relatorio - ESTUDO DAS PROTEÍNAS

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Faculdade de Ciências e Tecnológico 
Licenciatura em Engenharia Química Biológica 
Bioquímica 
 
 
Relatório: ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO DAS PROTEÍNAS 
 
 
 
 
 
 
Discentes: Docente: 
Ângela Carvalho Denise Colito 
Emeline Barbosa 
 
 
 
Praia 16/11/2017 
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Índice 
 
Resumo…………………………………………………………………………………2 
Fundamento teórico…………………………………………………………………….2 
Objetivos………………………………………………………………………………..3 
Reagentes……………………………………………………………………………….5 
Parte experimental………………………………………………………………………5 
Reação de Biureto…………………………………………………………………5 
Reação de ninhidrina………………………………………………………………5 
Precipitação acida………………………………………………………………….5 
Efeito de adição de sais……………………………………………………………6 
Efeito de adição de solventes orgânicos…………………………………………...6 
Discussão dos resultados………………………………………………………………..6 
Conclusão………………………………………………………………………………10 
Referencias bibliográficas……………………………………………………………...11 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Resumo 
 
O seguinte trabalho aborda o assunto de caracterização, precipitação e determinação de 
proteínas, em que se utilizam vários métodos experimentais, são eles: Reação do 
Biureto, reação ninhidrina, precipitação por adição de ácidos fortes, precipitação por 
adição de sais, precipitação por solventes orgânicos. Observou-se que os vários métodos 
permitem a deteção de proteínas e aminoácidos, assim como, verificar o comportamento 
de proteínas na presença de soluções salinas, solventes orgânicos e de agentes 
desnaturantes, facilitando assim, o entendimento e funcionamento uma dada proteína. 
Fundamento teórico 
 
Segundo Lehninger as proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células 
vivas. Elas ocorrem em grande variedade, milhares de diferentes tipos, desde peptídeos 
de tamanho relativamente pequeno até enormes polímeros com pesos moleculares na 
faixa de milhões. 
 Cada proteína possui uma quantidade de aminoácidos e uma sequência deles 
diferente e essa característica própria de cada proteína a faz possuir funções 
que são apenas delas. Assim ela possui características específicas, sendo que 
cada proteína possui sua função, carga elétrica, massa molar, solubilidade e 
afinidade por certos compostos, e essas características são próprias de cada 
uma. Isso se faz possível a determinação e caracterização das proteínas. 
((HARVEY, 2006). 
 
A detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações específicas com 
determinados reativos, os quais originam substâncias coloridas que absorvem luz na 
região visível, permitindo a sua quantificação.Dentre os métodos utilizados, situa-se o 
método do biureto, que é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino 
(reativo do biureto), com proteínas e peptídeos. O nome do método provém do fato de 
que a uréia aquecida dará reação positiva, com desprendimento de amônia. 
 
O reativo de biureto é uma solução de sulfato de cobre (CuSO4) e tartarato 
duplo de sódio e potássio (KNaC4H4O6) que ao reagir com os íons cúpricos, 
forma um produto de coloração violáceo. Esse reativo é utilizado na 
identificação de compostos protéicos, pois as ligações existentes na molécula 
de biureto são semelhantes às ligações peptídicas na formação de proteínas 
(VOET, 2006). 
 
A reação do biureto é positiva para proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de 
aminoácidos. A reação é também positiva para substâncias que contêm duas carbonilas 
(-CONH2) ligadas diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogénio. 
Dependendo da complexidade da proteína ou do peptídeo em questão, a cor do produto 
de reação a presença do biureto varia substancialmente: proteínas dão coloração violeta, 
peptídeos dão coloração rosa. Quanto maior for a quantidade de proteínas no meio 
maior será a intensidade de cor. 
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Conforme Lehninger, as proteínas podem sofrer um processo de desnaturação, ou seja, 
perder a sua conformação, já que as ligações fracas responsáveis pelas estruturas 
secundária, terciária e quaternária são rompidas (pontes dissulfeto e/ou ligações de 
hidrogénio e/ou interações hidrofóbicas e/ou pontes salinas), levando à precipitação da 
proteína, perda de sua conformação mais estável e, consequentemente, a perda de sua 
função biológica. Agentes físicos e químicos podem levar a tal situação, como: 
temperatura, solventes orgânicos, altas concentrações salinas, ácidos fortes e agentes 
caotrópicos. 
As substâncias utilizadas para a desnaturação se ligam a cadeia das proteínas e formam 
precipitados. Algumas reações de precipitação que ocorrem são: Precipitação por ação 
do calor; precipitação por adição de ácidos fortes; precipitação por adição de sais de 
metais pesados; precipitação ação de solventes orgânicos. 
 
 A concentração elevada de sais pode remover a água de hidratação das 
moléculas de proteínas, reduzindo sua solubilidade, este efeito é chamado de 
“salting-out”. Ocorre também que em concentração reduzida, os sais aumenta 
a solubilidade de muitas proteínas, este efeito é chamado de “salting-in”, e 
está relacionado a uma diminuição das interações entre grupos carregados de 
moléculas da mesma ou de diferentes proteínas.( VOET, 2006) 
 
É importante realçar que na desnaturação de proteínas somente são rompidas as 
interações fracas, e não as ligações peptídicas, umas vez que essas têm caráter de 
ligação dupla e só são rompidas por ações enzimáticas catalíticas ou em meio 
extremamente ácido (H2SO4 ou HCl concentrados) associado a altas temperaturas. 
Os aminoácidos, componentes de uma proteína podem ser genericamente caracterizados 
se, após sua hidrolise, efetuando a reacão de ninhidrina. Ninhidrina é um produto 
químico usado para a detecção de amónia ou aminas primárias e secundário. 
Segundo Souza e Neves (2007), Ninhidrina é mais comumente usado para detectar 
impressões digitais, como aminas sobram de peptídeos e proteínas aminas (terminal ou 
resíduos de lisina) expelido das impressões digitais reagirem com ninhidrina. A reação 
de Ninhidrina é uma reação corada própria de aminoácidos, por ser um agente oxidante 
muito poderosa, reage com o aminoácido da cadeia, que dá origem a um composto de 
cor púrpura, que varia a cor. O pH da reação Ninhidrina com o aminoácido esta entre 
intervalo de 4 a 8. 
Objetivos 
 
➢ Realizar reação específica para detecção de proteínas (reação de Biureto); 
➢ Realizar reação específica para detecção de aminoácidos; 
➢ Verificar a alteração de solubilidade de proteínas na presença de soluções salinas 
e solvente orgânicos; 
➢ Verificar a acão de agente desnaturantes. 
 
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Reagentes: 
 
➢ Reagentes do Biureto: CuSO4 em solução alcalina; 
➢ Solução diluída de proteínas; 
➢ Solução concentrada de proteínas; 
➢ Solução de ninhidrina 0,1g %( P/V); 
➢ Solução de aminoácidos; 
➢ Acido tricloroacético ( TCA) 10%; 
➢ Solução saturada de sulfato de amónio ( NH4)2SO4; 
➢ Solução tampão de fosfato de sódio 0,2 M, pH 7,0; 
➢ Etanol gelado. 
Procedimento experimental 
 
Reação de Biureto: 
 
1. Tubo 1:( tubo branco): colocou-se 1 mL do reativo do biureto + 0,5 ml de agua 
destilada; 
2. Tubo 2: colocou-se 1 mL do reativo biureto + 0,5 ml da solução diluída de 
proteínas; 
3. Tubo 3: colocou-se 1mL do reativo biureto + 0,5ml da solução de aminoácidos; 
4. Comparou o desenvolvimento da cor nos tubos. 
 
Reação de ninhidrina: 
 
1. Tubo 4: colocou 2 mL de solução de ninhidrina + 0,5 mL de água destilada; 
2. Tubo 5:colocou 2 mL de solução de ninhidrina + 0,5 mL da solução diluída de 
proteínas;3. Tubo 6: colocou 2 mL de solução de ninhidrina + 0,5 mL da solução de 
aminoácidos; 
4. Os 3 tubos foram colocados em banho-maria( 100˚C); 
5. Comparou-se o desenvolvimento da cor nos tubos. 
 
Precipitação ácida: 
 
1. Tubo 7 ( tubo da centrifuga): colocou 1 mL de TCA 10% ( P/V) + 1mL da solução 
diluída de proteínas; 
2. Agitou a solução e em seguida observou-o; 
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3. Centrifugou a solução por 10 minutos, separando as frações sobrenadante e o 
precipitado; 
4. Colocou 0,5 mL do sobrenadante no tubo 8; 
5. Adicionou 1 mL do reativo de biureto ao tubo 8; 
6. Adicionou tampão ao precipitado do tubo 7; 
7. Comparou os resultados. 
 
Efeito de adição de sais: 
 
1. Tubo 9:colocou-se 2 mL da solução diluída de proteínas + 2 mL da solução 
saturada de sulfato de amónia no tubo e depois foi agitado. Centrifugou-se a 
3000rpm por 10 minutos separando as frações sobrenadante e precipitado; 
2. Colocou-se 2 mL de sobrenadante no tubo 10, em seguida adicionou-se igual 
volume de TCA 10%(P/V); 
3. Agitou o tubo e depois colocou-o para centrifugar novamente; 
4. Adicionou 1 mL de tampão ao precipitado do tubo 10 e este foi agitado. 
 
Efeito de adição de solvente orgânico: 
 
1. Tubo 11: colocou-se 1ml da solução de proteínas + 2 ml de etanol gelado( 
lentamente até o aparecimento de uma ligeira turvação 
Discussão dos resultados 
 
Reação de biureto 
 
A reacão de biureto serve para detectar a presença de ligações peptídicas, dando 
positivo para proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos. A reação 
é também positiva para substâncias que contem dois carbonilas (-CONH2) ligadas 
diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogénio. 
O reagente de biureto com sulfato de cobre possui coloração azul. Se o cobre forma um 
complexo com os aminoácidos, estabelecendo interações com os átomos de nitrogénio 
da cadeia peptídica, obtém coloração violeta. Quanto maior for à quantidade de 
proteínas, maior será a intensidade da cor.(SOUSA e NEVES, 2007) 
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Figura 1- Ligação do cobre com o nitrogénio da cadeia peptídica 
 
Fonte:http://www.fcfar.unesp.br 
Nos 3 tubos utilizados, observou-se que as 3 soluções adquiram coloração diferente. O 
tubo 1 ( biureto + agua destilada), adquiriu uma coloração azul clara, o que leva a 
concluir que não ocorreu a reação (resultado negativo), uma vez que a água destilada 
não tem componentes de proteínas na sua composição. 
Contudo, no tubo 2 ( biureto+solução diluída de proteínas) adquiriu uma coloração azul 
violeta, e pode-se concluir que este coloração se deve ao fato de existir ligações 
peptídicas nas proteínas( resultado positivo). Já no tubo 3( biureto+ solução de 
aminoácidos) adquiriu uma coloração azul mais escuro que o tubo 1 devido ao fato de 
não existir ligações peptídicas na solução (resultado negativo). 
 
Figura 2-Soluções resultantes da reação do biureto; 
 
Reação de ninhidrina 
Esta reação é utilizada para verificar a presença de aminas em solução, dando positivo 
para peptídeos, aminoácidos, aminas primárias e amónia. 
Na reação da ninhidrina, o aquecimento da solução de proteínas provoca mudança na 
estrutura tridimensional do peptídeo. A ninhidrina, então, reage com o grupo amina 
presente nos aminoácidos, formando como produto final um complexo de coloração 
púrpura. Com a prolina e a hidroxiprolina, que são iminoácidos, forma-se um produto 
de coloração amarelada.(ZAIA, 1998). 
Após o aquecimento de ambos os tubos de ensaio, observou-se que o tubo1( solução de 
ninhidrina + agua destilada) permaneceu incolor, isto, devido ao facto da água não 
apresentar aminoácidos na sua composição(resultado negativo). 
Nos restantes tubos, ambos adquiriram uma coloração púrpura, sendo esta mais intensa 
no tubo 6. 
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Tendo em vista que tanto as soluções de aminoácidos quanto da proteína foram 
utilizadas com o mesmo volume, a diferença na intensidade da coloração de ambas as 
amostras deve-se a maior superfície de contato do aminoácido (glicina) que contém uma 
maior quantidade de grupos amina disponíveis para reação. Porém, isso não ocorre com 
a proteína em função da presença de ligações peptídicas entre seus aminoácidos, 
diminuindo assim, sua superfície de contato. 
 
Figura 3-Soluções resultantes da reação de ninhidrina. 
Precipitação ácida 
 
Após adicionar 1ml de TCA 10%(P/V) à 1 mL da solução diluída de proteínas e 
homogeneizar, obteu-se uma solução de cor turva indicando a formação de precipitado. 
Depois da centrifugação, foi possível identificar o precipitado esbranquiçado e viscoso 
grudado no fundo do tubo e o sobrenadante incolor. 
Ocorreu este precipitado, uma vez que ácidos fortes como o ácido tricloroacético 
(TCA), desnaturam as proteínas, precipitando-as, ou seja, o fato de se adicionar ácido 
tricloroacético à solução de proteínas, reduz o pH do meio, tornando positiva a carga da 
proteína, o que contribui para a formação de um complexo insolúvel – o tricloroacetato 
de proteína. 
“Valores extremos de pH afetam bruscamente a estrutura das proteínas, causando uma 
mudança radical na conformação da proteína para um estado conformacional 
biologicamente inativo. ” (VOET, 2006) 
 
Efeito de adição de sais 
 
Após adicionar 2 mL de solução saturada de sulfato de amónia à 2 mL de proteínas 
(tubo 9) e homogeneizar observou-se pequenos precipitados semelhante a fios brancos 
na solução. Depois da centrifugação, foi possível observar o precipitado esbranquiçado 
que se encontrava no fundo do tubo e o sobrenadante incolor. 
O sulfato de amónia, na solução de proteína, dissocia-se em seus iões, e altera as 
características estruturais das proteínas fazendo com que as mesmas percam a 
capacidade de se tornarem solúveis, e assim sendo, na presença destes, as proteínas 
precipitam (sem que ocorra a sua desnaturação). (ZAIA, 1998) 
No procedimento de precipitação de proteínas por adição de sais (efeito da força iónica), 
deve-se verificar o efeito da concentração destes sais na solubilidade da proteína. 
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Segundo Voet (2006), quando sais neutros são adicionados ao sistema ocorre um 
aumento da força iónica do sistema. Os íons carregados provenientes da dissociação dos 
sais passam a interagir com as moléculas proteicas, diminuindo a interação entre as 
próprias moléculas da proteína. Deste modo, temos um aumento na solubilidade da 
proteína em meio aquoso. A esse fenómeno dá-se o nome de salting-in. Este efeito, 
porém, não se estende infinitamente. Em condições de elevada força iônica, as 
moléculas de água apresentam maior tendência de solvatação de partículas (nesse caso, 
os íons). As moléculas de água, desse modo, interagem mais com os íons, desfazendo 
suas interações com a estrutura proteica. Como consequência, tem-se: maiores 
interações proteína-proteína, resultando na diminuição da solubilidade em meio aquoso. 
A esse fenómeno dá-se o nome de salting-out. Sendo que o sulfato de amónia, possui 
baixa força iônica, provoca um aumento da solubilidade da proteína( salting-in), 
favorecendo assim a precipitação das proteínas. 
Ao colocar o sobrenadante no tubo 10, adicionar TCA 10%( p/v), homogeneizar e 
centrifugar, observou-se que não houve formação de precipitado, o que leva a concluir 
que o sobrenadante não possuía proteínas, isto é, as proteínas se encontravam nos 
precipitado. 
 
 
Efeito da adição de solventes orgânicos 
 
No procedimento de precipitação das proteínas por solventes orgânicos, ao adicionar 
etanol gelado à solução de proteínas ( tubo11) formou-se uma mistura esbranquiçada o 
que leva a concluir que houve formação de precipitado. 
 A interação proteína-água é maior quea interação proteína-proteína devido à baixa 
força de atração entre as moléculas proteicas, fazendo com que a proteína se solubilize 
na água. Com a adição do álcool etílico (solvente orgânico) na água, ocorreu sua 
solubilização, rompendo as interações proteína-água, proporcionando a interação 
proteína-proteína; 
Os solventes orgânicos apresentam valor de constante dielétrica bem inferior à da água, 
a interação proteína-proteína "vence" o poder de solvatação da água (interação água-
proteína) favorecendo a precipitação da proteína. A precipitação por solventes orgânicos 
depende muito da temperatura. Os solventes orgânicos, quando utilizados a 
temperaturas baixas, são bastante úteis na separação de misturas de proteínas. A 
temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar à desnaturação por rompimento 
das pontes de hidrogénio e estabelecimento de interações apolares, importantes na 
manutenção da conformação proteica, sendo este, o motivo da utilização do etanol 
gelado (AIRES BARROS, 2008). 
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Figura 4-Solução turva resultante da adição de etanol gelado na solução de proteínas. 
 
Conclusão 
Conclui-se que é possível determinar a presença de proteínas e aminoácidos em solução 
com o auxílio de algumas reações químicas conhecidas. As reações de coloração e 
precipitação (com ou sem desnaturação) de proteínas, permitem a caracterização dessas, 
pela análise de suas propriedades químicas e físicas, entre elas, a presença de ligações 
peptídicas, estrutura molecular, solubilidade, força iónica e concentração molar. A 
detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações específicas com 
determinados reativos, os quais originam substâncias coloridas que absorvem luz na 
região visível, permitindo a sua quantificação. No entanto, as reações de coloração não 
alteram a estrutura tridimensional da proteína, ao contrário das reações de precipitação 
que podem alterar as estruturas quaternárias, terciárias e secundárias das proteínas como 
as reações por ação térmica, presença de alcalóides (TCA), sais e solventes orgânicos. 
Já as reações denominadas “ Salting-in” e “Salting-out” precipitam o material sem a 
desnaturação. Finalmente, constatou-se que todos os resultados atingiram as 
características pré-estabelecidas pelos conceitos teóricos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Referências bibliográficas 
 
CHAMPE, P. C., HARVEY, R. A. Bioquímica Ilustrada. 2. Ed. Porto Alegre: Artes 
Médicas, 2006. 
DIAS DE SOUZA, Karina A. Freitas, NEVES, Valdir A. Experimentos de Bioquímica, 
um guia electrónico,2007 
NELSON, D. L., COX, M. M. Lehninger. Principio de Bioquímica. 3. Ed. São Paulo: 
Savier, 2006. 
VOET, D., VOET, J. G. Fundamentos de Bioquímica. 3. Ed. Porto Alegre: Artmed, 
2006. 
ZAIA, D.A.M; ZAIA, C.T.B.V.; LICHTIG, J.; Determinação de Proteínas Totais Via 
Espectrofotometria: Vantagens e Desvantagens dos Métodos Existentes. São 
Paulo.1998.7f Disponível em <http://w.scielo.br/scielo.php?pid=S0100- 
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2017. 
AIRES-BARROS, M.R.; Biocatálise em Solventes Orgânicos, 2008.