou fazer cistocentese. A diferença é que na cistocentese a urina está sendo tirada diretamente da bexiga. Na sonda tirou da bexiga, passou pela uretra e foi eliminado. Durante esse trajeto pela uretra, passou pela vagina da fêmea, pode ter sido adicionado substâncias e células que não estavam dentro da bexiga, mas foram adicionadas durante esse trajeto. Por exemplo, se a cadela estiver no cio vai ter a presença de hemácias, então tem alteração na interpretação dos resultados. 
Na micção espontânea pode ter bactéria porque é normal da flora. Se tem anticoagulante é preciso homogeneizar, a homogeneização é por inversão várias vezes.
Sempre que for processar é importante lembrar do tempo, e do tempo eu lembrar da conservação, e conservação temperatura. 
Urinálise: 12 horas é o tempo para analisar essa amostra (refrigera), se passar disso tem que congelar ou utilizar o formol. Se congelar a urina a análise química vai estar normal, mas não vai dar para avaliar as células porque elas formam cristais e rompem. O formol é usado para conservar as células, é usado 1 ml de formol para 30 ml de urina, mas o formol também altera a composição química da urina e essa análise química não vai conseguir ser feita. Se o sedimento for avaliado, não pode congelar a urina e o formol vai ser utilizado como método de conservação. Quando quiser descobrir se o animal tem diabetes, o formol não é utilizado e só congela a amostra. Se for um animal grande que tem um volume grande, congela a metade e coloca formol na outra metade. Então, para análise química congela e para sedimento utiliza formol.
 No processamento, tem que lembrar que algumas substâncias são degradadas, a bilirrubina é degradada com a luminosidade, a proteção é feita com papel alumínio. Sempre que o sangue com anticoagulante fica parado as células sedimentam. Se não homogeneizar a amostra, e retirar líquido da parte de cima ou de baixo, essa amostra vai estar alterada.
 Se o clima tiver muito quente, além do consumo de glicose, as células vão degenerar. Quando a colheita for no campo, o ideal é que se tenha gelo e isopor para conservar. Em lugares com temperaturas altas, a temperatura da lâmina vai ficar muito alta e as células vão romper. 
Em lugares de muita chuva as células vão degenerar e em lugares de muita umidade as lâminas não secam, a água condensa e as hemácias rompem.
Quando for fazer hemograma e colher no campo, depois de ter feito a lâmina, ela é transportada em temperatura ambiente a seco. Para confiar no resultado de plaquetas ela tem que ter sido processada em até duas horas.
As alterações que podem acontecer é o rompimento das hemácias, hiperlipidemia (amostra fica turva) aumenta falsamente a quantidade de hemoglobina. 
 Quando se avalia as enzimas não é possível ver a quantidade delas em uma amostra, só é possível descobrir que ali tem enzima ativa. Quando é congelado, a atividade enzimática diminui. A regra para conservar amostra pra atividade enzimática é refrigerar durante 24 horas, se passar disso congela.
 O esfregaço deve ser feito em até 30 minutos, essa limitação de tempo ocorre porque vai ter degeneração dos leucócitos, e essa degeneração pode ser por causa de alguma doença ou porque a amostra é velha. Se for feita no campo tem que levar a lâmina para fazer o esfregaço lá, o ideal é que se tenha uma caixinha para armazenar as lâminas ou esperar ela secar no ar e enrolar em um papel higiênico.
 A amostra pode estar coagulada ou ter agregação plaquetária.O plasma tem os fatores de coagulação e fibrinogênio, por isso tem que utilizar uma substância anticoagulante. O anticoagulante usado no hemograma é o EDTA, se utilizar a heparina ela vai impedir a formação do fibrinogênio em fibrina. 
Para contagem de plaquetas, o melhor anticoagulante para o hemograma é o EDTA, e o tempo para contagem de plaqueta é de duas horas. Para dosar fibrinogênio ou os fatores de coagulação é utilizado o citrato de sódio a 3,8% essa amostra tem que ser separada em 30 minutos, depois de separado é centrifugado. Para dosar fator de coagulação tem que analisar imediatamente ou congelar, o problema de congelar é que se a colheita for traumática ou se a temperatura variar os fatores de coagulação vão ser muito instáveis, o ideal é a amostra seja colhida e processada com citrato de sódio, homogeneíze, centrifugue e faça análise. Se a amostra tiver coagulado vai ter como se tivesse uma gelatina boiando, quando a amostra estiver assim não é feita a análise porque o tempo de coagulação vai estar aumentado. O ideal é fazer 30 minutos depois que colheu a amostra. 
 Quando for fazer o hemograma de espécies com hemácia nucleada a concentração de proteínas no plasma é diferente, tem que utilizar uma concentração de anticoagulante diferente. Nessas espécies é utilizado o EDTA a 3 ou 5%, nos mamíferos geralmente é utilizado a 10%.
Estabilidade do constituinte: tem que dosar primeiro a bilirrubina que é degradável e as enzimas que podem ter atividade diminuída.
Temperatura: está relacionada a viabilidade. Se a amostra for ficar congelada por 5 meses, nesse caso tem que baixar a temperatura (congela a -70). Se a amostra for ficar por 5 dias, a amostra pode ser refrigerada. Se a análise for feita em 24 horas, refrigera a amostra.
Amostra pra cultura: cistocentese, e o material tem que estar todo estéril.