Isolamento e Purificação de Biomoléculas

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Isolamento e Purificação de 
Biomoléculas 
Prof. Jainne Martins Ferreira 
Esquema de processo biotecnológico industrial genérico 
Recuperação de produtos 
 
 
 
Finalidade de uso: 
Medicamentos 
 
Localização: (intra x extracelular)?? 
diversidade química e abundância de moléculas 
 
Custos 
Downstream 
Isolamento e Purificação de Biomoléculas 
Downstream 
Recuperação de um produto a partir de uma solução aquosa diluída 
(operações unitárias industriais) 
 
Nota: uma operação unitária é aquela etapa física de um processo 
industrial e que, portanto, não envolve a ocorrência de transformações 
químicas. 
 
Tipos de Operações Unitárias 
- Mecânicas 
- Transferência de Massa 
- Transferência de Calor 
 
 
• Etapas de recuperação dos Produtos: 
 
 
- clarificação 
- rompimento de células 
- concentração e/ou purificação de baixa resolução 
- purificação de alta resolução 
- tratamentos finais 
- acondicionamento 
Isolamento e Purificação de Biomoléculas 
Recuperação de produtos 
Recuperação de produtos 
 
• CLARIFICAÇÃO 
• Separação das células do meio de cultura 
• Interesse no extrato ou no pellet de células? 
Clarificação 
Clarificação 
1. Filtração 
– Usado para grandes volumes de extratos diluídos 
– Obtenção do filtrado e do retido 
– Ausência de esterilidade 
– -microfiltração: 0,22 ou 0,45 μm 
– Filtros convencionais: 100 μm 
 “fouling”. (Este fenômeno é caracterizado pela aderência de compostos 
à membrana, provocando o aumento da resistência ao fluxo). 
– Uso de pressão (vácuo). 
 
• Materiais dos filtros: materiais celulósicos, terra 
diatomácea, materiais sintéticos 
Clarificação 
 
2. Centrifugação 
– Aceleração do processo de sedimentação por ação 
de um campo centrífugo 
• Esterilidade 
– Pellet mais úmido que na filtração 
– Possibilidade de refrigeração 
Tendo definido o processo, torna-se possível selecionar o 
tipo especifico de centrifuga. 
As centrifugas podem ser divididas em centrifugas de 
filtração e de sedimentação 
ROMPIMENTO CELULAR 
 
• Para produtos intracelulares 
• Romper ou permeabilizar? 
• Cuidados com calor e proteases 
• Diferentes composições de parede celular 
A localização da proteína deve ser conhecida . Uma proteína pode estar 
presente na membrana da célula ou no citosol ou em qualquer em uma das 
organelas intracelulares . Se a proteína está presente na fase extracelular 
da membrana ou seja folheto exterior da membrana, então a proteína 
pode ser extraída da célula simplesmente usando detergentes. Não há 
necessidade de rompimento celular neste caso . 
 
 
 
 
tecidos 
células 
Homogeneização 
(para romper tecidos e células) 
por pressão 
(prensa francesa) 
liquefação 
(Potter) 
Homogenado 
ou 
Extrato bruto 
Material 
de 
partida 
Material na 
fonte 
por ultra-som com 
detergente 
Vários métodos são 
possíveis para transformar 
células, órgãos, tecidos em 
um homogenado, ou extrato 
bruto, como mostra a figura. 
Extração de enzimas intracelulares 
Proteínas de membrana 
 
,. 
Proteínas 
integrais da 
membrana 
detergente micelas 
Complexos não 
micelares 
Dependendo da concentração 
Detergentes não iônicos 
Triton X-100 
(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol) 
SDS 
Dodecil sulfato de 
sódio 
Cetab 
Cetyltrimethylammonium 
bromide 
Detergentes iônicos 
Octilglicosídeo 
(octyl-b-D-glucopyranoside) 
ROMPIMENTO CELULAR 
Escherichia Coli 
Métodos: 
Enzimáticos 
 
 
• Necessidade de danos parciais 
• Utilização de combinações de enzimas: 
- Leveduras: glicanases, proteases e mananases 
- Bactérias: glicosidades e proteases. 
 
Vantagens: fácil controle de pH e temperatura, alta 
especificidade. 
 
 Desvantagens: custos, variação em função do estado 
fisiológico do micro-organismo. 
ROMPIMENTO CELULAR 
 Mecânicos: 
• Mais usados industrialmente. 
• Equipamentos: homogeneizadores de alta pressão (Prensa 
Francesa) e moinho de coloidal, vortex* 
• Mais baratos. 
• Aumento de temperatura. 
 
ROMPIMENTO CELULAR 
ROMPIMENTO CELULAR 
Moinho Coloidal Moinho de bola 
ROMPIMENTO CELULAR 
Não mecânicos: 
 
• Choque osmótico, 
• Congelamento/descongelamento, 
• Ultra som 
ROMPIMENTO CELULAR 
Químicos: 
 
• Detergentes, ácidos, bases 
 
Qual método usar dos 4? 
 
• Rendimento, especificidade, controle de 
temperatura, custos. 
 
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS 
 
Natureza protéica dos produtos: enzimas, antibacterianos, 
anticorpos, etc. 
 
 
 Precipitação com sais: 
 
• Método tradicional e simples 
• Boa capacidade de separação de proteínas 
• Fatores que determinam a estrutura e a solubilidade de 
uma proteína 
• Princípio de ppt: perda da estrutura tridimensional. 
Adição de sais reduz a disponibilidade de água, devido à 
hidratação dos íons do sal, (o que torna o meio mais 
hidrofóbico). Proteínas exibem diferentes graus de 
hidrofobicidade. 
 
 
• Faixas de saturação utilizadas 
• Controle da temperatura durante adição do sal 
• Controle do pH 
• Centrifugação 
• Suspensão em tampão 
• Volume – permite ajustar o volume de suspensão do 
material. 
• Recuperação de atividade 
• Operação pós-suspensão 
• Necessidade de eliminar o sal por diálise ou gel filtração. 
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS 
 
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS 
 
 
• Sais para ppt: 
– alta solubilidade 
– pouco viscosidade em altas concentrações 
– o ânion é mais importante na escolha 
– série de Hoffmeister (em ordem crescente de 
eficiência): 
– nitratos < brometos< cloretos< acetato< sulfato< 
fosfato 
• prefere-se cátions monovalentes: Na < K < NH4 
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS 
 
 
• Sulfato de Amônio (NH4)2SO4 
• 100% de saturação: 4 M (> 700 g/L) 
• solubilidade elevada em amplas faixas de temperatura 
• produz baixa viscosidade 
• efeito anti-proteolítico e antibacteriano 
• baixo custo 
• concentração de proteínas - Precipitação 
• Precipitação isoelétrica 
• Alterar o pH até o ponto isoelétrico (PI) 
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS 
 
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS 
 • Precipitação por solventes orgânicos: 
• etanol ou acetona: diminuem a constante 
dielétrica do meio, aumentando a interação 
entre cargas opostas de aa expostos. 
• Vantagens: redução da densidade do meio, 
favorecendo a sedimentação natural. 
• Desvantagem: inativação da enzima, efeito de 
diluição, aquecimento 
Ultrafiltração 
 
 
• Transporte de soluções através de membranas com poros de 
diâmetros entre 0,001 e 0,1 μm sob pressão. 
 
– Usado para macromoléculas como proteínas e 
polissacarídeos. 
– água e pequenas moléculas passam pela membrana, 
enquanto que as maiores, com diâmetro maior, ficam 
retidas. 
– Vantagens: retira sais, concentração do produto, 
aplicável em grandes escalas. 
 
• PROBLEMAS: “fouling”, custos, furos na membrana, 
formação de agregados, baixa resolução. 
Cromatografia 
 
 
• Princípio: solutos de um meio líquido 
(enzimas, anticorpos, etc) são 
adsorvidos/retidos em um leito poroso. A 
posterior remoção gradual do soluto por ação 
de uma fase móvel (eluente) resulta na 
separação das diferentes moléculas. 
-coluna-fase estacionária (matriz), que 
pode interagir química/eletricamente ou 
não apresentar interação com o produto, 
-fase móvel: tampão 
C
o
n
ce
n
tr
a
çã
o
 
Tempo ou volume 
Coletor de 
frações 
FUNCIONAMENTO BÁSICODE UMA COLUNA CROMATOGRÁFICA 
 
Os componentes da mistura são 
separados por interação diferenciada 
com a resina, com base em 
propriedades moleculares como: 
 
• massa molecular 
• carga elétrica 
• solubilidade 
• afinidade 
 
Cromatografia 
 
• Troca Iônica 
– uma das mais utilizadas 
– processo baseado na afinidade que os componentes 
de uma amostra têm pelos sítios iônicos de uma 
matriz. 
• a fase estacionária, eletricamente carregada, 
tem a capacidade de reter solutos que estão na 
fase móvel e apresentem cargas opostas 
Troca Iônica 
Eluição 
• reversibilidade da ligação- as proteínas exibem 
diferentes números de sítios carregados na molécula, 
por isso seus graus de ligação à resina são variáveis. 
 
Formas de eluir: 
1. Alteração de pH 
• - diminuir pH em trocas aniônicas - aumentar o pH em 
trocas catiônicas. 
• Problema: resinas tem boa capacidade tamponante. 
 
Troca Iônica 
 
2. Alteração da força iônica 
 
• mais usado 
• o “desligamento” da proteína da resina ocorre pelo 
deslocamento com outros íons (Na+ ou Cl-, por 
exemplo), com a mesma carga adsorvida, porém com 
mais força de interação com a fase estacionária. 
 
• Eluente mais usado: NaCl 
• utiliza-se um gradiente crescente de NaCl 
Troca Iônica 
 
Vantagens da troca iônica 
• -reprodutibilidade 
• -alta resolução 
• -concentração da amostra 
• -rapidez 
 
Escalonamento 
• -aumenta-se o volume da coluna 
• -relação altura/diâmetro 
 
Gel filtração 
 
• gel permeação, cromatografia de exclusão 
molecular 
• muito usada para purificação de enzimas, 
• a separação ocorre baseada no tamanho (peso 
molecular) da enzima 
• são usadas resinas inertes fabricadas em 
polímeros naturais (dextranas) ou sintéticos. 
CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO EM GEL 
PROPRIEDADES IMPORTANTES 
Limite de Exclusão 
Moléculas pequenas não 
podem difundir no interior do 
gel 
Moléculas > ao limite 
eluiram rapidamente do gel 
Ex: Sephadex G-50 
Limite de exclusao = 30.000 
Moléculas com MM > 30.000 
eluiram diretamente sem entrar 
nas partículas do gel 
Faixa de Separação 
Sephadex G-50 
faixa de : 1.500-30.000 
Moléculas dentro dessa faixa 
serão separadas neste gel 
 
Gel filtração 
 
• Medidas das colunas 
• colunas largas e curtas: separação rápida, 
pouca turbulência e pouco resolução 
• colunas estreitas e compridas: separação 
lenta, maior resolução 
• COLUNA IDEAL: a altura deve ter de 20–
40 x o diâmetro. 
Cromatografia de Afinidade 
 
• Ligação específica do ligante (na resina) com a molécula 
alvo 
• Extremamente seletiva 
Cromatografia de Afinidade 
 
• Tipos de interação específica: 
 
• -antígeno/anticorpo 
• -enzima/substrato 
• -enzima/cofator 
• -“cauda de histidina” proteínas recombinantes 
 
• Eluição: 
 
• -detergentes, 
• -mudanças na concentração de sal 
• -aplicação de uma molécula com mais afinidade (eletrólitos) 
Eletroforese 
• Usada para acompanhar as etapas de 
purificação 
– Separação de proteínas pela ação de um campo 
elétrico que força o movimento de proteínas 
eletricamente carregadas através de um gel. 
– As proteínas movimentam-se em função da 
quantidade total de cargas elétricas negativas (que é 
proporcional ao peso molecular), 
• Após a “corrida”as proteínas são coradas com 
Comassie Blue ou com prata. 
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE) 
cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm) 
O desenho ao lado mostra o tipo mais comum 
de cuba para PAGE. 
Na cuba, o gel é polimerizado entre duas 
placas de vidro ou plástico, afastadas 1 mm 
uma da outra. 
 
 
catodo 
anodo 
tampão 
Poços para 
as amostras 
amostra 
Placas 
de vidro 
1 mm 
tampão 
gel 
- O SISTEMA PAGE É USADO PARA A ANÁLISE DO PADRÃO 
 DE PROTEÍNAS NATIVAS PRESENTES NUMA AMOSTRA 
 
 A quantidade de bandas que aparecem no gel é um indicativo da 
pureza de uma amostra 
SDS-PAGE- permite determinar a massa molecular de proteínas 
Mobilidade relativa 
M
a
s
s
a
 m
o
le
c
u
la
r 
(k
D
) 
Mobilidade relativa = 
 
distância percorrida pela banda X 
distância percorrida pelo marcador da corrida 
97.4 
87.0 
45.0 
29.0 
21.0 
12.5 
 6.5 
(-) 
(+) 
Curva de calibração de SDS-PAGE Proteínas padrões em um SDS-PAGE 
Mr 
Tratamentos finais 
 
• Qual o grau de pureza? 
– acondicionamento 
– liofilização, secagem 
– inibidores de atividades indesejáveis 
 
• Veículos de estocagem: 
 
• glicerol, sorbitol, sacarose 
Transporte e Armazenamento de Fluidos: 
 
São realizados por: 
- Bombas: centrífugas (rotor) e de deslocamento positivo ( pistão ) 
- Válvulas (controle e bloqueio) 
- Linha de tubulações 
- Medidores de vazão 
-Vasos pressurizados. 
 
Separação de Fluidos: 
Realizada por: 
- Centrifugação 
- Filtração 
 
OPERAÇÕES UNITÁRIAS DE TRANSFERÊNCIA DE MASSA 
 
São as operações que envolvem a separação de líquidos miscíveis. 
- Propriedades das soluções  principalmente as diferenças entre os 
Pontos de Ebulição. 
. Principais Operações de Transferência de Massa: 
- Destilação 
- Absorção – soluções líquido-gás