2. Sítio ativo das enzimas

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MÓDULO 4 - A U L A 2 1
Enzimas II: o sítio ativo das enzimas
Enzimas II
O sítio ativo das enzimas
Objetivos
Na aula passada, você aprendeu que as enzimas são catalisadores biológi-
cos. Elas são capazes de aumentar a velocidade de uma reação em muitas ordens
de grandeza em condições compatíveis com a vida. Nesta aula, você vai entender
que o funcionamento das enzimas deve-se à presença de uma região específica na
enzima capaz de se ligar ao substrato, o sítio ativo. Você vai conhecer também
como as interações moleculares estão envolvidas na interação da enzima com seu
substrato e como estas interações podem ser alteradas.
Pré-requisitos
Para acompanhar bem esta aula, você deve se lembrar de como as proteínas
se organizam no espaço, adquirindo sua estrutura tridimensional. Você deve saber
também quais forças garantem a estabilidade desta estrutura e como ela pode ser
modificada por diferentes fatores externos.
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BIOQUÍMICA IQUÍMICA I
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O sítio ativo
O bom funcionamento das enzimas, ou seja, sua capacidade de diminuir
enormemente a energia de ativação de uma reação, depende da sua interação com
a molécula de substrato. Esta interação ocorre graças à presença, na estrutura das
enzimas, de uma porção bastante particular: o sítio ativo.
Mas o que é o sítio ativo?
O sítio ativo é uma pequena porção da enzima formada a partir do
enovelamento na sua estrutura terciária. Ele apresenta resíduos de aminoácidos,
cujas cadeias laterais são capazes de interagir com o reagente, que passaremos a
chamar a partir desse momento de substrato (Figura 21.1). Desta forma, as rea-
ções enzimáticas dependem da formação de um complexo entre a enzima e seu
substrato. A existência deste complexo foi proposta pela primeira vez em 1880,
por Adolphe Wurtz.
Por volta de 1930, em seu tratado intitulado "Enzimas", J. B. S. Haldane
sugeriu que interações fracas entre a enzima e seu substrato seriam responsáveis
pela distorção desta molécula, levando à catálise da reação. Como veremos mais à
frente, já no início do século XX, Haldane foi capaz de propor corretamente como
as enzimas funcionavam.
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Interações entre as enzimas e seus substratos - especificidade
De que forma as enzimas reconhecem seus substratos e catalisam sua trans-
formação em determinado produto?
O substrato se liga ao sítio ativo da enzima com grande especificidade. Em
1894, Emil Fisher observou que as enzimas glicolíticas distinguiam estereoisômeros
de açúcares. Esta observação levou este pesquisador a propor a hipótese da chave
e fechadura, na qual a especificidade da enzima (fechadura) por seu substrato (cha-
ve) era decorrente da complementaridade geométrica de suas formas (Figura 21.1).
Figura 21.1: Desenho esquemático de uma enzima e seu substrato complementar.
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Esta idéia pressupõe a existência de interações moleculares específicas en-
tre as superfícies da enzima e seu substrato, o que é uma concepção bastante
importante na bioquímica. Entretanto, a hipótese da chave e fechadura não expli-
ca exatamente a grande capacidade catalítica das enzimas. Vamos entender isso,
observando o esquema mostrado na Figura 21.2. A reação imaginária nela repre-
sentada é a quebra de um cilindro em duas partes. Para que isso ocorra, o cilindro
deve ser inicialmente dobrado. Este é o estado de transição desta reação!
Figura 21.2: Esquema de uma reação imaginária sem catalisador (a), com um catalisador com sítio ativo
complementar ao substrato (b) e com catalisador com sítio ativo complementar ao estado de transição
(c). Ao lado, vemos os diagramas de energia referentes a cada reação.
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Enzimas II: o sítio ativo das enzimas
Se imaginamos uma enzima cujo sítio ativo é complementar ao substrato,
ou seja, se no nosso exemplo o cilindro se ajusta perfeitamente ao sítio da enzima,
o que vai ocorrer é que o cilindro não vai se dobrar, e conseqüentemente, não vai
se quebrar. O produto da reação não vai ser formado! Esta enzima estabiliza o
substrato, impedindo que a reação ocorra.
A noção que se tem hoje sobre o funcionamento das enzimas foi inicialmen-
te proposta por Haldene, em 1930, e posteriormente elaborada por Linus Pauling,
em 1946. O sítio ativo deve ser complementar ao estado de transição e não ao
substrato. Assim, quando o substrato se liga à enzima, a interação entre as duas
moléculas favorece a formação do estado de transição.
É claro que o sítio ativo deve também ser capaz de interagir com o substrato,
ou com parte dele, para que o complexo enzima-substrato se forme. Na verdade,
o que ocorre é que inicialmente algumas interações fracas são formadas entre a
enzima e o substrato, tornando possível a ligação destas duas moléculas. Uma
série de outras interações são formadas, favorecendo a distorção da molécula do
substrato, e, enfim, a formação do produto.
As interações moleculares envolvidas na ligação enzima-substrato são da
mesma natureza daquelas que mantêm a ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL das proteí-
nas, ou seja, pontes de hidrogênio, interações eletrostáticas, interações hidrofóbicas
e interações de van der Waals. Este é um dos motivos pelos quais as enzimas são
tão grandes. Os grupos funcionais envolvidos nestas interações devem estar pre-
cisamente localizados para garantir a eficiência do processo catalítico.
Algumas vezes, a primeira interação da enzima com seu substrato resulta
em uma série de mudanças na estrutura tridimensional da enzima. Isso se deve,
justamente, às várias interações formadas durante a ligação do substrato ao sítio
ativo da enzima, que alteram outras interações responsáveis pela estabilização da
conformação da enzima.
As mudanças conformacionais sofridas pela enzima levam à acomodação
de grupos funcionais específicos em posições apropriadas, facilitando a interação
com o substrato. Além disso, permitem a formação de outras interações fracas
necessárias ao estado de transição e, conseqüentemente, favorecem a reação. Este
processo é conhecido como ajuste induzido e foi proposto por Daniel Koshland,
em 1958. Um bom exemplo da ocorrência do ajuste induzido é o caso da
HEXOCINASE, enzima que catalisa a conversão de glicose em glicose-6-fosfato, o
primeiro passo da via de utilização de glicose pelas células. Esta enzima foi crista-
lizada e teve sua estrutura tridimensional determinada na ausência e na presença
de seu substrato, a glicose.
Você vai aprender mais
sobre a HEXOCINASE e
sobre seu papel na
utilização de glicose
pelas células através
da via glicolítica na
disciplina Bioquímica II.
Para ESTRUTURA
TRIDIMENSIONAL,
retorne às aulas de
Proteínas, se desejar.
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Fatores que podem interferir nas reações enzimáticas
Como discutimos até agora, a formação do sítio ativo e sua interação com a
molécula de substrato dependem das interações que mantêm a estrutura
tridimensional da enzima. Assim sendo, tente imaginar alguns fatores que poderi-
am interferir no funcionamento das enzimas, com base nos seus conhecimentos
acerca da estrutura de proteínas adquiridos nas aulas passadas.
Vários fatores podem afetar a atividade das enzimas em conseqüência da
sua capacidade de desnaturar proteínas, ou seja, por sua capacidade de produzir
distúrbios extensos na estrutura tridimensional da enzima. A desnaturação de
enzimas pode se dar por aquecimento, variações de pH, presença de solventes
orgânicos, detergentesou moléculas como uréia ou guanidina. Todas estas condi-
ções levam ao rompimento das interações não-covalentes entre os resíduos de
aminoácidos, presentes na enzima, responsáveis por sua estrutura e pela geome-
tria dos grupos funcionais presentes no sítio ativo.
Solventes orgânicos, como, por exemplo, o etanol, e detergentes perturbam
a estrutura da enzima por favorecerem a exposição das regiões apolares, normal-
mente mantidas no interior da estrutura da proteína, ao meio externo. Isso altera
dramaticamente a estrutura da enzima e de seu sítio ativo, de forma que a ativida-
de catalítica é perdida.
Outros agentes desnaturantes, como a uréia ou a guanidina, são ótimos for-
madores de pontes de hidrogênio. Como pontes de hidrogênio são importantes
para manter a ESTRUTURA NATIVA das proteínas, estas substâncias promovem a sua
desnaturação.
ESTRUTURA NATIVA ou
estado nativo (N) você
já viu na aula 14.
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Efeito do pH
As enzimas apresentam um pH ótimo, no qual sua atividade é máxima. Em
pHs maiores ou menores, sua atividade diminui. Isso ocorre porque as cadeias
laterais de alguns aminoácidos apresentam grupos protonáveis, ou seja, grupos
que podem ser protonados ou desprotonados em função do pH do meio. Estes
grupos podem fazer parte do sítio ativo, influenciando diretamente a ligação do
substrato, ou podem ser importantes para a estabilização da estrutura da enzima
como um todo, indiretamente influenciando no sítio ativo. Além disso, variações
de pH também podem causar mudanças de ionização do substrato, afetando sua
ligação à enzima.
A faixa de pH na qual a enzima funciona melhor pode fornecer pistas sobre
que aminoácidos estão envolvidos na sua atividade. Mudanças de atividade em
pHs próximos a 7.0 devem ser decorrentes da titulação de resíduos de His, en-
quanto mudanças de atividade em pHs mais básicos (em torno de 9.0) refletem a
titulação de Arg e Lis e, em pHs mais ácidos (próximo a 3.0), resultam da titulação
de Glu ou Asp.
Veja na Figura 21.3, o efeito do pH sobre a atividade de duas enzimas: a
pepsina e a glicose-6-fosfatase.
Figura 21.3: Efeito do pH sobre a atividade da pepsina (a) e da glicose-6-fosfatase (b).
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Efeito da temperatura
O aumento da temperatura causa um aumento na velocidade das reações
catalisadas por enzimas, assim como ocorre para todas as reações químicas. Isso
se dá devido ao aumento do número de moléculas que possuem energia cinética
suficiente para sobrepor a barreira energética da reação. Entretanto, as enzimas
desnaturam em decorrência do aquecimento, de forma que sua atividade tende a
diminuir quando a temperatura aumenta. A conseqüência destes dois efeitos opostos
pode ser vista na Figura 21.4. A Figura mostra o efeito da temperatura sobre a
atividade de uma enzima. Você pode notar que até em determinadas temperatu-
ras, o efeito do aquecimento na velocidade da reação predomina e a atividade
enzimática aumenta com o aumento da temperatura; em seguida, a desnaturação
reduz este efeito; chega-se, então, a um ponto que corresponde à temperatura
ótima; e, em seguida, a desnaturação predomina.
Figura 21.4: Efeito da temperatura
na atividade de uma enzima. Neste
exemplo hipotético, a atividade da
enzima é medida enquanto ela é
mantida por um curto período de
tempo em uma dada temperatura.
Até agora, você aprendeu como as enzimas funcionam e que fatores podem
afetar sua atividade. A próxima aula será uma aula prática, na qual vamos avaliar
o efeito de diversos fatores como a concentração de enzima, de substrato, o efeito
de um inibidor, os efeitos da temperatura e do pH sobre a atividade de uma enzima,
a fosfatase alcalina. A partir dos resultados obtidos nesta aula, vamos explorar um
pouco uma área bastante importante da Enzimologia, o estudo da Cinética
Enzimática. Esta área visa explicar como as velocidades de uma reação catalisada
por uma enzima variam em função de uma série de parâmetros.
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Resumo
Nesta aula, você aprendeu o que é o sítio ativo de uma enzima e
como esta porção de sua estrutura é capaz de interagir com o substrato.
Além disso, você descobriu que diversos fatores como a temperatura,
o pH e algumas substâncias químicas podem afetar a atividade de
uma enzima.
Exercícios
1. O termo “ajuste induzido” se refere ao fato de que:
a) Quando o substrato se liga à enzima, a enzima induz uma perda de água
do substrato.
b) A ligação do substrato induz uma mudança conformacional na enzima,
que leva os grupos catalíticos à orientação apropriada.
c) A ligação enzima-substrato induz um aumento da entropia, catalisando,
desta forma, a reação.
d) A especificidade da enzima é induzida pela ligação enzima-substrato.
e) A ligação enzima-substrato induz um movimento ao longo das coordena-
das da reação em direção ao estado de transição.
2. A enzima X exibe atividade máxima em pH = 6,9 e apresenta um acentuado
decréscimo na sua atividade em pHs abaixo de 6,4. Uma provável explicação
para este comportamento é que:
a) A reação depende de uma catálise ácido-base específica.
b) Um resíduo de His da enzima está envolvido na reação.
c) Um resíduo de Glu está envolvido na reação.
d) Esta é uma enzima encontrada no suco gástrico.
e) A enzima possui um cofator metálico.
3. Um bom análogo do estado de transição:
a) É muito instável para ser isolado.
b) Se liga covalentemente à enzima.
c) Se liga à enzima mais fortemente que o substrato.
d) Se liga muito fracamente à enzima.
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Auto-avaliação
Depois de responder cada uma das questões, tente justificar porque consi-
derou determinada resposta como a verdadeira e porque considerou as outras
respostas falsas. Com isso você pode ter uma idéia do quanto está realmente acom-
panhando os conceitos explorados até agora.
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