apostila microbiologia básica

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ROTEIRO DAS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA 
BÁSICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pinhalzinho 
2015 
 
 
Universidade do Estado de Santa Catarina – UDESC 
Centro de Educação Superior do Oeste – CEO 
Departamento de Engenharia de Alimentos 
Curso de Engenharia de Alimentos 
Disciplina: Microbiologia Básica 
Professora: Liziane Schittler 
 
 
 
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NORMAS DE SEGURANÇA NO TRABALHO NO LABORATÓRIO DE 
MICROBIOLOGIA 
 
 
 Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com reagentes e 
equipamentos. 
 
 Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada aula prática. 
 
 Lavar e sanificar as mãos ao iniciar a análise, ao sair do laboratório e sempre que for 
necessário. Se for portador de algum ferimento nas mãos, procurar não tocar no material. 
 
 Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a análise. 
 
 Utilizar exclusivamente material estéril para a análise. 
 
 No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente à desinfecção e 
esterilização. O mesmo procedimento deverá ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes. 
 
 Não comer, beber ou fumar no laboratório. 
 
 Manter canetas, dedos e outros longe da boca. 
 
 Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho. 
 
 Avisar ao professor em caso de contaminação acidental. 
 
 Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando sobre a 
bancada. 
 
 Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso. 
 
 Os cultivos após a leitura devem ser esterilizados, portanto não os colocar na estufa ou 
despejar na pia. 
 
 Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou substâncias 
inflamáveis por perto. 
 
 Trabalhe sempre próximo ao fogo. 
 
 
 
 
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PREPARAÇÃO DO MATERIAL DE LABORATÓRIO PARA ANÁLISES 
MICROBIOLÓGICAS 
 
Objetivo: Garantir que os frascos e utensílios destinados ao contato com as amostras de alimentos, 
encontrem-se totalmente limpos, estéreis e isentos de resíduos químicos e orgânicos. 
 
Etapas: 
• Descontaminação; 
• Descarte de resíduos contaminados; 
• Lavagem; 
• Acondicionamento; 
• Esterilização. 
 
Descontaminação e descarte de resíduos contaminados 
 
• Material deve ser esterilizado em autoclave, 1210C por 30 minutos; 
 
Cuidados 
 
• Afrouxar as tampas de todos os frascos com tampa rosca; 
• Adicionar água ou solução detergente aos estojos de descarte de pipetas, para amolecer os 
resíduos e facilitar a posterior remoção. 
 
Lavagem 
 
• A escolha do detergente e os métodos de enxágüe, são fundamentais; 
• Detergentes aniônicos; 
• Eventualmente, pode ser necessária a aplicação de um agente mais forte, para utensílios que 
não permitem a introdução de escovas; 
• Soluções utilizadas: 
 - Sulfocrômica (ácido sulfúrico e dicromato de potássio); 
 - Solução alcoólica 1N de hidróxido de sódio; 
• O enxágüe dos utensílios deve ser feito de forma a garantir a completa remoção de resíduos 
de detergente; 
• Os resíduos podem interferir com os resultados das análises: 
 - Na alteração do meio de cultura, como por inibição do crescimento microbiano. 
• Sua completa remoção exige seis a doze enxágües sucessivos em água corrente, seguido de 
vários enxágües em água destilada. 
 
 Procedimento para a lavagem 
 
• Separar e remover o material descontaminado; 
• Mergulhar todo o material em solução detergente e deixar de molho por 2 horas; 
• Fazer uma pré-lavagem dos frascos e utensílios em água corrente; 
• Os tubos de Durhan devem ser colocados de molho em frasco separado, resistente ao calor, 
e submetido á vapor fluente por 15 minutos, para a remoção do resíduo do meio de cultura; 
• As pipetas devem ter o algodão do bocal removido antes da permanência de molho; 
• A solução detergente deve seguir as recomendações do fabricante do detergente aplicado. 
• Com auxílio de escovas e esponjas, esfregar os frascos, lembrando de remover as anotações 
de caneta; 
• Proteger as mãos com luvas de borracha e utilizar pinças de aço inoxidável para manusear o 
material de molho em solução sulfocrômica ou em solução de NaOH; 
 
 
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Acondicionamento 
 
• Placas de petri: Acondicionadas em estojos porta-placas de alumínio ou aço inoxidável, ou 
embrulhadas em papel Kraft, em grupos de até 10 placas; 
 
• Pipetas: Preencher o bocal com algodão e acondicionar em estojos porta-pipetas, em grupo 
de mesma capacidade, com as pontas para baixo. Proteger o fundo dos estojos com chumaço 
de algodão ou gaze, para evitar danos às pontas da pipetas. 
 
• Tubos de ensaio vazios: Tampar com tampão de algodão ou com as respectivas tampas, no 
caso de tubos rosqueáveis. Cobrir a parte superior dos tubos com papel e amarrar com 
barbante; 
 
• Frascos de homogeneização e outros frascos vazios: Tampar com tampão de algodão 
 Cobrir a tampa ou o tampão com papel e amarrar com barbante; 
 
• Espátula, pinças, tesouras e demais utensílios: Embrulhar individualmente em papel, 
lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da 
análise. 
 
Esterilização 
 
• Todo o material de laboratório vazio (placas, pipetas, tubos de ensaio, frascos, pinças, 
tesouras, etc.) pode ser esterilizado tanto em autoclave quanto em estufa de esterilização. 
 
• Na esterilização em estufa, o material deve permanecer a 1700C/2h; 
 
• Na esterilização em autoclave 1210C/30min; 
 
• Recomenda-se ainda nunca trabalhar com as estufas ou autoclaves muito cheias, para 
facilitar a transferência de calor. 
 
Preparo de vidraria nova para ser colocada em uso 
 
• Deve ser mergulhada e mantida por 24 horas em água destilada; 
 
• Enxaguada em nova batelada de água destilada e submetida a um teste de pH, antes de ser 
esterilizada. 
 
Tratamento para remoção de resíduos tóxicos 
 
• Materiais - Tampas de plástico ou borracha, de tubos de roscas ou outros frascos; 
 
• Mergulhar em água destilada, autoclavar a 1210C/15min e enxaguar em água destilada. 
Repetir este procedimento mais uma vez. 
 
 
Teste para verificação da eficiência da lavagem e enxágüe na remoção de resíduos 
 
• Verificação do pH 
 
 
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Tomar alguns frascos de uma batelada de material lavado, principalmente aquele submetido 
som solução sulfocrômica ou solução de NaOH e adicionar algumas gotas de 0,04% de azul de 
bromotimol, observando a cor. 
 
• Neutro – verde 
• Ácida – amarelo (pH 6,5 ou menos) 
• Alcalina – Azul ( pH 7,3 ou maior) 
 
 
 
Aula Prática 01 
Microbiologia básica 
Professora Liziane Schittler 
 
 
MÉTODO DO SWAB (SUABE) 
 
 A coleta utilizando swab é o método mais antigo e amplamente utilizado para examinar 
microbiologicamente uma superfície na indústria de alimentos, hospitais e restaurantes. 
 
Para que serve o Swab? 
 
Em planta processadora utiliza um sistema de swab para amostragem ambiental para 
verificar a eficiência da sanificação pré-processada, para monitorar os níveis de contaminação 
durante a produção ou para medir os níveis microbianos pós-operacionais, assim é de grande 
importância o estabelecimento de um procedimento de amostragem consistente e facilmente 
reprodutível. 
 
ATIVIDADE 1 - TÉCNICA DO ESFREGAÇO DE SUPERFÍCIE 
 
 a) Aplicação: Peixes inteiros, carcaças e cortes de bovinos, suínos e aves, superfícies de 
equipamentos, mesas, utensílios e embalagens. 
 b) Procedimento: Usando um molde estéril, delimitar a área a seramostrada. Aplicar o 
“swab” com pressão, numa inclinação aproximadamente de 45º, descrevendo primeiro movimentos 
da esquerda para a direita e depois de cima para baixo. Deve-se rodar continuamente o “swab”, para 
que toda a superfície do algodão entre em contato com a amostra. No exame de superfície secas, 
recomenda-se umedecer o “swab” no diluente antes da sua utilização, comprimindo-o contra as 
paredes do frasco de diluente, para remover o excesso de líquido. O “swab” não deve ser segurado 
na região próxima ao algodão e a parte manuseada da haste deve ser quebrada na borda interna do 
tubo de diluente, antes de se mergulhar o material amostrado. 
 Esfregaço de meias carcaças de bovinos e suínos: deve-se selecionar cinco pontos 
demarcados com moldes estéreis de 50 cm2 (um molde para cada ponto) e aplicar o “swab” 
em cada um dos pontos. Colocar os 5 “swabs” em um mesmo frasco, com 25 ml de diluente, 
agitar em “vortex” (2 minutos), ou manualmente (invertendo-se 25 vezes em arco de 30 cm) 
e proceder às análises pertinentes. Cada mililitro de diluente corresponderá a 2cm2 de 
superfície e os resultados são expressos por cm2 de amostra. 
 Esfregaço de cortes comerciais de carcaças: selecionar 5 pontos de 50cm2 na superfície 
do corte, ao acaso, e proceder da mesma forma descrita para meias carcaças. 
 Esfregaço de carcaças de aves: selecionar 5 pontos de 50 cm2 na superfície da carcaça, 
entre aqueles com maior nível de contaminação, como dorso, asas, antecoxas e pescoço e 
proceder da mesma forma descrita para meias carcaças. 
 
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 Esfregaço de peixes: selecionar 5 pontos de 50 cm2 na superfície de peixes grandes ou 
amostrar a peça inteira, no caso de peixes pequenos e proceder da mesma forma descrita 
para meias carcaças. 
Observação: Os “swabs” devem ser preparados com hastes de comprimento 15 cm e 
diâmetro 3 mm. A parte absorvente em algodão deve ter aproximadamente 2 cm de comprimento 
por 5 mm de diâmetro. 
 c) Cálculo dos resultados: os resultados devem ser expressos em NMP ou UFC por cm2 de 
amostra. Inicialmente, deve-se calcular o NMP ou UFC por mililitro de diluente onde foi 
suspendido o material coletado com “swabs”. Considerar essa suspensão como se fosse uma 
amostra sem diluição (100). Em seguida, deve-se converter o NMP ou UFC/ml de suspensão em 
NMP ou UFC/cm2 de amostra. Para tanto, calcular a quantos cm2 corresponde cada ml da 
suspensão. No caso descrito para meias carcaças de bovinos, por exemplo, cada ml de suspensão 
corresponde a 2cm2 de amostra, porém, essa relação pode ser alterada a critério do analista, 
dependendo do tipo de amostra e objetivo da amostragem. É recomendável trabalhar sempre com 
volumes de diluente múltiplos das áreas amostradas, para facilitar os cálculos. No caso das meias 
carcaças de bovinos, o NMP ou UFC/cm2 será igual ao valor obtido por ml de suspensão, dividido 
por dois. Numa outra situação, em que um esfregaço de 250 cm2 de área fosse suspendido em 25,0 
ml de diluente, por exemplo, cada ml de suspensão corresponderia a 20 cm2 de área e o NMP ou 
UFC/cm2 seria igual ao valor obtido por ml de suspensão, dividido por dez. 
 
 
ATIVIDADE 2 – Fazer coletas de swab das mãos, bancada, roupa, nariz. 
 
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Aula Prática 02 
Microbiologia básica 
Professora Liziane Schittler 
 
 
MICROSCOPIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MICROSCÓPIO ÓTICO 
 
O microscópio ótico é aquele comumente utilizado em laboratórios de microbiologia. Seu 
princípio se baseia no aumento de imagem por um jogo de lentes, associado a uma forte iluminação 
do campo de observação e da visão translúcida do microrganismo. 
 Geralmente os microscópios desse tipo permitem um aumento útil de aproximadamente mil 
vezes. A maioria é equipada com três objetivas: objetiva de imersão (distância focal= 1,8mm, 
ÍNDICE 
 
1 - ocular 
2 - objetiva e revolver 
3 - platina 
4 - charriot 
5 - macrométrico 
6 - micrométrico 
7 - diafragma no condensador 
8 - condensador 
9 - botão do condensador 
10 - dois parafusos centralizadores do condensador 
11 - fonte de luz 
12 - controle de iluminação 
13 - diafragma de campo (alavanca no lado esquerdo do microscópio) 
14 - dois parafusos de ajuste da lâmpada (esquerdo e direito) 
15 -focalizadora da lâmpada (alavanca no lado direito do microscópio - não visível na fotografia). 
 
 
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aumento=95 vezes) objetiva a seco de grande aumento (distância focal= 4mm, aumento= 44 vezes) 
e objetiva a seco de pequeno aumento (distância focal= 16mm, aumento= 10 vezes). A essas 
objetivas correspondem oculares que em geral permitem um aumento de dez vezes. O aumento total 
permitido pelo microscópio é fornecido pela multiplicação do poder de aumento da objetiva pelo da 
ocular. Com algumas modificações, como o uso de oculares de poder mais alto, essa ampliação 
pode ser aumentada duas ou três vezes. Contudo, o aumento de mil a 2 mil vezes é o limite da 
ampliação útil obtida no microscópio ótico. 
A limitação não é uma questão de aumento, mas sim o poder de resolução, ou seja, a 
capacidade de distinguir e separadamente dois pontos adjacentes. O poder de resolução é função do 
comprimento de onda de luz visível utilizada (quatrocentos a setecentos manômetros, dependendo 
do filtro) e da abertura numérica, que é uma característica do sistema de lentes utilizada. O limite de 
resolução é obtido com o menor comprimento de onda da luz visível e com objetiva de maior 
abertura numérica. 
 
MECÂNICAS 
 
a) Pé: é feito de ligas de metais pesados para impedir que o aparelho tombe. 
b) Estativo: haste ou suporte que se articula com o pé, sustenta o tubo, a platina, o 
condensador, o aparelho e os mecanismos macro e micrométricos. 
c) Platina ou mesa: de forma redonda ou retangular é fixa, móvel ou giratória no plano 
horizontal ou então apresentam uma parte inferior fixa ao estatico e outra superior, 
deslizante. As platinas fixas geralmente compensam sua imobilidade por meio de peças 
deslizantes, chamadas "charriot". Entre as garras do último se encaixa a lâmina com o 
material a ser estudado: pode ser deslocado para frente, para trás, à direita ou esquerda, 
sempre no mesmo plano, por meio de cremalheiras laterais. No centro há uma abertura para 
a passagem dos raios luminosos, coletados pelo espelho, e dirigidos pelo condensador e o 
diafragma sobre a preparação entre lâmina e a lamínula, projetando daí através do tubo e da 
ocular até a retina do observador. 
d) Tubo: no microscópio monocular o tubo representa um cilindro metálico, com um encaixe 
posterior, da precisão para sua adaptação a outro encaixe, porém de corte investido na 
cremalheira. 
e) Dispositivos macros e micrométricos: entre o tubo e o estativo há uma peça deslizante em 
sentido vertical, acionada por dois tipos de "botões" os "macrométricos" e "micro-métricos". 
Com o mecanismo macro-métrico obtém-se focalização ótica grosseira da peça a ser 
examinada, enquanto que, com o dispositivo micrométrico obtêm-se deslocamentos do tubo 
até de dois milésimos de milímetro ou menos ainda, dando desta forma nitidez à imagem. 
f) Revólver: é colocado na extremidade inferior do tubo nos modelos mais antigos ou dos 
dispositivos macros e micrométricos nos instrumentos modernos de tubo bipartido. É 
munido de 3 ou 4 vãos circulares, providos de matrizes para roscas. Nestas matrizes se 
enroscam as 3 ou 4 objetivas, sempre na ordem de seu aumento progressivo. Basta, então, 
durante os trabalhos microscópicos, fazer girar mecanismos de câmbiode objetivas ou 
revólver em um só sentido para obterem-se aumentos sucessivos ou vice-versa, já 
focalizado, pelo menos, acrometricamente. 
 
ÓTICAS 
 
a) Oculares: são encaixadas nas extremidades superiores do tubo. Podem ser retiradas e substituídas 
facilmente segundo a necessidade do momento. É importante saber que as oculares ampliam 
apenas a imagem formada pela objetiva. Não tornam mais nítidas as estruturas do objeto a ser 
estudado. Seria ilógico, portanto, empregar-se nos trabalhos microscópicos objetivas de pouco 
aumento próprio e oculares de grande poder de ampliação. Também não se pode aconselhar o 
uso simultâneo de objetivas e oculares de forte aumento. O campo visual seria pouco nítido nas 
 
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estruturas das células. Por exemplo, se apresentariam "apagadas", quase não haveria 
luminosidade e o campo ótico seria mínimo. No estudo geral das células ou dos tecidos e no 
controle dos processos de coloração e diferenciação dos cortes são suficientes oculares com 
aumento próprio pequeno ou médio. Há, assim, satisfatória nitidez das estruturas, campo visual 
grande - bem uniformemente iluminado - e poupança de nossa vida. Na escolha das oculares 
para um microscópio há um princípio importante a observar: é que as qualidades óticas das 
mesmas somente atingem seu grau máximo de aproveitamento quando estão combinadas com as 
objetivas certas. 
b) Objetivas: são sistemas óticos, construídos com 4 a 6 ou mais lentes superpostas. Além de 
fornecerem uma imagem ampliada de um objeto qualquer, procuram corrigir também os 
defeitos cromáticos dos raios luminosos e de "esfericidade". 
c) Condensador com diafragma: o condensador está colocado por baixo da platina. Sua 
função é fornecer bastante luz. Para tanto é provido de um sistema de lentes convergentes, 
que concentram e jogam o maior número de feixes luminosos pela lente frontal da objetiva. 
É indispensável quando se empregam grandes aumentos. O condensador, idealizado por 
Abee e aperfeiçoado cada vez mais, permite ao pesquisador obter a iluminação desejável 
para cada caso. Há condensadores para o "campo claro" e contrastes de fases para campo 
escuro. No campo claro a lente frontal é geralmente "desviável", o que permite 
iluminarem-se rapidamente grandes campos claros, quando os trabalhos são executados 
com aumentos pequenos. Todos os condensadores para o campo claro e contrastes de fases 
estão equipados com um diafragma do sistema íris, cuja abertura é regulável para perfeito 
ajuste a cada caso. Além disso, há uma crema-Iheira, que permite o afastamento total do 
diafragma. Fecha-se o diafragma, quando se usa objetivas de pouco aumento, para eliminar 
os raios laterais. Abre-se o diafragma na medida em que se vão aumentando as ampliações. 
d) Espelho: é encaixado por baixo do condensador, num vão do pé do microscópio. É redondo e 
articula-se entre duas laterais. Uma de suas faces é plana e a outra côncava. A primeira colhe 
e projeta os raios paralelos e divergentes e a segunda os convergentes. O espelho côncavo é 
usado nas ampliações pequenas; o plano, juntamente com o condensador, nas grandes e nas 
imersões. 
 
 
1. AUMENTO DE UM MICROSCÓPIO 
 É calculado através da multiplicação do aumento da ocular pelo aumento da objetiva. 
 
 
2. FOCALIZAÇÃO DE UM MICROSCÓPIO 
 
Objetivas e distâncias focais 
 
 
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a) Procurar a objetiva de menos aumento. 
b) Acertar a iluminação do microscópio de acordo com a objetiva a ser usada. 
c) Olhando por fora da ocular movendo o canhão para baixo por meio do parafuso 
macrométrico até que a objetiva se aproxime o mais possível da lâmina sem tocar nela. 
d) Olhando agora através da ocular, girar o parafuso macrométrico em sentido inverso 
(elevando o canhão) até perceber o foco (enxergar alguma coisa). 
e) Dar nitidez à imagem com o parafuso micrométrico. 
 
 
3. MANEJO DO MICROSCÓPIO 
 
Para manejar corretamente um microscópio deve-se obedecer aos seguintes passos: 
Iluminação - Regular o espelho em direção à fonte de luz, observando com a ocular e a 
objetiva de menor aumento, mover espelho de tal forma que o campo fique uniformemente 
iluminado. Regular a quantidade de luz do diafragma. 
- Observação: O material a ser observado estará sobre uma lâmina de vidro e recoberto por uma 
lamínula. A lâmina deve ser colocada sobre o centro de abertura da platina. Não esquecer que o 
material a ser observado deve ser suficientemente delgado a fim de permitir a passagem de luz. 
Foco - Procure colocar a objetiva de menor aumento em posição de observação. Olhando 
lateralmente o microscópio, girar o macrométrico aproximando a objetiva até mais ou menos meio 
centímetro de lâmina de vidro. Olhando agora através da ocular, afastar lentamente a objetiva do 
preparado até o aparecimento das estruturas. Ajustar o foco em auxílio do micrométrico. Para 
observar com maior aumento, gira-se o revolver ajustando a objetiva selecionada sem desfocar. 
Melhorar o foco com o micrométrico e realizar as atividades propostas; retirar as lâminas do 
microscópio, voltar a objetiva de menor número, afastar o canhão da platina. 
As lâminas de vidro devem ser limpas com água e detergente, ou ainda, preferencialmente 
com xilol. As oculares e objetivas com o auxílio de um papel bem suave, absorvente. 
Nas observações com objetivas de imersão, é usado óleo de cedro ou nupol e a limpeza 
deverá ser feita com o auxílio de éter. 
 
5. CUIDADOS COM O MICROSCÓPIO 
 
 O microscópio, quando não estiver em uso deverá ser resguardado da poeira. 
 Não deve ficar exposto à luz ou ao calor; 
 Para transportá-lo use as duas mãos, uma segurando o braço do microscópio e a outra o 
sustentando pela base. Nunca carregue o aparelho usando apenas uma das mãos; 
 Só girar os parafusos macrométricos e micrométricos quando houver real necessidade. Não 
gire o micrométrico indefinidamente para mover o canhão, pois poderá estragar o seu 
delicado mecanismo. Use-o somente para ajustar o foco e para as observações de 
profundidade; 
 Não passe os dedos nas lentes para limpá-las. O vidro das lentes é facilmente arranhável, por 
isso só podemos usar um papel especial bem macio, para limpá-las; 
 Após o uso limpar as objetivas com um papel próprio ou pano macio; 
 Evite molhar o microscópio quando estiver trabalhando, se isto ocorrer, seque-o com um 
pano macio; 
 Não desmonte qualquer parte do microscópio. Este é um instrumento muito caro, portanto, 
todo cuidado é pouco. 
 
 
6. PRÁTICA - MICROSCOPIA 
 
 
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Material: microscópio; lâminas; lamínulas; caneta; iluminadores; conta-gotas; água; jornal; fios 
de cabelo. 
 
 
ATIVIDADE 1 - Inversão de imagens 
 
1 - Com auxílio de uma caneta marcador faça um F na lâmina, conforme o esquema; 
 
 
 
 
 
2 - Observar no microscópio deslocando lentamente a lâmina de uma extremidade a outra. Use a 
objetiva de menos aumento. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Aula Prática 03 
Microbiologia básica 
Professora Liziane Schittler 
 
 
COLORAÇÃO DE GRAM 
 
A coloração de Gram utiliza características diferenciais das células bacterianas. Estas 
características diferenciais se referem à estrutura da parede celular dos microrganismos. 
Os microrganismos que contêm altos teores de ácido teicóico em sua parede celular se 
coram, pela coloração de Gram, em azul intenso e são chamados de “Gram positivos”. Os 
microrganismos que contém lipopolissacarídeos na membrana externa permitem a entrada do 
agente diferenciador e coram com o contracorante,mostrando-se da cor do mesmo (vermelho), e 
são denominados “Gram negativos”. 
 
 
Descrição da técnica: 
1º Passo - Preparo do esfregaço 
Com a alça de platina aplicar uma gota de água destilada sobre uma lâmina de microscópio. 
Com a alça novamente flambada, colher parte de uma colônia já cultivada (com cuidado para não 
trazer na alça parte do ágar). Espalhar as bactérias com a alça de platina sobre a lâmina. Deixar o 
material secar e, em seguida, fixá-lo com calor, aquecendo rapidamente a lâmina acima da chama 
da lamparina. 
2º Passo - Aplicação do corante primário 
 Gotejar o corante Violeta Genciana sobre a lâmina e esperar por 1 minuto. Enxaguar a 
lâmina sob um fio de água da torneira para remover o excesso de corante. 
3º Passo - Aplicação do Fixador 
Despejar o Lugol sobre a lâmina cobrindo toda a amostra e esperar 30 segundos. Enxaguar a 
lâmina sob um fio de água da torneira para remoção do excesso do fixador. 
4º Passo - Descoloração 
 Com a lâmina inclinada, despejar algumas gotas de álcool para remover a violeta genciana 
das bactérias Gram-negativas. Enxaguar a lâmina sob um fio de água da torneira para remover 
excesso de solvente. 
5º Passo - Aplicação do corante secundário 
 Despejar o corante Fucsina básica sobre a lâmina cobrindo toda a amostra e esperar 30 
segundos. Enxaguar a lâmina sob um fio de água da torneira para remover excesso de solvente. 
Deixar secar. 
6º Passo - Microscopia 
 
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 Examine a lâmina ao microscópio. Será possível observar as bactérias em aumentos superiores a 
100x. 
ATIVIDADE 1 
Preparar os esfregaços com as culturas oferecidas. 
ATIVIDADE 1.1 
Observar no microscópio o material, desenhar a forma o arranjo das mesmas. 
 
 
Aula Prática 04 
Microbiologia básica 
Professora Liziane Schittler 
 
 
TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS 
 
Inoculação ou transferência de uma cultura de microrganismos 
 
– A alça é esterilizada na chama de um bico de 
Bunsen. Os tampões de algodão dos tubos são 
removidos com os dedos da mão que segura a alça de 
platina. 
– As extremidades abertas dos tubos são passadas 
através da chama, a fim de eliminar qualquer 
contaminação em potencial. 
– Com a alça, retira-se uma pequena porção da 
cultura (inóculo) que está em um dos tubos; em 
seguida ela é introduzida no tubo com o meio de 
cultura a ser inoculado. Novamente as bocas dos 
tubos são flambadas, os tampões, recolocados e a 
alça, esterilizada na chama. 
 
Distribuição do meio de cultura em placa de Petri 
Retira-se o tampão de algodão de um tubo 
contendo o meio de cultura e flamba-se a boca do 
tubo à chama do bico de gás. A tampa da placa de 
Petri é levantada em um dos lados, o mínimo possível, 
somente o suficiente para permitir que se coloque aí a 
boca do tubo. Em cada placa são distribuídos 15-20 
mL de meio de cultura, aproximadamente. 
 
Semeadura de um material em placa de Petri 
A tampa da placa de Petri é levantada o suficiente para permitir a introdução da alça de 
platina que transporta o material a semear. Esta é deslizada em várias direções na superfície do ágar, 
de maneira a dar boa distribuição dos microrganismos. 
 
Semeadura do inóculo desenvolvido em meio líquido 
 Um inóculo desenvolvido em meio de cultura líquido pode ser transferido para tubos, 
frascos ou placas de Petri, por meio de uma pipeta, através de fraca sucção. Diminuindo a pressão 
 
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exercida pelo dedo indicador, o líquido escoará da pipeta. Em placas de Petri, geralmente, semeia-se 
0,1mL do inóculo, em seguida espalhado uniformemente na superfície do meio com a alça de 
Drigalsky flambada, tendo-se primeiro o cuidado de resfriá-la numa porção não tocada do meio de 
cultura. 
 
 Repique da placa a tubos de meio líquido e sólido 
Sobre a mesa de trabalho, deverá estar no centro e em frente ao operador, o bico de Bunsen; 
à esquerda, a placa e os tubos a semear, marcados com o nome do material original, o número da 
cultura e a data; à direita, o depósito de alças, pipetas, lápis, etc. Toma-se a alça com a mão direita, 
leva-se ao rubro; com a esquerda, suspende-se a tampa da placas e, resfriando a alça num ponto 
estéril da superfície do meio, toca-se na colônia previamente escolhida; coloca-se a tampa. Com a 
mão esquerda, toma-se da estante um tubo de meio inclinado, com a inclinação para cima; com o 
dedo mínimo e palma da mão retira-se o tampão, flamba-se a boca do tubo e, conservando-o bem 
junto à chama, introduz a alça carregada, até o fundo, sem tocar na boca do tubo e nas paredes 
laterais; a alça é deslizada sobre o meio, sem feri-lo, numa estria em ziguezague, para aproveitar 
bem sua superfície, até em cima. Flambar novamente e tampar. Em seguida, flambar a alça até o 
rubro para eliminar toda a matéria orgânica. 
 
Preparo de meio sintético 
 Um meio constituído de compostos químicos conhecidos é chamado meio quimicamente 
definido ou sintético. Nutriente ágar, caldo simples e outros meios que contêm peptona e extratos de 
carne ou outros tecidos não são quimicamente definidos. Esses extratos são constituídos de uma 
variedade complexa de substâncias, incluindo aminoácidos, vitaminas e carboidratos. Meios 
quimicamente definidos para o crescimento de algumas bactérias, por exemplo, Escherichia coli, 
são de composição relativamente simples. Os ingredientes essenciais são um sal de amônio, glicose 
e sais inorgânicos. Entretanto, a composição de um meio sintético necessária para o crescimento de 
lactobacilos é muito mais complicada; são necessários muitos aminoácidos, vitaminas, sais 
inorgânicos e outros compostos. 
 
 
EXEMPLO DE PREPARO DE MEIO SINTÉTICO 
 
Material: 
- 2 g de Glucose; 
- 4,72 g de sulfato de amônio; 
- 5g de cloreto de sódio; 
- 100 mL de fosfato ácido de potássio m/5; 
- 1000 mL de água destilada; 
- 7,5g de ágar; 
- frascos; 
- vidro de relógio; 
- tubos; 
- balança. 
 
Método: 
1. Pesar os ingredientes acima e colocá-lo em pequenos vidros de relógio; 
2. Medir 1000mL de água e desse volume tomar alíquotas para dissolver os ingredientes que 
estão nas boêmias. Aquecer se necessário; 
3. Depois de dissolvidos, misturá-los e completar o volume para 1000mL; 
4. Acertar o pH para 7 – 7,2; 
5. Dividir a solução em duas partes de 250mL(colocadas em frascos de 500mL) e uma parte de 
500mL (em frasco de 1000mL). 
 
 15 
6. Adicionar 7,5g de ágar aos 500mL. Dissolver em banho-maria. Distribuir 250mL em um 
frasco de 500mL e o restante em tubos de cultura. 
7. Esterilizar em autoclave a 121ºC por vinte minutos. 
8. Os tubos, após esterilização, deverão ser inclinados. 
 
 
ATIVIDADE 1 - PREPARO DE MEIOS DE CULTURA 
 
MATERIAIS: 
 
1. Vidrarias, Equipamentos e Diversos 
 Bastão de vidro; 
 Proveta de 250ml; 
 Erlenmeyer de 250ml; 
 Algodão; 
 Papel (de jornal ou pardo); 
 Tubos de ensaio; 
 Placas de Petry; 
 Espátulas; 
 Autoclave; 
 Estufas; 
 
2. Meios de Cultura 
 Caldo Lauril Sulfato; 
 Ágar PCA (Plate Count Agar). 
 
 
PROCEDIMENTO: Preparo e distribuição de Meio de cultura 
Caldo Lauril Sulfato 
 Preparar 50 ml de Caldo Lauril Sulfato, em um béquer, da seguinte maneira: 
1. Pesar a quantidade conforme instrução do fabricante. 
2. Adicionar a água destilada 
3. Distribuir 10ml do meio de cultura em cada tubo de ensaio, adicionar o tubo de durhan. Tampar 
com algodão de necessário, colocar os tubos em um bécker e cobrí-los com o papel pardo. 
4. Reserve para autoclavar (121°C por 15 min). 
Ágar PCA 
 Preparar 100ml do ágar, em um erlenmeyer, da seguinte maneira: 
1. Pesar a quantidade conforme instrução do fabricante; 
2. Adicionar a água destilada, tampar a bocado frasco com tampão de algodão e aquecer, em forno 
microondas ou em banho-maria, até completa dissolução do ágar. 
3. Autoclavar 121°C por 15 min. 
4. Distribuir o meio de cultura em 5 tubos de ensaio, cerca de 8ml em cada um. 
 
OBS: O restante do meio distribuir em placas de Petry. 
 
 
 
 
 
 
 16 
Aula Prática 06 
Microbiologia básica 
Professora Liziane Schittler 
 
 
ISOLAMENTO BACTERIANO 
 
Trata-se da obtenção de culturas puras (apresenta só uma estirpe de bactérias) de bactérias a 
partir de culturas mistas (apresenta mais do que uma estirpe bacteriana). Pode ser efetuado por 
processos biológicos, usando meios de cultura seletivos, ou por processos mecânicos, sendo a 
técnica de esgotamento (estrias) ou a técnica das diluições as mais utilizadas. 
O esgotamento consiste em isolar a estirpe desejada por arrastamento sucessivo do inóculo 
com a alça de platina, fazendo várias estrias na superfície do meio de cultura. 
 O sucesso da semeadura está em: grande número de estrias, não perfurar o meio, não voltar 
a alça sobre a estria e pegar pequena quantidade de material para semear. 
 Na técnica das diluições, vai-se diluindo sucessivamente o inóculo em água destilada estéril 
ou soro fisiológico. 
 
 
ATIVIDADE 1 – Esgotamento 
 
 Fazer repiques em Ágar PCA, através da alça de platina, com cultura líquida de Escherichia 
coli que encontra-se em tubo de ensaio. Da seguinte maneira: 
 
 
 
 
 
ATIVIDADE 2 – Técnica de semeadura em placa pour-plate 
 
A técnica pour-plate pode ser realizada com o objetivo de se obter colônias isoladas (estudo 
qualitativo) ou para realizar a contagem de colônias em placa (estudo quantitativo). 
Para a realização do estudo quantitativo, deve-se agitar a cultura e transferir l mL desta para 
9mL de líquido de diluição (1:10), agitar este tubo e transferir l mL para outro tubo contendo 9ml 
de líquido de diluição (1:100). A seguir, realizar nova diluição, transferindo 1 ml deste tubo para 
outro contendo 9ml de líquido de diluição (1:1.000). 
Após realizar as diluições, deve ser feito o plaqueamento, agitando-se e retirando-se l ml de 
cada diluição e transferindo para placas estéreis. Em seguida, colocar 15mL à 20ml de ágar fundido 
em cada uma delas. As placas devem ser suavemente submetidas a movimentos rotatórios, visando 
a perfeita mistura da cultura com o ágar; esperar solidificar e inverter as placas. 
Após a inoculação, as bactérias deverão ser incubadas a temperatura ideal para o seu 
desenvolvimento. Como as bactérias com que estamos trabalhando são anaeróbias facultativas e 
mesófilas, elas devem ser incubadas entre 35 e 37°C (estufa bacteriológica). O período de 
incubação deve ser entre 18 e 24 horas, porque estas bactérias possuem tempo de geração de cerca 
de 20 e 30 minutos. 
 
 17 
Aula Prática 07 
Microbiologia básica 
Professora Liziane Schittler 
 
 
METABOLISMO BACTERIANO (PROVAS BIOQUÍMICAS) 
A investigação das atividades metabólicas das bactérias é chamada de Provas Bioquímicas e 
servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espécies de bactérias ou leveduras 
através da verificação das transformações químicas, que ocorrem num determinado substrato, pela 
ação das enzimas de um dado microrganismo. Como muitas vezes um determinado microrganismo 
possui um sistema enzimático específico, promovendo transformação bioquímica específica, as 
provas bioquímicas podem ser utilizadas na prática para a sua caracterização. 
Para a realização das provas bioquímicas é necessário utilizar meios de cultivo especiais 
contendo o substrato a ser analisado e fornecer ao microrganismo as condições nutritivas e 
ambientais necessárias ao seu desenvolvimento. 
As provas bioquímicas baseiam-se em fenômenos como: 
 
• Utilização de fonte de carbono: carboidratos 
 Polissacarídeos: amido, glicogênio etc. 
 Dissacarídeos: maltose, sacarose, lactose etc. 
 Monossacarídeos: glicose. 
 
• Álcoois poli-hídricos: manitol, glicerol, sorbitol. 
 
• Glicosídeos: esculina. 
 
• Utilização de fonte de nitrogênio: proteínas 
 Peptídeos; 
 Aminoácidos. 
 
• Outras substâncias nitrogenadas. 
 
FONTE DE CARBONO 
 
Carboidratos 
 
No experimento a seguir iremos trabalhar com bactérias heterotróficas, as quais utilizam 
carboidratos como fonte de carbono. As bactérias podem utilizar este por duas vias metabólicas: 
oxidação ou fermentação. 
A seguir, serão descritas algumas provas bioquímicas utilizadas para o estudo do metabolismo 
dos carboidratos. Serão realizadas com culturas de E. coli e Proteus sp para que o aluno visualize 
diferentes resultados. 
 
 
ATIVIDADE 1 - TESTE DA LACTOSE 
 
a) Princípio: 
Determinar a capacidade de um microrganismo de hidrolisar a lactose incorporada em um 
meio base com produção de ácido. 
 
 
 18 
b) Bases bioquímicas: 
Os dissacarídeos são muito complexos para entrar numa célula bacteriana para sua 
degradação. Então são catabolizados em monossacarídeos menos complexos por enzimas 
exocelulares (hidrolases), de maneira que possam penetrar nas células, com exceção da lactose, que 
possui uma enzima — a galactose permease — que transporta a lactose para dentro da célula bacte-
riana e, depois, então, é hidrolisada. 
 
c) Composição do meio: 
(Meio base de vermelho-de-fenol) 
Peptona................................................................10,0g 
extrato de carne....................................................l ,0g 
cloreto de sódio...................................................5,0g 
vermelho de fenol................................................0,018g 
água destilada......................................................l.000mL 
 
Indicador de pH - vermelho de fenol 
A concentração dos açúcares (lactose) que deve ser adicionada ao meio base é de 0,5 a 1%. 
 
Condições: 
Ácido (coloração amarela) - pH = 6,8 
Alcalino (coloração rosa) - pH = 8,4 
Neutro - meio não inoculado (coloração laranja)- pH = 7,4 
 
d)Técnica: 
A inoculação da bactéria-teste deve seguir as normas de semeadura em meio de cultura 
líquida descrita na unidade anterior. Incubar a 35°/37°C por 18 a 24 horas. 
 
a) Resultado e interpretação: 
Resultados: 
 
Resultados Cor do meio Interpretação 
Positivo Amarelo Presença de ácido 
Negativo Rosa Ausência de ácido 
 
Interpretação: 
 O microrganismo que possui a enzima lactase tem a capacidade de desdobrar a lactose em 
D-glicose e D-galactose e, com a fermentação desta última, liberar ácidos. 
 O microrganismo que não possui a enzima lactase não libera ácidos e degrada a peptona 
existente no meio, portanto resta no meio NH3. Ora, sabemos que NH3 é uma base e que, na 
presença do indicador, há a viragem deste para pH alcalino. 
 
 
ATIVIDADE 2 - TESTE DA GLICOSE 
 
a) Princípio: 
Determinar a capacidade de um microrganismo fermentar a glicose incorporada a um meio 
base, podendo produzir ácido ou ácido com gás. 
 
 
 19 
b) Composição do meio: 
Meio base de vermelho de fenol (veja composição no item anterior) acrescido de 0,5 a 1% 
de glicose. 
Este caldo é colocado em tubos de ensaio contendo no seu interior tubos de Durham que 
possuem a função de coletar os gases produzidos pela bactéria. 
 
c) Técnica: 
A inoculação da bactéria-teste deve seguir ás normas mencionadas no item anterior. 
 
d) Resultado e interpretação: 
Resultado: 
 
Resultados Cor do meio Interpretação 
Positivo Amarelo sem bolhas no tubo de 
Durham 
Amarelo com bolhas no tubo de 
Durham 
Presença de ácidos sem 
produção de gases. 
Presença de ácidos com 
produção de gases. 
NegativoRosa Ausência de fermentação 
 
Interpretação: 
Todas as bactérias que fermentam a glicose liberam ácidos como produto final e algumas 
liberam gás, além dos ácidos. As bactérias que produzem gás possuem a enzima formiase, que 
degrada o ácido fórmico. 
As bactérias que não fermentam a glicose utilizam o carbono da peptona, ocorrendo o que foi 
relatado no item anterior. 
 
 
ATIVIDADE 3 - TESTE DE VERMELHO-DE-METILA (VM) 
 
a) Princípio: 
Testar a habilidade de um microrganismo em produzir ácidos orgânicos relativamente 
estáveis, a partir da fermentação da glicose, de modo a suplantar a capacidade tampão existente no 
meio de cultivo. 
 
b) Bases bioquímicas: 
Neste teste será pesquisada a fermentação ácida mista, em que as bactérias utilizam a glicose 
como substrato e liberam grande concentração de ácidos como produto final. 
Os principais gêneros que realizam esta fermentação são: Escherichia, Salmonella, Shigella e 
Proteus. 
 
c) Composição do meio: 
(Meio de Clark e Lubs) 
-peptona tamponada ............................................................ 7,0g 
-fosfato dipotássico .............................................................. 5,0g 
 
 
 20 
-glicose ................................................................................. 5,0g 
-água destilada ........................................................... l.000mL 
 
d) Técnica: 
A inoculação da bactéria-teste deve seguir as normas mencionadas no item anterior. Incubar a 
35-370C por dois a cinco dias. 
 
e) Resultado e Interpretação: 
Resultado: 
No momento da leitura, retirar 2,5mL do meio e acrescentar cinco gotas de uma solução 
hidroalcoólica de vermelho-de-metila. O vermelho-de-metila é um indicador que já é ácido e indicará 
os graus de acidez por alterações de cor em uma escala de pH de 4,4 a 6,0. Com o pH de 4,4, o 
indicador ficará vermelho; com a diminuição da acidez (pH = 6,0), o indicador passará para a cor 
amarela. 
 
 
 
 
 
Interpretação: 
Com o pH ácido de 4,4 o meio fica suficientemente ácido para manter o indicador vermelho. 
Os microrganismos VM (+) fermentam a glicose produzindo ácidos e dando um pH final 
muito baixo, vencendo o sistema tampão de fosfato e mantendo o meio ácido. 
Os microrganismos VM (-) produzem ácidos, porém o pH é mais elevado (pH = 6,0) porque 
eles continuam metabolizando os produtos iniciais da fermentação por descarboxilação, produzindo 
acetoína. 
 
Vermelho de metila: 
-vermelho de metila.............................0,1g 
-álcool etílico.......................................300mL 
-água destilada.....................................200mL 
 
ATIVIDADE 4 - TESTE DE VOGUES PROSKAUER (VP) 
a) Princípio: 
Determinar a habilidade de certo microrganismo em produzir um composto neutro, o 
acedmerilcarbinol (acetoína), a partir da fermentação da glicose. 
 
b) Bases bioquímicas: 
Neste teste será pesquisada a fermentação butilenoglicol, na qual as bactérias uniram a glicose 
como substrato e liberam acetoína como principal produto final. 
Os principais gêneros que realizam esta fermentação são o Enterobacter e Aeromonas. 
 
c) Composição do meio: 
 Meio de Clark e Lubs (veja composição no item anterior). 
 
Resultados Cor do meio Interpretação 
Positivo Vermelho pH4,5 
Negativo Amarelo pH6,0 
 
 21 
d)Técnica: 
A inoculação da bactéria-teste deve seguir as normas do item anterior. 
No momento da leitura, retirar 2,5ml do meio e adicionar os seguintes reativos de Barrit 
nesta ordem: 
1) 0,6ml de uma solução de alfa-naftol a 5%; 
2) 0,2ml de uma solução de KOH a 40%; 
3) Agitar o tubo suavemente para oxigenar o meio, a fim de oxidar a acetoína e obter uma 
reação de cor; 
4) Deixar descansar o tubo por mais ou menos 10 a 15 minutos antes de iniciar a interpretação. 
 
e) Resultado e interpretação: 
Resultado: 
 
Resultados Cor do meio Interpretação 
Positivo Vermelho Presença de acetoína 
Negativo Cobre Ausência de acetoína 
 
Interpretação: 
Depois de unir o alfa-naftol e KOH, deve-se agitar suavemente o tubo, para o oxigênio 
atmosférico entrar e oxidar a acetoína, em acetila, sendo que o KOH atua como agente oxidante e o 
alfa-naftol, como catalisador e intensificador de cor. 
Com o uso de um agente oxidante, a cor produzida desaparece rapidamente, sobretudo porque 
o complexo de reação diacetila-peptona pode ser rapidamente oxidado em um composto incolor. 
Portanto, o resultado positivo será de rosa a vermelho e o negativo será cobre, que é a reação 
entre o KOH e o alfa-naftol. 
 
ATIVIDADE 5 - TESTE DO CITRATO 
a) Princípio: 
Determinar se um microrganismo é capaz de utilizar o citrato, como única fonte de carbono 
para seu crescimento com conseqüente alcalinização. 
b) Bases bioquímicas 
Neste teste serão observadas as bactérias que metabolizam o substrato citrato pelo ciclo de 
Krebs (oxidação) ou pelo ciclo de fermentação, resultando como produto final pH alcalino, acetato 
+ formato. 
O meio utilizado para a fermentação do citrato contém sais de amônia inorgânica. Um 
microrganismo que é capaz de usar citrato como uma única fonte de carbono utiliza também sais 
de amônia como sua fonte única de nitrogênio. Os sais de amônia se desdobram em amoníaco com 
conseqüente alcalinidade. 
c) Composição do meio: (Meio de citrato Simmons) 
sulfato de magnésio................................................. 0,2g 
fosfato diidrogenado de amônia.............................. l ,0g 
 
 22 
fosfato dipotássico . ................................................ l ,0g 
citrato de sódio........................................................ 2,0g 
cloreto de sódio....................................................... 5,0g 
agar.......................................................................... 15,0g 
solução alcoólica de azul-de-bromotimol a 1%....... 0,08g 
água destilada...........................................................1000mL 
Indicador de pH: azul-de-bromotimol. 
 
Condições: 
Ácido: coloração amarela, pH = 6,0 
Alcalino: coloração azul-da-prússia, pH = 8,4 
Meio não Inoculado: coloração verde, pH = 6,9 
 
d) Técnica: 
A inoculação da bactéria-teste deve seguir as normas de semeadura em meio de cultura ágar 
inclinado, descrita na unidade anterior. Incubar a 35-37°C por 18 a 24 horas, ou mais tempo, se 
necessário. 
 
e) Resultado e interpretação 
Resultados: 
Resultados Cor do meio Interpretação 
Positivo Azul meio alcalino 
Negativo Verde meio neutro sem crescimento 
 
Interpretação: 
As bactérias que utilizam o citrato como única fonte de carbono terão como resultado 
positivo cor azul (pH alcalino), que é um produto do metabolismo do sal inorgânico acrescentado 
no meio, pois o produto do metabolismo do citrato é difícil de detectar, porque são dois sais. Então 
saberemos que o citrato foi metabolizado, pelo produto do metabolismo do sal inorgânico de 
amônia, pois neste meio foi colocada uma fonte de carbono que é citrato, e uma de nitrogênio, que 
é um sal inorgânico de amônia. 
O teste negativo será verde e sem crescimento, pois a bactéria, não conseguindo utilizar a 
fonte de carbono e nitrogênio do meio, não sobreviverá. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 23 
Aula Prática 08 
Microbiologia básica 
Professora Liziane Schittler 
 
 
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE FUNGOS 
 
Os fungos são microorganismos pertencentes ao reino dos protistas, se subdividem em 
bolores e leveduras e sua reprodução é por meio de esporos. Em condições favoráveis, o esporo 
absorve água, aumenta de tamanho e germina emitindo um tubo germinal. Tais tubosse alongam 
por crescimento da extremidade distal e se tornam filamentosos longos que se ramificam. Cada 
filamento é chamado hifa. Continuando o crescimento, a hifa pode ser dividida em uma cadeia de 
células pela formação de paredes transversais ou septos. Esses septos dividem as hifas em células 
unicelulares e multinucleadas. As hifas que são divididas por septo são chamadas hifas septadas. 
Alguns fungos, entretanto, não desenvolvem paredes celulares, formando as hifas não-septadas. Em 
tais hifas o protoplasma corre livremente através dos filamentos e, neste caso, são chamadas 
cenocíticas. 
Continuando o crescimento, as hifas podem se ramificar muitas e muitas vezes e se 
entrelaçar, formando uma estrutura chamada micélio. A parte do micélio que penetra no substrato, 
digerindo-o e absorvendo-o, é conhecida como micélio vegetativo; a parte que é responsável pela 
produção de esporo e usualmente se estende para o ar é chamado micélio reprodutivo. O micélio 
reprodutivo e seus esporos variam grandemente nas diferentes espécies de fungos e servem para 
classificá-los e identificá-los. 
 A estrutura produtora de esporo é chamada esporóforo. Quando a extremidade terminal do 
esporóforo forma um saco, esse é chamado esporângio e o esporóforo de esporangióforo. Os 
esporos contidos em tais estruturas são denominados esporangiosporos. Quando os 
esporangiosporos estão maduros, o esporângio se rompe pela pressão interna ou é dissolvido por 
enzimas secretadas, e então os esporangiosporos são libertados. Se estes apresentarem flagelos, são 
móveis e chamados zoósporos. O esporângio é então chamado zoosporângio. 
 
 
ATIVIDADE 1 – Preparo do material para visualização dos bolores e leveduras 
 
 Em placas de petry contendo Ágar Batata Dextrose inserir cinco grãos (arroz, pipoca, milho, 
soja, etc.) e incubar em estufa a 25ºC por 5 dias. 
 
 
ATIVIDADE 2 – Visualização da estrutura dos bolores e leveduras 
 
 
2.1 BOLORES 
 
Retirar com auxílio de pinça fragmentos dos bolores e colocá-lo em uma lâmina, adicionar 
uma gota de Azul de Metileno, adicionar uma lamínula sobre a cultura. Visualizar em microscópio 
óptico. Desenhar o que se visualizou. 
 
 
2.2 LEVEDURAS 
 
Retirar uma alçada da cultura de leveduras e colocá-la sobre uma lâmina, adicionar uma gota 
de Lugol, colocar uma lamínula sobre a cultura. Visualizar em microscópio óptico com a objetiva 
de 40X. Desenhar o que se visualizou. 
 
 
 24 
 Aula Prática 
Microbiologia básica 
Professora Liziane Schittler 
 
 
FISIOLOGIA BACTERIANA - CURVA DE CRESCIMENTO 
 Quando uma bactéria chega num local determinado, ela pode precisar de certo tempo para se 
adaptar ao novo ambiente, com condições nutricionais e físico-químicas diferentes (fase lag ou 
latente) (Fig. 1). Uma vez pronta e adaptada às condições locais, a bactéria cresce 
exponencialmente (fase exponencial) e apresenta uma velocidade de duplicação característica para 
cada espécie bacteriana. Esse crescimento chega a um limite máximo (fase estacionária) quando 
acumula-se algum metabólito tóxico ou ocorre uma falta de substratos ou de espaço. É neste 
período em que há produção de esporos para as bactérias que têm essa capacidade. Senão, a última 
fase corresponde à morte da forma vegetativa bacteriana (fase de autólise). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 1: Curva de crescimento bacteriano 
 
 
DETERMINAÇÃO DA CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO 
 
 Foi inoculado em tubo de ensaio contendo 9 mL de caldo BHI o Enterococcus faecium 
com 24 horas de crescimento (já pronto). 
 
Leitura da absorbância: 
 
1. Retire assepticamente 5 mL do caldo de leitura do erlenmeyer e coloque na cubeta do 
espectrofotômetro. Agite cuidadosamente e faça a leitura da absorbância no espectrofotômetro no 
comprimento de onda de 600 nm. 
2. Coloque o erlenmeyer experimental a 37ºC e aguarde o próximo período de amostragem. 
3. Após o término da leitura, trace a curva de crescimento, utilizando o tempo na abscissa e a leitura 
da absorbância na ordenada. 
 
Plaqueamento: 
 
1. No horário reservado para seu grupo retire assepticamente 0,1mL das diluições especificadas pela 
professora, e plaqueie por superfície (utilizando alça de Drigalski). 
2. Incube as placas em posição invertida a 37ºC por 48 horas. 
3. Conte as colônias nas placas para cada intervalo, e calcule o número de microrganismos por mL, 
dividindo o número pela diluição utilizada. 
4. Trace a curva de crescimento utilizando o tempo na abscissa e o número de células na ordenada. 
 
 
 
 
 25 
Tabela - Tempo de incubação e diluições a serem realizadas 
 
Tempo Diluições 
Zero 10-1, 10-2 
1 h 10-2, 10-3 
2h 10-3, 10-4 
3h 10-4, 10-5 
4h 10-5, 10-6 
5h 10-6, 10-7 
6h 10-7, 10-8 
7h 10-8, 10-9 
8h 10-9, 10-10 
 
 
 
Técnica 1 - Antibiograma 
 
Será avaliada a sensibilidade dos 
micro-organismos patogênicos Escherichia Coli ATCC 25922, Salmonella Typhimurium ATCC 
14028, Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes Scott A frente aos 
antibióticos______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________ 
Inocular com o auxilio de suabes as culturas dos micro-organismos patogênicos em placas 
de petri contendo Agar Müller-Hinton (Merck), apresentando uma concentração final de 105 
UFC/mL. Após colocar nas placas de MH os discos com os antibióticos, utilizando pinça estéril (3 
discos por placa). Após incubação a 35 °C por 24 horas observar se houve a formação de halos de 
inibição ao redor dos discos. Os halos estes devem ser medidos com o auxílio de um paquímetro, 
sendo que o tamanho do halo é diretamente proporcional à atividade antimicrobiana.