Relatorio_6_Biofísica

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UNIVERSIDADE VILA VELHA - UVV
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
CAROLINA PERIN MOTTA
EDER LACERDA DE BARROS
ROBERTO ROMEU DE SOUZA
RODOLFO FIRME CARLETTO
SILVANA EVANGELISTA ROCHA
Prática n° 05 (10/06/14):
	
EFEITO DA OSMOLARIDADE DO MEIO SOBRE A INTEGRIDADE DAS HEMÁCIAS
Disciplina: Biofísica
Professora: Maria de Fátima M. F. Cardoso 
VILA VELHA – ES 
JUNHO– 2014/1
CAROLINA PERIN MOTTA
EDER LACERDA DE BARROS
ROBERTO ROMEU DE SOUZA
RODOLFO FIRME CARLETTO
SILVANA EVANGELISTA ROCHA
	
EFEITO DA OSMOLARIDADE DO MEIO SOBRE A INTEGRIDADE DAS HEMÁCIAS
Relatório do Curso de Graduação em Medicina Veterinária apresentado à Universidade Vila Velha-ES, como parte das exigências da Disciplina Biofísica sob orientação da Professora Maria de Fátima M. F. Cardoso
VILA VELHA – ES
JUNHO – 2014/1
SUMÁRIO
	1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................
	 1
	2. OBJETIVOS.................................................................................................................
	 3
	3. MATERIAIS..................................................................................................................
	 4
	4. PROCEDIMENTOS......................................................................................................
	 5
	5. RESULTADOS.............................................................................................................
	 6
	6. DISCUSSÃO................................................................................................................
	13
	7.CONCLUSÃO...............................................................................................................
	15
	8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................
	16
	
	
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INTRODUÇÃO
Uma solução consiste em uma mistura de elementos. Como toda solução é constituída por soluto e solvente, muitas moléculas ao se dissolverem, sofrem separação das partículas que a constituem através da ação desse solvente, sejam estas íons, moléculas, ou macromoléculas, como as proteínas, por exemplo. 
A água entra no interior da célula por um fenômeno denominado osmose, que consiste na passagem de solvente, do meio mais diluído (com maior concentração de água) para o meio menos diluído (com maior concentração de soluto). Essa passagem é motivada pela diferença de pressão osmótica (força necessária para resistir à movimentação de água) de cada meio, buscando assim o equilíbrio osmótico. A passagem de soluto é conhecida como difusão. 
Como a água é o solvente natural presente nos organismos vivos, pois estes são compostos por grande quantidade dela, essa separação de partículas pela água é denominada Hidrólise, onde lise significa quebra, e hidro, água. Na maioria dos casos, as partículas ao serem separadas apresentam carga elétrica, sendo denominadas eletrólitos, como é o caso da dissolução do NaCl (cloreto de sódio) em água, formando os íons Na+ e Cl-. Porém, substâncias moleculares não originam íons ao entrarem em contato com a água, pois apenas realizam pontes de hidrogênio com ela.
Segundo HENEINE, 2000, uma consequência direta da hidrólise é que a concentração de partículas é maior que a concentração de moléculas, e é indicada pelo prefixo OS. O osmol é especialmente a sub-unidade, e o miliosmol (mosmol), é muito utilizado na Biologia. A concentração do plasma sanguíneo é em torno de 300 mosmois e equivale à concentração total de partículas, incluindo íons, moléculas ou macromoléculas.
Osmolaridade é a medida do grau que os solutos se dissociam em duas ou mais espécies. Soluções que apresentam osmolaridades iguais são consideradas isotônicas. Soluções com osmolaridades diferentes são consideradas: hipertônicas, quando a osmolaridade do citoplasma da célula é menor que a do meio extracelular; e hipotônicas, quando essa osmolaridade é maior no citosol que no meio externo da célula.
O sangue é formado principalmente por hemácias (ou eritrócitos), leucócitos (células de defesa) e trombócitos (plaquetas, responsáveis pela coagulação sanguínea). As hemácias dão a ele a coloração vermelha, e sofrem lise muito facilmente. A quebra das hemácias presentes no sangue é denominada hemólise.
O Cloreto de Sódio (NaCl), o Cloreto de Potássio (KCl), o Cloreto de Cálcio (CaCl2), o Manitol e a Glucose são muitos utilizados na área médica, como soluções de hidratação administradas de forma intravenosa. Os três primeiros são soluções iônicas, e os dois últimos são soluções moleculares. Deve-se ter o cuidado de administrá-los em osmolaridade adequada, a fim que evitar a ocorrência de hemólise.
Nesse experimento foi utilizado o Manitol, um monossacarídio que exerce efeito osmótico e induz a diurese acentuada. 
OBJETIVOS
O presente experimento tem como objetivos demonstrar o efeito da tonicidade (osmolaridade do meio) sobre a integridade das hemácias, bem como determinar a osmolaridade em que ocorrem 50% de lise celular. 
MATERIAIS
Para a realização do experimento foram necessários os seguintes materiais e substâncias:
Tubos de ensaio;
Suporte para tubos de ensaio;
Caneta para Retroprojetor;
Solução de Manitol a 0,4 M;
Piseta;
Água deionizada;
Béquer de 50 mL;
Pipeta de Pasteur;
Amostra de sangue animal;
Pipetadora automática (micropipeta);
Pipetas graduadas;
Pipetadores de 10 ml e 25 ml;
Pipeta de Pasteur;
Luvas;
Centrífuga;
Aparelho espectrofotômetro.
PROCEDIMENTOS
Este experimento foi realizado em 4 etapas. A primeira consistiu em demarcar 08 tubos de ensaio. Nos tubos de n° 01 a 08 foram adicionados 1 a 8 mLs de Manitol, respetivamente. Em seguida foram adicionados 7 mLs de água deionizada no tubo n° 01, 6 mLs no tubo n° 02, 5 mLs no tubo n° 03, 4 mLs no tubo n° 04, 3 mLs no tubo n° 05, 2 mLs no tubo n° 06, 1 mL no tubo n° 07 e nenhum mL no tubo n° 08. Apresentando então volumes iguais, os tubos foram levados à bancada para receberem adição de sangue animal.
Na segunda etapa do procedimento foram adicionadas duas gotas (0,1 mL) de sangue animal em cada tubo. Com o auxílio de luvas os tubos foram homogeneizados e deixados em repouso por 10 minutos. 
Após o repouso, na terceira etapa do procedimento, os tubos foram levados à centrífuga, em rotação de 2.500 rpm, por 5 minutos. 
Após a rotação, os tubos seguiram para a quarta etapa do procedimento, que consistiu em transferir cuidadosamente o sobrenadante de cada tubo para as cubetas do aparelho Espectrofotômetro, calibrado com água deionizada no comprimento de onda (λ) igual a 540 nm, a fim de realizar a leitura das absorbâncias das amostras retiradas do conteúdo de cada tubo. 
RESULTADOS
Para encontrar os resultados, foi necessária a realização de cálculos. Estes consistiram em calcular as concentrações osmolares e as pressões osmóticas das soluções utilizadas neste experimento, após dilução. 
O início dos cálculos se deu a partir da seguinte equação:
 Vi.Mi = Vƒ.Mƒ
, onde Vi é o volume inicial da solução (em mL), Mi é a molaridade inicial da solução (em M), Vƒ é o volume final da solução (em mL) e Mƒ é a molaridade final da solução (em M).
Esses cálculos foram realizados para cada tubo. Em seguida, foram realizados os cálculos para obtenção dos valores de osmolaridade, dados pela seguinte equação:
Osmolaridade = g . c
, onde Osmolaridade corresponde ao número de partículas (em oms/L), g é o número de partículas em solução (em osm/mol),e c é a concentração (em mol/L).
Essa segunda etapa de cálculos foi realizada para cada tubo. Em seguida, foram realizados os cálculos para obtenção dos valores de pressão osmótica, dados pela seguinte equação de van’t Hoff:
π = g . c . R.T
, onde π representa a pressão osmótica (em atm), g é o número de partículas em solução (em osm/mol), c é a concentração (em mol/L), R é a constante de gases, que nesse caso corresponde à 0,082 L (em atm/mol.K), e T é a temperatura (em K).
A substância reagente utilizada para todo o experimento foi o Manitol. Seguem abaixo os cálculos realizados para cada tubo.
Tubo n° 01: 
1° Cálculo: Molaridade final: Vi.Mi = Vƒ.Mƒ
1 mL . 0,4 mL = 8 mL . Mƒ
Mƒ = 1 mL . 0,4 mL = 0,05 M
 8 mL
2° Cálculo: Osmolaridade: Osmolaridade = g . c
Osmolaridade = g . c
Osmolaridade = 1 . Mƒ = 1 . 0,05 = 0,05 osm/L
3° Cálculo: Pressão Osmótica: π = g . c . R.T
Antes de realizar esse cálculo, é necessária a conversão da temperatura de Celsius (°C) para Kelvin (K). A temperatura ambiente observada no laboratório era de 28 °C durante a realização do experimento. Para tal, utilizou-se a seguinte equação:
TK = T°C + 273 = 28 + 273 = 301K
Tem-se então o cálculo da pressão osmótica para o tubo n° 01:
π = 1 . 0,05 . 0,082. 301 = 1,2341 atm
Tubo n° 02: 
1° Cálculo: Molaridade final: Vi.Mi = Vƒ.Mƒ
2 mL . 0,4 mL = 8 mL . Mƒ
Mƒ = 2 mL . 0,4 mL = 0,1 M
 8 mL
2° Cálculo: Osmolaridade: Osmolaridade = g . c
Osmolaridade = 0,1. Mƒ = 1 . 0,1 = 0,1 osm/L
3° Cálculo: Pressão Osmótica: π = g . c . R.T
π = 1 . 0,1 . 0,082. 301 = 2,4682 atm
Tubo n° 03: 
1° Cálculo: Molaridade final: Vi.Mi = Vƒ.Mƒ
3 mL . 0,4 mL = 8 mL . Mƒ
Mƒ = 3 mL . 0,4 mL = 0,15 M
 8 mL
2° Cálculo: Osmolaridade: Osmolaridade = g . c
Osmolaridade = 1 . Mƒ = 1 . 0,15 = 0,15 osm/L
3° Cálculo: Pressão Osmótica: π = g . c . R.T
π = 1 . 0,15 . 0,082. 301 = 3,7023 atm
Tubo n° 04: 
1° Cálculo: Molaridade final: Vi.Mi = Vƒ.Mƒ
4 mL . 0,4 mL = 8 mL . Mƒ
Mƒ = 4 mL . 0,4 mL = 0,2 M
 8 mL
2° Cálculo: Osmolaridade: Osmolaridade = g . c
Osmolaridade = 1 . Mƒ = 1 . 0,2 = 0,2 osm/L
3° Cálculo: Pressão Osmótica: π = g . c . R.T
π = 1 . 0,2 . 0,082. 301 = 4,9364 atm
Tubo n° 05: 
1° Cálculo: Molaridade final: Vi.Mi = Vƒ.Mƒ
5 mL . 0,4 mL = 8 mL . Mƒ
Mƒ = 5 mL . 0,4 mL = 0,25 M
 8 mL
2° Cálculo: Osmolaridade: Osmolaridade = g . c
Osmolaridade = 1 . Mƒ = 1 . 0,25 = 0,25 osm/L
3° Cálculo: Pressão Osmótica: π = g . c . R.T
π = 1 . 0,25 . 0,082. 301 = 6,1705 atm
Tubo n° 06: 
1° Cálculo: Molaridade final: Vi.Mi = Vƒ.Mƒ
6 mL . 0,4 mL = 8 mL . Mƒ
Mƒ = 6 mL . 0,4 mL = 0,3 M
 8 mL
2° Cálculo: Osmolaridade: Osmolaridade = g . c
Osmolaridade = 1 . Mƒ = 1 . 0,3 = 0,3 osm/L
3° Cálculo: Pressão Osmótica: π = g . c . R.T
π = 1 . 0,3 . 0,082. 301 = 7,4046 atm
Tubo n° 07: 
1° Cálculo: Molaridade final: Vi.Mi = Vƒ.Mƒ
7 mL . 0,4 mL = 8 mL . Mƒ
Mƒ = 7 mL . 0,4 mL = 0,35 M
 8 mL
2° Cálculo: Osmolaridade: Osmolaridade = g . c
Osmolaridade = 1 . Mƒ = 1 . 0,35 = 0,35 osm/L
3° Cálculo: Pressão Osmótica: π = g . c . R.T
π = 1 . 0,35 . 0,082. 301 = 8,6387 atm
Tubo n° 08: 
Não foi necessária a realização do primeiro cálculo para o tubo n° 08, uma vez que contém 8 mL de Manitol de molaridade conhecida, ou seja, 0,4 M.
2° Cálculo: Osmolaridade: Osmolaridade = g . c
Osmolaridade = 1 . Mƒ = 1 . 0,4 = 0,4 osm/L
3° Cálculo: Pressão Osmótica: π = g . c . R.T
π = 1 . 0,4 . 0,082. 301 = 9,8728 atm
Segue abaixo os valores dos resultados encontrados:
	Tubos n°
	Concentração (Osm)
	Pressão Osmótica
(atm)
	Absorbância
(em λ igual a 540 nm)
	01
	0,05
	1,2341
	0,729
	02
	0,1
	2,4682
	0,716
	03
	0,15
	3,7023
	0,712
	04
	0,2
	4,9364
	0,654
	05
	0,25
	6,1705
	0,551
	06
	0,3
	7,4046
	0,322
	07
	0,35
	8,6387
	0,264
	08
	0,4
	9,8728
	0,258
Ao fim dos cálculos, foi elaborado o gráfico abaixo, relacionando a Absorbância e a Osmolaridade (concentração) da solução, para melhor observar a variação de comportamento entre as soluções dos tubos.
DISCUSSÃO
LEHNINGER, 1984, relata que quando uma célula em equilíbrio osmótico com seu meio circundante (ou seja, em um meio isotônico) é transferida para uma solução hipertônica ou hipotônica, a água se movimenta através da membrana plasmática na direção que tende a equalizar a osmolaridade do lado de fora e do lado de dentro da célula. 
O sangue utilizado no experimento foi retirado de um mamífero, da espécie canina. As gotas de sangue, ao entrarem em contato com a solução contendo água deionizada (solvente) e solução de manitol (soluto), apresentaram comportamentos distintos, de acordo com as concentrações de solvente e soluto presentes em cada tubo. 
O sangue foi adicionado às soluções em estado normal, ou seja, íntegro. Após ser adicionado às soluções, e estas sofrerem homogeneização e repouso por 10 minutos, os tubos foram levados à centrífuga para que o plasma sanguíneo fosse separado das hemácias. 
As soluções podem ser hipertônicas, hipotônicas ou isotônicas em relação às hemácias. Em soluções com presença de sangue, as hipertônicas apresentam forte coloração avermelhada, devido ao grau de hemólise ocorrido, enquanto as hipotônicas apresentam-se bem menos coradas. Os tubos com maior concentração de água e menor concentração de manitol (n°s 01, 02, 03, 04 e 05) apresentaram coloração bastante avermelhadas, sendo o n° 01 o que apresentou coloração mais marcante. Já os tubos de n°s 06, 07 e 08 apresentaram coloração predominantemente transparente, com pequenos pontos vermelhos dispersos, sendo o de n° 07 o que apresentou maior transparência.
O manitol é um monossacarídio (açúcar), e uma solução molecular, covalente, que em contato com a água realiza interações moleculares do tipo ligações de hidrogênio entre suas hidroxilas e as moléculas de água. Essa solução, em concentração adequada, é isotônica em relação às hemácias. 
O manitol é um diurético osmótico excretado pelos rins, que age impedindo a absorção tubular de água e potencializando a excreção de sódio e cloreto, elevando para tal a osmolaridade do filtrado glomerular. Esse aumento da osmolaridade extracelular provocado pelo manitol induz um movimento de água intracelular para o meio extracelular e vascular. 
No início do experimento todas as hemácias estavam em condições hipertônicas, ou seja, crenadas, e com a homogeneização, repouso e principalmente centrifugação, saíram dessas condições para as condições hipotônicas. 
A comprovação das condições das hemácias em solução se deu de três maneiras ao longo do experimento: através dos cálculos; através da análise visual dos tubos (quanto mais transparente a coloração, menor o índice de hemólise. Para isso também foi medida a absorbância das soluções de cada tubo) e através do conhecimento a concentração ideal de manitol para que não ocorra hemólise, mantendo-se assim hemácias em condições isotônicas com o meio extracelular. 
Segundo HENEINE, 2000, o equilíbrio interno dos mamíferos ocorre com pouca diferença de pressão osmótica entre os compartimentos intra e extracelulares. A pressão de 0,3 osm corresponde à aproximadamente 7 atmosferas, e esta, em geral, é a pressão do plasma e de outros compartimentos corporais desses animais.
Em consulta à bula da solução de manitol (anexa), observa-se que a concentração ideal desta para administração humana é de 20%, com osmolaridade igual a 1098 mosmol/L, ou seja, 20 g de manitol por 100 ml de água.
O tubo de n° 06, contendo solução de osmolaridade igual a 0,3 osm/L, e pressão osmótica igual a 7,4046 atm foi o que se comportou de forma mais isotônica em relação às hemácias, valores estes que conferem com os citados acima, extraídos de HENEINE, 2000, para pressão osmótica do plasma sanguíneo de mamíferos.CONCLUSÃO
Ao final dos experimentos foi possível perceber que os objetivos dos testes foram atingidos. As hemácias presentes nos tubos com coloração fortemente avermelhada, e que continham grande quantidade de água, sofreram hemólise, e as soluções apresentaram maiores valores para absorbância e menores valores para pressão osmótica. Já as hemácias presentes nos tubos com concentrações de manitol próximas à ideal para suas condições isotônicas não sofreram hemólise, e apresentaram menores valores para absorbância e maiores valores para pressão osmótica. Foi possível notar que as três condições de aferição do experimento apresentaram-se em sintonia umas com as outras, o que comprovou que os objetivos do experimento foram atingidos. 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
HENEINE, Ibrahim F. Biofísica Básica. São Paulo: Atheneu, 2000.
KANEKO, Jiro J.; HARVEY, John W.; BRUSS, Michael L. Clinical Biochemistry of Domestic Animals. 6 ed. USA: Elsevier Academic Press Publications, 2008.
NELSON, David L.; COX, Michael M. LEHNINGER, Albert Lester. Lehninger Princípios de Bioquímica. 4 ed. São Paulo: Sarvier, 2006. 
Bula de Solução de Manitol 20% - Baxter. Disponível em: http://www.latinoamerica.baxter.com/brasil/images/br/pdf/bula_manitol.pdf. Acesso em 16/06/2014 às 20:43h.
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Gráf1
		0.729
		0.716
		0.712
		0.654
		0.551
		0.322
		0.264
		0.258
Absorbância x Concentração
Concentração (Osm)
Absorbância (em 540nm)
Plan1
		Concentração (osm)		Absorbância x Concentração
		0.05		0.729
		0.1		0.716
		0.15		0.712
		0.2		0.654
		0.25		0.551
		0.3		0.322
		0.35		0.264
		0.4		0.258