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Métodos bioquímicos e moleculares em farmacologia Universidade Federal de Santa Maria Centro de Ciências da Saúde Programa de Pós-graduação em Farmacologia Santa Maria, Novembro de 2010 Prof. Mauro Oliveira � Data de criação: 11/01/2008 � Instituição multicampi localizada no pampa gaúcho � Reitora: Profª Maria Beatriz Luce � Vice-reitor: Prof Norberto Hoppen � Sites: http://www.unipampa.edu.br/portal/ http://porteiras.unipampa.edu.br/itaqui/ http://cursos.unipampa.edu.br/cursos/ppgbioq/ Localização dos Campi da Unipampa Unipampa – Campus Itaqui Cronograma � Aula 1 (16/11) � Apresentação � Distribuição dos temas para elaboração de projetos � Preparação avançada de amostras: obtenção, escolha dos reagentes, fracionamento subcelular, dosagem de proteína Cronograma � Aula 2 (17/11) � Anticorpos: aspectos básicos, produção, escolha � Detecção de proteínas específicas: western blotting, slot blotting Cronograma � Aula 3 (18/11) � Métodos para determinação de interação entre proteínas e entre proteínas e ácidos nucléicos - parte 1: imunoprecipitação, pull-down assay, far-western blotting, análise de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) � Métodos para determinação da atividade de proteínas envolvidas em vias de sinalização Cronograma � Aula 4 (19/11) � 1) Apresentação dos projetos � 2) Encerramento Extração de proteínas � Rompimento (lise) celular Extração de proteínas � Rompimento (lise) celular � Obtenção do homogenato: suspensão contendo os componentes das células e/ou tecidos Métodos físicos Métodos químicos (uso de detergentes ou enzimas) Métodos físicos � Homogeneização líquida Dounce Potter-Elvehjem Métodos físicos � Sonicação � Lise celular por pulsos de ondas de som de alta-frequência � Alta eficiência � Formação de bolhas e aquecimento da amostra Métodos físicos � Ciclos de congelamento e descongelamento (freeze/thaw cycles) � Lise celular por cristais de gelo � Processo lento Métodos químicos � Enzimas: lisozima, glicanases, proteases, etc � Detergentes � Iônicos: maior eficácia, risco de desnaturação � Não-iônicos: menor eficácia, mantém a estrutura e atividade das proteínas Detergentes Detergentes Detergentes iônicos � Detergentes iônicos � SDS: sodium dodecyl sulfate � Deoxicolato de sódio: sodium deoxycholate (desnaturante médio) Detergentes não-iônicos � Detergentes não-iônicos � CHAPS: 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2- hydroxy-1-propanesulfonate � Triton X-100: polyethylene glycol p-(1,1,3,3- tetramethylbutyl)-phenyl ether � NP-40: nonyl phenoxyl polyethoxylethanol Extração de proteínas � Tampões: PBS, HEPES, Tris-HCl, Imidazol, Glicina, MOPS, MES, etc � Agentes redutores: DTT, β-Mercaptoetanol, L-Cisteína, ácido ascórbico, glutationa reduzida, etc � Quelantes: EDTA, EGTA, desferroxamina, etc � Sacarose, sais, etc Extração de proteínas � Inibidores de proteases Inibidores de proteases Extração de proteínas � Inibidores de proteases e fosfatases Inibidores de fosfatases Extração de proteínas � Exemplos de soluções de extração: � RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer): - Útil para homogenato total, membrana, núcleo, mitocôndria - Não-recomendado para imunoprecipitação/pulldown assay 150 mM NaCl 1.0% NP-40 ou Triton X-100 0.5% deoxicolato de sódio 0.1% SDS 50 mM Tris, pH 7.6 Extração de proteínas � Exemplos de soluções de extração: � Nonidet-P40 (NP40) buffer: útil para homogenato total, membrana, menos desnaturante que o RIPA � Tris-HCl buffer: útil para proteínas citosólicas solúveis 150 mM NaCl 1.0 % NP-40 ou Triton X-100 50 mM Tris, pH 7.6 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 Coquetel de inibidores de proteases e fosfatases Extração de proteínas � Qual método/solução escolher? � Eficiência e reprodutibilidade � Tempo e custo � Estabilidade do alvo Extração de proteínas - questões 1) Qual o volume/número das amostras? 2) As células do tecido em questão são rompidas facilmente? 3) Qual o grau de lise requerido? 4) Qual a estabilidade da proteína/estrutura de interesse? 5) Que métodos de análise serão utilizados depois? Preparação da amostra � Trabalhar com frações enriquecidas na(s) proteína(s) de interesse Preparação da amostra � Trabalhar com frações enriquecidas na(s) proteína(s) de interesse Fracionamento subcelular Preparação da amostra � Centrifugação: método mais utilizado para fracionamento subcelular � Centrifugação diferencial � Centrifugação de gradiente de equilíbrio de densidade Preparação da amostra Centrifugação diferencial Centrifugação de gradiente de equilíbrio de densidade � Sacarose: 20-70 %, com incrementos de 10 % � Percoll: menos tóxico � Ficoll � Cloreto de césio Centrifugação de gradiente de equilíbrio de densidade Centrifugação de gradiente de equilíbrio de densidade Centrifugação de gradiente de equilíbrio de densidade Fracionamento subcelular Preparação da amostra � Dosagem de proteína total Ajuste da quantidade de proteína a ser utilizada Quantidade ideal para cada método Preparação da amostra � Métodos colorimétricos: - Bradford (azul de Coomassie) - Lowry - Ácido bicinconínico (BCA) Método de Bradford � Bradford, 1976 (Anal. Biochem. 72:248-254) � "A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding" � Azul de Coomassie � Leitura em 595 nm Método de Bradford Método de Bradford � Reagente estável (12 meses) � Desenvolvimento de cor muito rápido � Compatível com agentes redutores e agentes quelantes � Método confiável para concentrações de proteínas entre 100 e 1,500 µg/mL Método de Bradford Método de Bradford � Interferência com detergentes � Incompatível com proteínas insolúveis em meio ácido � Maior variabilidade entre as proteínas usadas como padrão Método de Bradford Método de Bradford - interferentes Método de Lowry � Lowry et al., 1951 (J. Biol. Chem. 193, 76-85) � "Protein Measurement With the Folin Phenol Reagent" � Leitura em 750 nm � Temel, et al., 2003 (J. Biol. Chem. 278, 4792-4799) Método de Lowry Método de Lowry Método de Lowry � Reagente estável sob refrigeração � Desenvolvimento de cor mais lento (30 min ideal) � Menos compatível com agentes redutores, detergentes e agentes quelantes e Tris Método de Lowry � Método confiável para concentrações de proteínas entre 5 e 2,000 µg/mL � Menor variabilidade entre as proteínas que o método de Bradford Método de Lowry Método de Lowry - interferentes Método do ácido bicinconínico (BCA) � Smith et al., 1985 (Anal. Biochem. 150, 76-85) � "Measurement of protein using bicinchoninic acid" � Leitura em 562 nm Método do ácido bicinconínico (BCA) Método do ácido bicinconínico (BCA) Método do ácido bicinconínico (BCA) � Desenvolvimento de cor mais lento (30 min ideal) � Compatível concentrações mais altas de detergentes, menos compatível com agentes redutores � Método confiável para concentrações de proteínas entre 20 e 2,000 µg/mL � Menor variabilidade entre as proteínas que o método de Bradford, similar ao método de Lowry Método do ácido bicinconínico (BCA) Método do ácido bicinconínico (BCA)- interferentes Bradford Lowry BCA Bradford Lowry BCA Dia 2 – 17/11 � Anticorpos: aspectos básicos, produção, escolha � Detecção de proteínas específicas: western blotting, slot blotting � Métodos para determinação de interação entre proteínas e entre proteínas e ácidos nucléicos - parte 1: imunoprecipitação, pull-down assay � São proteínas (imunoglobulinas) produzidas em resposta a um antígeno, que tem alta afinidade por este antígeno Anticorpos Emil von Behring Baron Kitasato Shibasaburō 1890 Antitoxina da difteria Anticorpos Anticorpos � Gamaglobulinas ou imunoglobulinas Anticorpos - estrutura Anticorpos Anticorpos - estrutura Anticorpos Susumu Tonegawa 1978 Descoberta do mecanismo genético que produz a imensa variabilidade das imunoglobulinas Recombinação somática Recombinação somática Remoção de segmentos D e J Remoção de segmentos V e D Recombinação de segmentos V e DJ Recombinação de segmentos D e J Segmentos de V, D e J Novo gene (contendo segmento que codifica a região variável e a região constante) � IgG, IgM, IgA, IgD, IgE � Diferentes papéis na resposta imune � Diferenças quanto a estrutura e funções Classes de anticorpos Classes de anticorpos Produção de anticorpos Produção de anticorpos � Harlow e Lane, 1988 - Antibodies: A Laboratory Manual � Roteiro básico: - Preparação do antígeno - Injeção do antígeno em animal - Extração e purificação dos anticorpos Produção de anticorpos � Policlonais Produção de anticorpos � Monoclonais Anticorpos policlonais � Menor custo: tecnologia mais simples, requer menos tempo e capacitação técnica para produção � Ligação em múltiplos epítopos: - Facilidade para detectar baixo níveis do antígeno - Menos sensível à mudanças pós-traducionais - Reatividade cruzada - Variabilidade entre os lotes Vantagens Desvantagens Anticorpos monoclonais � Maior custo: tecnologia mais refinada, requer mais tempo e capacitação técnica para produção � Ligação em um único epítopo: - Baixíssima variabilidade entre os lotes - Menor reatividade cruzada - Mais sensível à mudanças pós-traducionais - Dificuldade para detectar baixo níveis do antígeno Vantagens Desvantagens Anticorpos primários X secundários Marcação de anticorpos � Enzimas � Fluoróforos � Biotina Anticorpos � Que quantidade usar? Diluição ideal para cada método Constante de afinidade Acesso quantidade do epítopo Método de detecção Anticorpos - que quantidade usar? � Western blotting, slot blotting: 1:100 - 1:1000 � Imunoprecipitação: 1-2 µg por 100-500 µg de proteína total � Imunohistoquímica: 1:50 - 1:500 Western blot � Método para detecção de proteínas específicas � Edwin Southern: invenção do método para detecção de DNA � W. Neil Burnette, 1981 “Western blotting” Eletroforese em gel � Técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial � A técnica de eletroforese mais utilizada para separação de proteínas é o SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate – PoliAcrylamide Gel Electrophoresis Eletroforese em gel Gel de poliacrilamida (PAG) � Gel formado por um polímero de acrilamida e bis-acrilamida � Termo-estável, transparente, resistente relativamente inerte e que pode ser preparado com diversos tamanhos dos poros SDS-PAGE � Quanto maior a porcentagem de acrilamida/bis-acrilamida, menor o tamanho dos poros � Determinar a porcentagem ótima do gel é um dos passos mais importantes Gel de poliacrilamida (PAG) � Tris: tampão � Acrilamida/bis-acrilamida: substratos para polimerização � SDS: manter condição desnaturante � Persulfato de amônio: iniciador � TEMED: (N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina): cross-linker Gel de poliacrilamida (PAG) Gel de poliacrilamida (PAG) Gel de poliacrilamida (PAG) Padrão de peso molecular � Solução de proteínas com diversos pesos moleculares Padrão de peso molecular Loading buffer � Solução utilizada para “carregar” a amostra no gel � SDS-PAGE: para condições desnaturantes e redutoras o mais usado é a solução de Laemmli � Laemmli UK, August 1970: "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4". Nature 227 (5259): 680–685. � 169651 citações Loading buffer � Laemmli 2X buffer: � Adicionado na amostra na proporção 2:1 4% SDS 10% 2-mercaptoehtanol 20% glycerol 0.004% bromophenol blue 0.125 M Tris-HCl pH 6.8 Loading buffer � SDS: uniformizar a carga elétrica total da proteína � Carga elétrica total proporcional ao peso molecular da proteína Loading buffer � Azul de bromofenol: visualização da migração da amostra durante a eletroforese Transferência � Passagem das proteínas do gel para a membrana de nitrocelulose ou PVDF Transferência Membranas Membranas � Hidrofóbica � Maior resistência � 100 - 300 µg/cm2 � Maior custo � Hidrofílica � Menor resistência � 80 - 100 µg/cm2 � Menor custo NitrocelulosePVDF Transferência � Controle da eficiência: coomassie (gel – irreversível) Transferência � Controle da eficiência: ponceau S (membrana - reversível) Bloqueio da membrana � Evitar ligação inespecífica dos anticorpos na membrana � Albumina bovina 5 % - Maior custo � Leite desnatado 5 % - Menor custo - Não indicado para detecção de proteínas fosforiladas Detecção da proteína 1. Ligação do anticorpo primário na proteína de interesse 2. O anticorpo secundário conjugado com enzima liga no anticorpo primário 3. A enzima converte o substrato em produto Detecção da proteína Controles utilizados em Western blot � Controle do carregamento (loading): para garantir que todas as linhas do gel contém a mesma quantidade de proteína � Exemplos: - GADPH (37 kD) - tubulina (55 kD) - beta actina (43 kD) - Na+,K+-ATPase alfa (110-113 kD) - citocromo oxidase 4 (16 kD) Controles utilizados em Western blot � Controle positivo: lisato proveniente de tecido ou célula que expressa com certeza a proteína que está sendo detectada � Controle negativo: lisato proveniente de tecido ou célula que NÃO expressa com certeza a proteína que está sendo detectada � Ausência de anticorpo primário: controle de ligação inespecífica Peptídeos de bloqueio � Normalmente é o mesmo epítopo utilizado para desenvolvimento/fabricação do anticorpo � Utilizado para testar a possibilidade de ligação inespecífica entre o anticorpo primário e a membrana ou outras proteínas � Protocolo: incubação prévia do anticorpo primário com o peptídeo de boqueio (5 X a quantidade do anticorpo) Peptídeo de bloqueio Lane 1 : HeLa cell extract at 10ug/lane Lane 2 : HeLa cell extract at 10ug/lane with 16 ug blocking peptide Lane 3 : HeLa cell extract at 10ug/lane. Goat anti Rabbit HRP control Slot blot � Simplificação do método de western blot � Imobilização das proteínas diretamente nas membranas de nitrocelulose ou pvdf � Vantagens: mais rápido, menor custo � Desvantagens: pouca especificidade Slot blot Slot blot Cronograma � Aula 3 (18/11) � Métodos para determinação de interação entre proteínas e entre proteínas e ácidos nucléicos: � Imunoprecipitação, pull-down assay, far-western blotting, análise de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) Imunoprecipitação � Técnica utilizada para isolamento/purificação de proteínas utilizando anticorpos e resinas de alto peso molecular � Co-imunoprecipitação: determinação da interação entre proteínas Imunoprecipitação Resinas utilizadas em imunoprecipitação Resina contendo agarose e proteína A, G, A/G ou L Resinas utilizadas em imunoprecipitação Resinas utilizadas em imunoprecipitação Resinas utilizadas em imunoprecipitação S= strong (forte) W= weak (fraco) NB+ no binding (não liga) Co-imunoprecipitação Co-imunoprecipitação Co-imunoprecipitação Co-imunoprecipitação Biotinilação de proteínas � Marcação (tagging) de proteínas com biotina (vitamina H) Biotinilação de proteínas � Interação entre biotina e avidina ou streptavidina Kd = 10-15 M métodos de imunoprecipitação e purificação de proteínas Biotinilação de proteínas � Reação com grupos amino primários de proteínas � Principais reagentes de biotinilação de proteínas: - N-hydroxysuccinimide (NHS) esters - N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) esters Biotinilação de proteínas Biotinilação de proteínas Biotinilação de superfície Biotinilação de superfície Biotinilação de superfície Biotinilação de superfície Biotinilação de superfície Figure 6. Immunoblot indicates that Arc is required for the decrease in surface AMPARs after short- term monocular deprivation. Interação entre proteínas � Interações físicas entre proteínas levam a uma série de alterarações nas suas propriedades � Alterações nas propriedades cinéticas das enzimas (mudança na afinidade por substratos ou regulação alostérica) � Mudanças na constante de afinidade receptores por seus ligantes Pull-down assay � Princípio semelhante a imunoprecipitação, exceto que o agente utilizado não é um anticorpo � Prey protein: “presa”, proteína alvo � Bait protein: “isca” proteína utilizada para captura da presa Pull-down assay Pull-down assay Pull-down assay Pull-down assay Pull-down assay Pull-down assay Far-western blot � Variação da técnica de western blot em que a detecção é realizada com uma proteína marcada � Técnica para testar interações entre proteínas � Mais utilizado em screening inicial Western blot - detecção 1. Ligação do anticorpo primário na proteína de interesse 2. O anticorpo secundário conjugado com enzima liga no anticorpo primário 3. A enzima converte o substrato em produto Far-western blot - detecção Biotina Streptavidina Peroxidase EMSA � Electrophoretic Mobility Shift Assay � Análise de mudança de mobilidade eletroforética � Técnica para estudo da interação entre proteínas e ácidos nucléicos � Fatores de transcrição EMSA
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