RELATÓRIO 2 HPLC

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO OESTE DA BAHIA/UFOB
CENTRO DAS CIÊNCIAS EXATAS E DAS TECNOLOGIAS - CCET 
COLEGIADO DE QUÍMICA
Marcelo Santos de Jesus
HPLC
 				 	 	
Barreiras/BA – Brasil 
Agosto/2017
Marcelo Santos de Jesus
HPLC
Relatório apresentado a Universidade Federa do Oeste da Bahia, como requisito parcial para avaliação da Disciplina Cromatografia do Curso de Química.
Orientador:Dr. José Domingo
Barreiras/BA – Brasil 
Agosto/2017
RESUMO
 A Cromatografia é uma das técnicas mais utilizada para a separação dos componentes de uma mistura. Essa técnica foi inicialmente desenvolvida pelo botânico russo M. Tswett, e só tempos depois foi adotada pelos químicos. A classificação mais comumente utilizada para as técnicas cromatográficas leva em consideração o estado físico da fase móvel ou como a fase estacionária é arranjada. Desse modo, A cromatografia líquida de alta eficiência é uma técnica instrumental de cromatografia liquida mais utilizado, empregada para separar e determinar as espécies em diversos materiais orgânicos, inorgânicos e biológicos
OBJETIVOS
 
Estudar a evolução da cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) e realizar análise de amostras.
INTRODUÇÃO
A Cromatografia é uma técnica de separação geralmente utilizada na análise de misturas complexas (vários compostos) como gasolina, pesticidas em frutas, hormônios em carne, antioxidantes em vinho, drogas no sangue e muitas outras. (DOMINGUES, 2013).
Entre os métodos modernos de análise, a cromatografia ocupa um lugar de destaque devido á facilidade com que efetua separação, identificação e quantificação das espécies químicas, por sim mesma ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de análise, como a espectrofotometria ou a espectrometria de massas. (Collins, 2006)
Desse modo, os métodos de separação constituem normalmente uma parte importante das análises e a cromatografia é uma das técnicas mais importante.
Quem primeiro usou a designação cromatografia foi o botânico russo M. Tswett que a utilizou para descrever a separação de pigmentos corados de plantas com uma coluna de vidro contendo CaCO3. Os diversos compostos apareciam como bandas coradas na coluna, (PESSOA, 1993), conforme apresentada na figura abaixo: 
Figura 1: Separação de pigmentos realizada por M. Tswett.
Nos anos após estes primeiros trabalhos de Tswett, outros pesquisadores, especialmente botânicos, aplicaram o método de Tswett com sucesso. Entretanto, os químicos da época ou não tiveram sucesso ou, simplesmente, não aceitaram o conceito. E só a partir da década de 1930, que a cromatografia começou a ter grande importância, quando Kuhn e Lederer “redescobriram” e aperfeiçoaram a cromatografia em coluna, repetindo as experiências do botânico, separando e identificando as xantofilas da gema de ovo, usando uma coluna recheada com carbonato de cálcio pulverizado como fase estacionaria e éter de petróleo como fase móvel. (Collins, 2009).
De modo geral, a cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição desses componentes em duas fases, que estão em contato íntimo. Uma das fases permanece estacionária, enquanto a outra se move através dela. Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fases de tal forma que cada um deles é seletivamente retido pela fase estacionária, o que resulta em migrações diferenciais desses componentes. (Collins, 2006)
Sendo assim, a distribuição, exclusão, partição ou adsorção seletiva dos componentes é um processo de equilíbrio dinâmico e as moléculas dos analitos ora estão retidas na fase estacionária ora deslocando-se com a fase móvel. (Aquino, 2003).
A classificação mais comumente utilizada para as técnicas cromatográficas leva em consideração o estado físico da fase móvel: se for um gás a técnica é denominada cromatografia gasosa (GC, do inglês “Gas Chromatography”), se um líquido será cromatografia líquida (LC, do inglês “Liquid Chromatography”) e se for um fluido no estado supercrítico será cromatografia com fluido supercrítico (SFC, de “Supercritical Fluid Chromatography”). Outra classificação bastante empregada baseia-se em como a fase estacionária é arranjada: se dentro de um tubo, a técnica é denominada cromatografia em coluna; se em uma superfície plana (vidro, metal, papel, etc.) a técnica é denominada cromatografia planar. (DOMINGUES, 2016).
De modo simplificado o esquema geral da classificação das técnicas cromatográficas está representado abaixo:
Figura 2: Esquema geral da classificação das técnicas cromatográficas
Na cromatografia liquida (CL) existe a técnica clássica e a instrumental. Com a evolução desta, várias inovações foram sendo adicionadas, sendo uma delas a passagem contínua de fase móvel dentro da coluna. Tal técnica é denominada eluição, e a fase móvel é chamada de eluente. Outra inovação importante ocorreu na década de 1970 com a diminuição significativa do tamanho das partículas empregadas como fase estacionária (geralmente baseadas em sílica ou óxido de silício), aumentando a eficiência das colunas. (DOMINGUES, 2016). 
A tabela 1 apresenta a diminuição do tamanho das partículas empregadas em CL, bem como, a sua influência na eficiência da coluna.
Tabela 1: Diminuição do tamanho das partículas em LC e sua influência na eficiência da coluna (N).
 Empregando cada vez mais partículas menores, a resistência à passagem da fase móvel ficou crítica e a técnica muito lenta. Dessa forma, a alternativa foi empregar-se uma bomba para pressurizar e empurrar a fase móvel através da coluna, ao invés do uso apenas da pressão gravitacional. Sendo assim, a coluna precisava ser fechada nas duas extremidades, isto facilitou o emprego de uma válvula para introdução de pequenas quantidades de amostra em uma extremidade e de um detector em outra. (DOMINGUES, 2016).
Sendo assim, a cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE), em inglês “High performance liquid chromatography” (HPLC) É um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase móvel que é eluída sobre altas pressões. Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade. (CEFET-QUÍMICA, s/d)
A cromatografia líquida de alta eficiência é o tipo de cromatografia mais utilizado, empregada para separar e determinar as espécies em diversos materiais orgânicos, inorgânicos e biológicos. Esse tipo de método cromatográfico caracteriza-se pelo aumento do número de pratos teóricos, o que está relacionado com a área da fase estacionária, de modo que quanto menor o tamanho da partícula, maior a resistência ao fluxo da fase móvel.( GARCEZ, 2011)
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Equipamento e reagentes
Tabela 2: Equipamento e Reagentes
	Equipamento
	Reagentes
	
HPLC
		
Amostra 
Procedimento:
Evolução da cromatografia liquida de alta eficiência e Analise de amostra
Inicialmente, foi desmontado um HPLC mais antigo, e foi explicado toda parte do equipamento. Logo após, comparou-se com o HPLC mais moderno, pela qual, posteriormente, analisou-se uma amostra para identificar se esta continha cafeína.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A cromatografia liquida de alta eficiência é uma técnica que emprega um conjunto de equipamentos. Tais aparelhos empregados para efetuar a cromatografia a liquido, são chamadas de cromatógrafos a liquido. Assim, existe uma ampla variedade desses cromatógrafos que se diferem pelo custo, variedade e complexidade.
 As figuras abaixo mostram os equipamentos queforam utilizados na prática:
 
 Figura 3: cromatógrafo a liquido antigo Figura 4: cromatógrafo a liquido moderno
A figura abaixo apresenta o esquema geral do HPLC:
Figura 3: esquema geral do HPLC
RESERVATÓRIO DA FASE MÓVEL
O cromatógrafo a liquido antigo tinha a capacidade para apenas um reservatório de fase móvel (FM). Já o mais moderno tinha capacidade para até quatro reservatórios.
O reservatório da fase móvel é o local em que se coloca o solvente ou mistura de solventes, usada como fase móvel para conseguir a seletividade esperada. No geral, o material do reservatório pode ser de vidro, ou aço inoxidável que é mais seguro. Vale ressaltar que o nível de fase móvel no reservatório deve ser controlado, pois se a bomba for ligada sem alimentação da fase móvel, pode resultar problemas mecânicos. (COLLINS, 2006).
BOMBA DE ALTA PRESSÃO
Ambos os cromatógrafos a liquido antigo e moderno possuem uma bomba de alta pressão. Esse sistema é um dispositivo importante, pois está relacionado ao tempo de retenção, reprodutibilidade e sensibilidade do detector. Ele é composto por bomba e controladores de pressão e de vazão. (AQUINO, 2003)
 De modo geral, a bomba deve ter a capacidade de impulsionar um fluxo constante de FM para a coluna. Altas pressões são necessárias para vencer a pressão exercida pelas partículas do material de recheio das colunas cromatográficas. (COLLINS, 2006).
Sistema de injeção de amostras
O cromatógrafo a liquido antigo possuía uma válvula manual para amostragem. No entanto, o moderno possuía um sistema de injeção automática, pela qual a amostra é levada ao sistema através de um vial, padrão para cromatografia apresentado na figura abaixo.
Figura 4: Vial utilizado em HPLC
A válvula de amostragem é conhecida como válvula de seis portas por terem posição para seis conexões. A válvula, estando na posição de carregar, introduz a amostra à pressão atmosférica, com auxílio de uma seringa. Essa amostra deve preencher o espaço interno do tubo capilar e seu excesso vai para um frasco de descarte. A rotação da posição é feita manualmente. Na posição injetar mudam-se as conexões, a FM passa pela alça de amostragem e a amostra é arrastada para a coluna. (COLLINS, 2006).
O esquema dessa injeção de amostras está apresentado abaixo:
Figura 5: Sistema com válvula manual de amostragem
Ainda afirma Collins (2006) que os sistemas com injeção de amostras automáticas (auto injetores) trabalham de maneira similar as válvulas de amostragem só que são operados eletricamente. A vantagem desse injetor é que um grande número de amostras pode ser injetada sem intervenção do analista, permitindo programar injeções até durante a noite, tornando o sistema de uso contínuo.
COLUNA
O cromatógrafo a liquido antigo tinha uma coluna de separação que já estava em desuso, uma vez que ela secou e assim não funcionava mais, conforme figura apresentada abaixo. Entretanto, a coluna do mais moderno estava funcionando normalmente.
Figura 6: Recheio da coluna do cromatógrafo a liquido antigo
No geral, as colunas são feitas de aço inoxidável, polido, com comprimento de 10 a 30 cm, com calibre de precisão (AQUINO, 2003). Os tubos de coluna são cheios com a fase estacionaria conveniente, geralmente sílica ou seus derivados. Como esse material de enchimento é extremamente compactado dentro da coluna, a queda de pressão dentro desses tubos é enorme, fato que obriga as colunas serem curtas e os tubos com paredes espessas, a fim de se evitar deformações internas. (Ciola, 1998) 
Em um cromatógrafo a liquido pode ser usado três tipos de coluna: a coluna de saturação, a coluna de guarda e a coluna de separação.
A coluna de saturação é colocada entre a bomba e o injetor e é usada para condicionar a FM. Esse tipo de coluna era muito usada antigamente. Hoje, com o sucesso das fases quimicamente ligadas, não há necessidade de usar uma coluna de saturação, cujo recheio é igual ao da coluna de separação. Já, a coluna de guarda é colocada entre o injetor e a coluna de separação. Ela possui a finalidade de proteger a coluna de separação e deve ser recheada com a mesma FE ou uma similar à coluna de separação. E a coluna de separação é responsável pela separação dos componentes presentes na amostra. O sucesso ou não de uma análise depende da escolha da coluna, do material de recheio e das condições de operação. (COLLINS, 2006).
DETECTOR 
O cromatógrafo a liquido antigo tinha dois detectores. O equipamento mais moderno também tinha dois detectores (UV e luz dispersiva) e poderia ser acoplado mais detectores.
O detector monitora a fase móvel à medida que elui pela coluna. Ele mede de forma contínua alguma propriedade física ou físico-química da amostra que a contém e envia um sinal para registro. Assim, os detectores são transdutores, isto é, dispositivos capazes de transformar as moléculas que chegam ao seu interior em sinal elétrico. (AQUINO, 2003).
Os detectores podem ser caracterizados como destrutivos e não destrutivos. Detectores ópticos por absorbância no UV e infravermelho etc, são não destrutivos, uma vez que, permite recolher a amostra para posterior caracterização. Os detectores eletroquímicos e espectrômetros de massa são exemplo de detectores destrutivos. (COLLINS, 2006).
ANALISE DE AMOSTRA PARA IDENTIFICAÇÃO DE CAFÉINA NO CROMATÓGRAFO LIQUIDO MODERNO
Para a realização da análise da amostra é necessária a preparação do método. Na prática experimental, utilizamos um método que já estava preparado.
Ao submeter a amostra em um vial no HPLC foi detectado no UV-VIS o seguinte resultado:
Figura 8: Cromatograma da amostra
Ao analisar a amostra comprovou-se a presença de cafeína, conforme mostrada no cromatograma acima.
A cafeína é um composto orgânico da família dos alcaloides. Os alcaloides, por sua vez, são aminas cíclicas que apresentam anéis heterocíclicos contendo nitrogênio. Além de ser um alcaloide, a cafeína é uma amida (substância que apresenta o nitrogênio ligado a um grupo carbonila). (FOGAÇA, s/d). 
 Observe a seguir a estrutura química da cafeína, cuja nomenclatura oficial é 1,3,7-trimetil-3,7-dihidro-1H-purina-2,6-diona:
Figura 7: Formula estrutural da cafeína
A espectrofotometria UV-Vis (ultravioleta-visível) é um dos métodos analíticos mais usados nas determinações analíticas em diversas áreas. A região ultravioleta do espectro é geralmente considerada na faixa de 200 a 400 nm, e a região do visível entre 400 a 800 nm (VINADÉ, 2005).
Ainda segundo Vinadé (2005) os métodos espectroscópicos de análise têm como característica comum a interação da radiação eletromagnética com a matéria. Existe uma relação de proporcionalidade entre a quantidade de radiação absorvida por uma espécie química e a concentração dessa espécie. Essa relação é que permite a quantificação nas amostras.
 Quando a radiação eletromagnética atravessa uma amostra, certas frequências podem ser seletivamente removidas por absorção, um processo pelo qual a energia eletromagnética é transferida para os átomos, íons ou moléculas que compõe a amostra (HOLLER, 2009).
CONCLUSÃO
 Diante do exposto, a cromatografia é um dos métodos de separação dos componentes de uma mistura, mais eficaz e mais utilizado. O HPLC é uma técnica instrumental de cromatografia liquida com uma eficiência muito maior comparado as outras cromatografias que também são líquidas. Com o passar dos anos, a diminuição do tamanho das partículas empregadas na coluna, propiciou cada vez mais a eficiência desse equipamento.
REFERÊNCIAS
 Domingues Nazario, Carlos Eduardo, and Fernando Mauro Lanças. “Suportes Cromatográficos E Fases Estacionárias Para Cromatografia Líquida: Preparo, Evolução E Tendências Chromatographic Supports and Stationary Phases for Liquid Chromatography: Preparation, Evolution and Trends.” Scientia Chromatographica 5.2 (2013): 111–135. Web. 12 Sept. 2017.
 Fogaça, Jheniffer; “Química Da Cafeína. Composição Química E Efeitos Da Cafeína - Brasil Escola.”N.p., n.d. Web. 14 Sept. 2017.
VINADÉ, Maria E. C.; VINADÉ, Elsa R. C. Métodos Espectroscópicos de Análise Quantitativa. Santa Maria: UFSM, 2005.
CEFET-QUÍMICA Unidade Rio de Janeiro ANÁLISE INSTRUMENTAL CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUÇÃO; s/d.
HOLLER, F. J.; SKOOG, Douglas A.; CROUCH, Stanley R. Princípios de Análise Instrumental. 6 ed. Porto Alegre: Bookman, 2009.
CIOLA, Remolo; Fundamentos de cromatografia a liquido de alto desempenho : HPLC; São Paulo: Blucher, 1998.
FOGAÇA, Jennifer Rocha Vargas. "Química da Cafeína"; Brasil Escola. Disponível em <http://brasilescola.uol.com.br/quimica/quimica-cafeina.htm>. Acesso em 14 de setembro de 2017.
COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Fundamentos de Cromatografia . Campinas: Editora da Unicamp, 2006;
COLLINS, C.H.; Os primórdios da cromatografia líquido-líquido; Universidade Estadual de Campinas; Instituto de Química; V.1, 2009;
Aquino; Neto, Francisco Radler de; Cromatografia: princípios básicos e técnicas afins/ Francisco Radler de Aquino Neto, Denise da Silva e Souza Nunes. – Rio de Janeiro: interciencia, 2003.
PESSOA, João Costa; técnicas experimentais: Cromatografia; disponível em: http://www.spq.pt/magazines/BSPQ/574/article/3000592/pdf. Acesso em: 23/08/17.
Garcez, Alexandre G; HPLC (High-Performance Liquid Cromatography); Relatório de Técnicas de Análises Bioquímicas; IFRJ – Campus Maracanã; 2011.