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Métodos Bioquímicos E Moleculares Em Farmacologia

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Métodos bioquímicos e 
moleculares em farmacologia
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós-graduação em Farmacologia 
Santa Maria, Novembro de 2010
Prof. Mauro Oliveira
� Data de criação: 11/01/2008
� Instituição multicampi localizada no pampa gaúcho
� Reitora: Profª Maria Beatriz Luce
� Vice-reitor: Prof Norberto Hoppen
� Sites: http://www.unipampa.edu.br/portal/
http://porteiras.unipampa.edu.br/itaqui/
http://cursos.unipampa.edu.br/cursos/ppgbioq/
Localização dos Campi da Unipampa
Unipampa – Campus Itaqui
Cronograma
� Aula 1 (16/11)
� Apresentação
� Distribuição dos temas para elaboração de projetos
� Preparação avançada de amostras: obtenção, escolha 
dos reagentes, fracionamento subcelular, dosagem de 
proteína
Cronograma
� Aula 2 (17/11)
� Anticorpos: aspectos básicos, produção, escolha
� Detecção de proteínas específicas: western blotting, slot 
blotting
Cronograma
� Aula 3 (18/11)
� Métodos para determinação de interação entre proteínas 
e entre proteínas e ácidos nucléicos - parte 1: 
imunoprecipitação, pull-down assay, far-western blotting, 
análise de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA)
� Métodos para determinação da atividade de proteínas 
envolvidas em vias de sinalização
Cronograma
� Aula 4 (19/11)
� 1) Apresentação dos projetos
� 2) Encerramento
Extração de proteínas
� Rompimento (lise) celular
Extração de proteínas
� Rompimento (lise) celular
� Obtenção do homogenato: suspensão contendo os 
componentes das células e/ou tecidos
Métodos físicos
Métodos químicos (uso de detergentes ou enzimas)
Métodos físicos
� Homogeneização líquida
Dounce
Potter-Elvehjem
Métodos físicos
� Sonicação
� Lise celular por pulsos de ondas de
som de alta-frequência
� Alta eficiência
� Formação de bolhas e
aquecimento da amostra
Métodos físicos
� Ciclos de congelamento e descongelamento (freeze/thaw 
cycles)
� Lise celular por cristais de gelo
� Processo lento
Métodos químicos
� Enzimas: lisozima, glicanases, proteases, etc
� Detergentes
� Iônicos: maior eficácia, risco de desnaturação
� Não-iônicos: menor eficácia, mantém a estrutura e 
atividade das proteínas
Detergentes
Detergentes
Detergentes iônicos
� Detergentes iônicos
� SDS: sodium dodecyl sulfate
� Deoxicolato de sódio: sodium deoxycholate 
(desnaturante médio)
Detergentes não-iônicos
� Detergentes não-iônicos
� CHAPS: 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-
hydroxy-1-propanesulfonate
� Triton X-100: polyethylene glycol p-(1,1,3,3-
tetramethylbutyl)-phenyl ether
� NP-40: nonyl phenoxyl polyethoxylethanol
Extração de proteínas
� Tampões: PBS, HEPES, Tris-HCl, Imidazol, Glicina, 
MOPS, MES, etc
� Agentes redutores: DTT, β-Mercaptoetanol, L-Cisteína, 
ácido ascórbico, glutationa reduzida, etc
� Quelantes: EDTA, EGTA, desferroxamina, etc
� Sacarose, sais, etc
Extração de proteínas
� Inibidores de proteases
Inibidores de proteases
Extração de proteínas
� Inibidores de proteases e fosfatases
Inibidores de fosfatases
Extração de proteínas
� Exemplos de soluções de extração:
� RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer):
- Útil para homogenato total, membrana, núcleo, 
mitocôndria
- Não-recomendado para imunoprecipitação/pulldown 
assay
150 mM NaCl
1.0% NP-40 ou Triton X-100
0.5% deoxicolato de sódio
0.1% SDS
50 mM Tris, pH 7.6
Extração de proteínas
� Exemplos de soluções de extração:
� Nonidet-P40 (NP40) buffer: útil para homogenato total, 
membrana, menos desnaturante que o RIPA
� Tris-HCl buffer: útil para proteínas citosólicas solúveis
150 mM NaCl
1.0 % NP-40 ou Triton X-100
50 mM Tris, pH 7.6
20 mM Tris-HCl, pH 7.5
Coquetel de inibidores de proteases e 
fosfatases
Extração de proteínas
� Qual método/solução escolher?
� Eficiência e reprodutibilidade
� Tempo e custo
� Estabilidade do alvo
Extração de proteínas - questões
1) Qual o volume/número das amostras? 
2) As células do tecido em questão são rompidas 
facilmente? 
3) Qual o grau de lise requerido?
4) Qual a estabilidade da proteína/estrutura de interesse?
5) Que métodos de análise serão utilizados depois?
Preparação da amostra
� Trabalhar com frações enriquecidas na(s) proteína(s) 
de interesse
Preparação da amostra
� Trabalhar com frações enriquecidas na(s) proteína(s) 
de interesse
Fracionamento subcelular
Preparação da amostra
� Centrifugação: método mais utilizado para fracionamento 
subcelular
� Centrifugação diferencial
� Centrifugação de gradiente de equilíbrio de densidade
Preparação da amostra
Centrifugação diferencial
Centrifugação de gradiente de equilíbrio de 
densidade
� Sacarose: 20-70 %, com incrementos de 10 %
� Percoll: menos tóxico
� Ficoll
� Cloreto de césio
Centrifugação de gradiente de equilíbrio de 
densidade
Centrifugação de gradiente de equilíbrio de 
densidade
Centrifugação de gradiente de equilíbrio de 
densidade
Fracionamento subcelular
Preparação da amostra
� Dosagem de proteína total
Ajuste da quantidade de proteína a ser utilizada
Quantidade ideal para cada método
Preparação da amostra
� Métodos colorimétricos:
- Bradford (azul de Coomassie)
- Lowry
- Ácido bicinconínico (BCA)
Método de Bradford
� Bradford, 1976 (Anal. Biochem. 72:248-254)
� "A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of 
Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of 
Protein-Dye Binding"
� Azul de Coomassie
� Leitura em 595 nm
Método de Bradford
Método de Bradford
� Reagente estável (12 meses)
� Desenvolvimento de cor muito rápido
� Compatível com agentes redutores e agentes quelantes 
� Método confiável para concentrações de proteínas 
entre 100 e 1,500 µg/mL
Método de Bradford
Método de Bradford
� Interferência com detergentes
� Incompatível com proteínas insolúveis em meio ácido
� Maior variabilidade entre as proteínas usadas como 
padrão
Método de Bradford
Método de Bradford - interferentes
Método de Lowry
� Lowry et al., 1951 (J. Biol. Chem. 193, 76-85)
� "Protein Measurement With the Folin Phenol Reagent"
� Leitura em 750 nm
� Temel, et al., 2003
(J. Biol. Chem. 278, 4792-4799)
Método de Lowry
Método de Lowry
Método de Lowry
� Reagente estável sob refrigeração
� Desenvolvimento de cor mais lento (30 min ideal)
� Menos compatível com agentes redutores, detergentes 
e agentes quelantes e Tris
Método de Lowry
� Método confiável para concentrações de proteínas 
entre 5 e 2,000 µg/mL
� Menor variabilidade entre as proteínas que o método de 
Bradford
Método de Lowry
Método de Lowry - interferentes
Método do ácido bicinconínico (BCA)
� Smith et al., 1985 (Anal. Biochem. 150, 76-85)
� "Measurement of protein using bicinchoninic acid"
� Leitura em 562 nm
Método do ácido bicinconínico (BCA)
Método do ácido bicinconínico (BCA)
Método do ácido bicinconínico (BCA)
� Desenvolvimento de cor mais lento (30 min ideal)
� Compatível concentrações mais altas de detergentes, menos 
compatível com agentes redutores
� Método confiável para concentrações de proteínas entre 20 
e 2,000 µg/mL
� Menor variabilidade entre as proteínas que o método de 
Bradford, similar ao método de Lowry
Método do ácido bicinconínico (BCA)
Método do ácido bicinconínico (BCA)-
interferentes
Bradford Lowry BCA
Bradford Lowry BCA
Dia 2 – 17/11
� Anticorpos: aspectos básicos, produção, escolha
� Detecção de proteínas específicas: western blotting, 
slot blotting
� Métodos para determinação de interação entre 
proteínas e entre proteínas e ácidos nucléicos - parte 1: 
imunoprecipitação, pull-down assay
� São proteínas (imunoglobulinas) produzidas em resposta a 
um antígeno, que tem alta afinidade por este antígeno
Anticorpos
Emil von Behring
Baron Kitasato Shibasaburō
1890
Antitoxina da difteria
Anticorpos
Anticorpos
� Gamaglobulinas ou imunoglobulinas
Anticorpos - estrutura
Anticorpos
Anticorpos - estrutura
Anticorpos
Susumu Tonegawa
1978
Descoberta do mecanismo 
genético que produz a 
imensa variabilidade das 
imunoglobulinas 
Recombinação somática
Recombinação somática
Remoção de segmentos D e J
Remoção de segmentos V e D
Recombinação de segmentos V e DJ
Recombinação de segmentos D e J
Segmentos de V, D e J
Novo gene (contendo segmento que codifica a 
região variável e a região constante)
� IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 
� Diferentes papéis na resposta imune
� Diferenças quanto a estrutura e funções
Classes de anticorpos
Classes de anticorpos
Produção de anticorpos
Produção de anticorpos
� Harlow e Lane, 1988 - Antibodies: A Laboratory Manual
� Roteiro básico:
- Preparação do antígeno
- Injeção do antígeno em animal
- Extração e purificação dos anticorpos
Produção de
anticorpos
� Policlonais
Produção de anticorpos
� Monoclonais
Anticorpos policlonais
� Menor custo: tecnologia mais simples, requer menos 
tempo e capacitação técnica para produção
� Ligação em múltiplos epítopos: 
- Facilidade para detectar 
baixo níveis do antígeno
- Menos sensível à mudanças
pós-traducionais
- Reatividade cruzada
- Variabilidade entre os lotes
Vantagens Desvantagens
Anticorpos monoclonais
� Maior custo: tecnologia mais refinada, requer mais 
tempo e capacitação técnica para produção
� Ligação em um único epítopo: 
- Baixíssima variabilidade
entre os lotes
- Menor reatividade cruzada
- Mais sensível à mudanças
pós-traducionais
- Dificuldade para detectar 
baixo níveis do antígeno
Vantagens Desvantagens
Anticorpos primários X secundários
Marcação de anticorpos
� Enzimas
� Fluoróforos
� Biotina
Anticorpos
� Que quantidade usar?
Diluição ideal para cada método
Constante de afinidade
Acesso quantidade do epítopo
Método de detecção
Anticorpos - que quantidade usar?
� Western blotting, slot blotting: 1:100 - 1:1000
� Imunoprecipitação: 1-2 µg por 100-500 µg de proteína 
total
� Imunohistoquímica: 1:50 - 1:500
Western blot
� Método para detecção de proteínas específicas
� Edwin Southern: invenção do método
para detecção de DNA
� W. Neil Burnette, 1981
“Western blotting”
Eletroforese em gel
� Técnica de separação de moléculas que envolve a 
migração de partículas em um determinado gel durante a 
aplicação de uma diferença de potencial
� A técnica de eletroforese mais utilizada para separação 
de proteínas é o SDS-PAGE
Sodium Dodecyl Sulfate – PoliAcrylamide Gel Electrophoresis
Eletroforese em gel
Gel de poliacrilamida (PAG)
� Gel formado por um polímero de acrilamida e bis-acrilamida
� Termo-estável, transparente, resistente
relativamente inerte e que pode ser
preparado com diversos tamanhos
dos poros
SDS-PAGE
� Quanto maior a porcentagem de
acrilamida/bis-acrilamida,
menor o tamanho dos poros
� Determinar a porcentagem ótima
do gel é um dos passos
mais importantes
Gel de poliacrilamida (PAG)
� Tris: tampão
� Acrilamida/bis-acrilamida: substratos para polimerização
� SDS: manter condição desnaturante
� Persulfato de amônio: iniciador
� TEMED: (N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina): cross-linker
Gel de poliacrilamida (PAG)
Gel de poliacrilamida (PAG)
Gel de poliacrilamida (PAG)
Padrão de peso molecular
� Solução de proteínas com diversos pesos moleculares
Padrão de peso molecular
Loading buffer
� Solução utilizada para “carregar” a amostra no gel
� SDS-PAGE: para condições desnaturantes e redutoras o 
mais usado é a solução de Laemmli
� Laemmli UK, August 1970: "Cleavage of structural 
proteins during the assembly of the head of 
bacteriophage T4". Nature 227 (5259): 680–685.
� 169651 citações 
Loading buffer
� Laemmli 2X buffer:
� Adicionado na amostra na proporção 2:1
4% SDS
10% 2-mercaptoehtanol
20% glycerol
0.004% bromophenol blue
0.125 M Tris-HCl pH 6.8
Loading buffer
� SDS: uniformizar a carga elétrica total da proteína
� Carga elétrica total proporcional ao peso molecular da 
proteína
Loading buffer
� Azul de bromofenol: visualização da migração da 
amostra durante a eletroforese
Transferência
� Passagem das proteínas do gel para a membrana de 
nitrocelulose ou PVDF
Transferência
Membranas
Membranas
� Hidrofóbica
� Maior resistência
� 100 - 300 µg/cm2
� Maior custo
� Hidrofílica
� Menor resistência
� 80 - 100 µg/cm2
� Menor custo
NitrocelulosePVDF
Transferência
� Controle da eficiência: coomassie (gel – irreversível)
Transferência
� Controle da eficiência: ponceau S (membrana -
reversível)
Bloqueio da membrana
� Evitar ligação inespecífica dos anticorpos na membrana
� Albumina bovina 5 %
- Maior custo
� Leite desnatado 5 %
- Menor custo
- Não indicado para detecção de proteínas fosforiladas
Detecção da proteína
1. Ligação do anticorpo primário na proteína de interesse
2. O anticorpo secundário conjugado com enzima liga no anticorpo primário
3. A enzima converte o substrato em produto
Detecção da proteína
Controles utilizados em Western blot
� Controle do carregamento (loading): para garantir que 
todas as linhas do gel contém a mesma quantidade de 
proteína
� Exemplos:
- GADPH (37 kD)
- tubulina (55 kD)
- beta actina (43 kD)
- Na+,K+-ATPase alfa (110-113 kD)
- citocromo oxidase 4 (16 kD) 
Controles utilizados em Western blot
� Controle positivo: lisato proveniente de tecido ou célula 
que expressa com certeza a proteína que está sendo 
detectada
� Controle negativo: lisato proveniente de tecido ou célula 
que NÃO expressa com certeza a proteína que está 
sendo detectada
� Ausência de anticorpo primário: controle de ligação 
inespecífica
Peptídeos de bloqueio
� Normalmente é o mesmo epítopo utilizado para 
desenvolvimento/fabricação do anticorpo
� Utilizado para testar a possibilidade de ligação 
inespecífica entre o anticorpo primário e a membrana 
ou outras proteínas
� Protocolo: incubação prévia do anticorpo primário com 
o peptídeo de boqueio (5 X a quantidade do anticorpo)
Peptídeo
de bloqueio
Lane 1 : HeLa cell extract at 10ug/lane
Lane 2 : HeLa cell extract at 10ug/lane with 16 ug blocking peptide
Lane 3 : HeLa cell extract at 10ug/lane. Goat anti Rabbit HRP control 
Slot blot
� Simplificação do método de western blot
� Imobilização das proteínas diretamente nas 
membranas de nitrocelulose ou pvdf
� Vantagens: mais rápido, menor custo
� Desvantagens: pouca especificidade
Slot blot
Slot blot
Cronograma
� Aula 3 (18/11)
� Métodos para determinação de interação entre proteínas 
e entre proteínas e ácidos nucléicos:
� Imunoprecipitação, pull-down assay, far-western blotting, 
análise de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA)
Imunoprecipitação
� Técnica utilizada para isolamento/purificação de proteínas 
utilizando anticorpos e resinas de alto peso molecular
� Co-imunoprecipitação: determinação da interação entre 
proteínas
Imunoprecipitação
Resinas utilizadas em imunoprecipitação
Resina contendo agarose e proteína A, G, A/G ou L
Resinas utilizadas em imunoprecipitação
Resinas utilizadas em imunoprecipitação
Resinas utilizadas em imunoprecipitação
S= strong (forte) W= weak (fraco) NB+ no binding (não liga)
Co-imunoprecipitação
Co-imunoprecipitação
Co-imunoprecipitação
Co-imunoprecipitação
Biotinilação de proteínas 
� Marcação (tagging) de proteínas com biotina (vitamina H)
Biotinilação de proteínas 
� Interação entre biotina e avidina ou streptavidina
Kd = 10-15 M
métodos de imunoprecipitação 
e purificação de proteínas
Biotinilação de proteínas 
� Reação com grupos amino primários de proteínas
� Principais reagentes de biotinilação de proteínas:
- N-hydroxysuccinimide (NHS) esters
- N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) esters
Biotinilação de proteínas
Biotinilação de proteínas
Biotinilação de superfície
Biotinilação de superfície
Biotinilação de superfície
Biotinilação de superfície
Biotinilação de superfície
Figure 6. Immunoblot indicates that Arc is required for the decrease in surface AMPARs after short-
term monocular deprivation.
Interação entre proteínas 
� Interações físicas entre proteínas levam a uma série de 
alterarações nas suas propriedades 
� Alterações nas propriedades cinéticas das enzimas 
(mudança na afinidade por substratos ou regulação 
alostérica)
� Mudanças na constante de afinidade receptores por 
seus ligantes 
Pull-down assay 
� Princípio semelhante a imunoprecipitação, exceto que o 
agente utilizado não é um anticorpo
� Prey protein: “presa”, proteína alvo
� Bait protein: “isca” proteína utilizada para captura da presa
Pull-down assay 
Pull-down assay 
Pull-down assay 
Pull-down assay 
Pull-down assay 
Pull-down assay 
Far-western blot
� Variação da técnica de western blot em que a detecção é 
realizada com uma proteína marcada
� Técnica para testar interações entre proteínas
� Mais utilizado em screening inicial
Western blot - detecção
1. Ligação do anticorpo primário na proteína de interesse
2. O anticorpo secundário conjugado com enzima liga no anticorpo primário
3. A enzima converte o substrato em produto
Far-western blot - detecção
Biotina
Streptavidina Peroxidase
EMSA
� Electrophoretic Mobility Shift Assay
� Análise de mudança de mobilidade eletroforética
� Técnica para estudo da interação entre proteínas e 
ácidos nucléicos
� Fatores de transcrição
EMSA

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