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VIROLOGIA - Micro (Aula 1) Iremos ver: estrutura, classificação e replicação viral; mecanismo de patogenia viral: as armas que os vírus usam para causar lesão de células e diagnóstico laboratorial nas doenças virais (exames complementares para confirmar uma infecção viral) Observamos diferentes estruturas dos vírus (envelopados e não envelopados, com ou sem capsídeos), diferentes métodos de replicação e o conhecimento desses dois facilita o diagnostico laboratorial, o tratamento (novos antivirais podem ser aplicados e aprovados, de acordo com o modo de replicação ou da estrutura do vírus); e a prevenção (conhecer como esse vírus infecta, por exemplo) Métodos de controle: -conhecimento de reservatórios: conhecer de cada vírus, como o da dengue, febre amarela, permite fazer o controle dessa doença -modo de transmissão: como esse vírus se transmite, como fecal-oral; -métodos para inativar vírus de interesse: destruir a causa para fazer vacinas (pode fazer vacina por meio de vírus mortos ou uma vacina atenuada); -vacinas -drogas anti-virais: importante, pois os vírus podem desenvolver resistência aos anti-virais, como ocorre em coquetel de HIV (como também há nas bactérias) Consequência das infecções: -sofrimento seguido de recuperação: doença aguda e resolução dessa sem deixar problemas, como na influenza -doença persistente: como hepatite B, apresentando uma cronicidade -doença fatal: quando chega no órgão alvo (alguns vírus são considerados benignos, mas isso também depende do estado do paciente, saúde, idade, sistema imune e outras doenças associadas), como no vírus da raiva, que ao chegar no SNC é fatal (internação , pode entrar em coma e levar a morte) -doença congênita: como na rubéola – no adulto é benigno, mas no primeiro trimestre pode gerar sequelas irreversíveis (transmissão vertical) -fator contribuinte no câncer: muitos vírus são oncogênicos capazes de induzir transformação e imortalização da célula e desenvolve o tumor, como no vírus da hepatite B -fator contribuinte em outras doenças: se o individuo já possui outra doença associada e adquire outro determinado vírus, isso aumenta o grau de complicação Os vírus podem ser uteis no desenvolvimento de vacinas. Há uma proteína, por exemplo, muito importante para a proteção contra a doença de chagas, só que eu não consigo fazer uma imunização com essa proteína, então eu posso pegar o gene dessa proteína e transfectar em um vírus atenuado (mas vivo), levar o gene a produzir grande quantidade de proteína e induzir uma resposta imune contra essa proteína do T. cruzi; (carreador de qualquer gene para produzir um antígeno que não possua relação com o vírus) Terapia genica: quando o individuo nasce com algum defeito no gene, então eu posso carrear genes com a utilização do vírus como um vetor (pego um gene de uma pessoa normal, faço transfecção para um vírus, infecto o individuo com esse vírus – vai ser uma infecção que não causa doenças, pois é vírus atenuado, mas vai repor esse erro genético hereditário, por produção de proteínas ou vai corrigir um gene defeituoso) Ferramentas para investigar células hospedeiras: auxilia no conhecimento sobre fisiologia da célula hospedeira, que é usada como fabrica na replicação. Transcrição de Bárbara Almeida, Karen Figueiredo e Thaís Gonçalves MEDUERJ 2016 Vírus possuem genoma de acido nucleico DNA ou RNA protegido por uma cobertura proteica chamada de capsídeo , que protege do ambiente, mas também é importante porque possui ligantes para receptores específicos nas células alvo – proteínas para proteção e entrada (VAP – PROTEINA DE ADESÃO OU FIXAÇÃO VIRAL), pois possuem algumas terminações que são ligante nos receptores das células permissíveis que oferecem todo o maquinário necessário para replicação. O primeiro encontro do vírus com a célula-alvo é feita por essa proteínas virais que possuem receptores específicos, ex: EBV que possui receptor somente nas células B humanas, mas há outros tipos de vírus que também podem infectar animais, insetos etc. Envelopes lipídicos: Alguns vírus são chamados de vírus envelopados, possuindo o genoma dentro de capsídeo proteico e em torno desse há um envelope lipídico com algumas proteínas e glicoproteínas (esse envelope é adquirido da célula hospedeira). Sendo de natureza lipídica, ele é menos resistente. Quando o vírus perde a sua proteção proteica, ele fica incapaz de infectar qualquer célula. O vírus de maior resistência ambiental é o não-envelopado (?). O tamanho dos vírus pode variar de 18-380 nm. São parasitas intracelulares obrigatórios, sendo a resposta imune eficaz a celular, a melhor que destruiria seria a CD8/CTL. Slide mostrando comparação com a bactéria Escherichia coli e vírus RNA,DNA, vírus da varíola (grandes) -pico (pequeno com RNA) Propriedades dos vírus: -agentes filtráveis: existem filtros , em que se pega liquido como um soro, urina, passa no filtro e esteriliza bactérias retidas e como os vírus são muito pequenos, eles passam, sendo agentes filtráveis; -parasitas intracelulares obrigatórios -incapazes de produzir energia ou proteínas independentemente da célula hospedeira: vírus não faz nada, ele leva no seu genoma o que precisa, mas toda a sua proteína, síntese porteira, duplicação do genoma, tudo é a célula hospedeira que fornece. Se a célula alvo permissa não possui determinada enzima que o vírus precisa para fabricar componentes estruturais ou não estruturais, ele precisa levar no genoma o gene para codificar o restante para a célula produzir o que ele precisa utilizar (ao contrario desaparece). A máquina do vírus é a célula alvo. -os genomas virais consistem em RNA ou DNA, mas não ambos; -vírus apresentam morfologia com capsídeo desnudo ou com envoltório -componentes virais são organizados e não sofrem replicação por divisão (eles replicam dentro das células, montam as suas partículas, e saem das células por lise celular ou por brotamento, sendo essa ultima de melhor vantagem, pois a célula permanece viva e fechada e a maquinaria celular continua; se há lise celular, ele destrói a fabrica dele). Há vírus que mantém no máximo a célula vírus para aumentar a carga viral (ocorrem muitas replicações); Consequências das propriedades dos vírus: -os vírus não são vivos -os vírus devem ser infecciosos para sobreviver na natureza, infectando planta, inseto, humano; -os vírus devem ser capazes de utilizar os processos das células hospedeiras para produzir seus componentes (RNAm, proteínas e copias idênticas dos genomas virais); -os vírus devem codificar quaisquer processos necessários não oferecidos pelas células hospedeiras (como uma enzima ou proteína importante para a sua replicação viral, ele então deve levar essas proteínas de forma inativa, sendo ativadas dentro das células, pois a célula não tem essa enzima); -necessário a ocorrência de auto-organização dos componentes virais : montagem dos vírus para deixar as células por lise ou brotamento COMPARAÇÃO ENTRE BACTERIAS E VIRUS (SLIDE) Fatores que afetam a faixa de hospedeiro: -receptores da superfície celular: hospedeiro ideal é aquele que possui células que possui receptores que reconhecem as VAP virais, ao contrario não ocorre infecção. As células hepáticas, por exemplo, possuem receptores ideais ao vírus da hepatite. -disponibilidade da maquinaria de replicação: ela deve oferecer toda a maquinaria -habilidade de sair das células e disseminar-se: por lise, ou outra forma de morte celula ou brotamento; -resposta anti-viral do hospedeiro: importante, pois principalmente os vírus com efeitos citopáticos causam lesões; mas a grande maioria das doenças virais, a lesão, inflamação leva a hemorragia , como febre amarela, não é o vírus que causa, massim a resposta imune (imunepatogênica). Então a imunologia é uma faca de 2 gumes, pois se o individuo é muito comprometido, ele tem virose grave ou mesmo benigna. O sistema imune tanto na fase inata quando na adquirida é importante por bloquear ou terminar infecção viral, mas muitas das lesões são causadas pelas respostas imunes, principalmente nos vírus que não fazem efeito citopatico. Dependendo da resposta imune do hospedeiro, ele tem menos ou mais sucesso. Estrutura viral: -a partícula viral : virion -proteína que recobre o genoma: capsídeo. Esses são usualmente simétricos, mas pode ser helicoidal ou icosaédrico. -capsideo + genoma = nucleocapsideo (? Ver no slide) -pode haver ou não o envelope -simetria icosaédrica (20 faces, 12 vértices , 5 pentâmeros) ou helicoidal (comprimento controlado pelo genoma viral e a hélice pode ser firme ou flexível ; como no vírus do Tobaco, que possui um capsídeo com um genoma em hélice circular) -pentons com 5 lados e hexons com 6 lados - o envelope é uma membrana com bicamada lipídica da célula hospedeira, so que proteína na superfície do envelope são proteínas virais. Essas glicoproteínas externas são as VAP , através dessas há reconhecimento de receptores nas células-alvo. Ex: na influenza há uma hemaglutinina que liga a hemácia ou outra célula que contenha esse receptor. É importante, pois é uma proteína de ligação com as células permissível (ao contrario não há adesão ou infecção eficaz) Envelope: adquire o envelope por brotamento a partir da membrana celular. Então quando há uma infecção, já estando dentro das células, já possui componentes prontos, proteínas prontas, o vírus insere essas proteínas virais na superfície da membrana da célula hospedeira e naquele local ele sai por brotamento. Assim, ele não mata a célula, sai por brotamento, a célula recupera a membrana. Então o brotamento possibilita a liberação do vírus sem causar morte célula. O envelope possui proteínas virais e não da célula hospedeira (codificadas pelo vírus). A perda do envelope resulta na perda da infectividade (somente nos vírus envelopados), pois perde o ligante para a célula hospedeira. A mesma coisa ocorre com o vírus não envelopado e o capsídeo. Se há perda desse ultimo, ele não infecta mais nenhuma célula, pois não pode reconhecer célula-alvo (não possui VAP). O envelope também pode ser adquirido por lise celular. O mais comum é por brotamento, mas quando a “fabrica” esta muito cheia, então ocorre por lise (por alteração da membrana, fazendo com que ocorra lise). Muitos vírus prolongam a vida das células “para usar e abusar da fabrica” , enquanto outros imortalizam as células, sendo denominados de vírus oncogênicos. No não envelopado, só ocorre por lise. Revisando.... -icosaédrico -icosaédrico envelopado -helicoidal -helicoidal envelopado -morfologia complexa Agentes não convencionais -são mais simples que os vírus, chamados de viróides; -composto somente por RNA, não codifica para proteína (não possui nada para codificar proteínas, o RNA chega na célula e é transcrito) e ate o momento, os viróides conhecidos possuem interesse na botânica; -virus humano da hepatite D : agente delta > esta entre um viróide e um vírus (não é nenhum dos dois completo), sendo o mais simples que mais infecta o homem. É um vírus parasita de outro vírus – vírus da hepatite D somente cresce na presença do vírus da hepatite B ( o tipo D oferece ferramentas para o tipo B) Classificação dos vírus: Pode ser por: tamanho, morfologia, tipo do acido nucleico, características bioquímicas, doença (vírus da encefalite, da hepatite) , modo de transmissão (como os arbovírus que são vírus transmitidos por artrópodes), célula hospedeira, tecido/órgão trópico. Classificação do acido nucleico: -RNA ou DNA -segmentado (genoma continuo) ou não segmentado -linear ou circular -filamento único ou filamento duplo Se o filamento único, pode ser + ou - . Se é genoma RNAm sentido (+) significa que possui o mesmo sentido do RNAm e o que o torna mais fácil de codificar suas proteínas (replicação mais rápida. Se (-), se compara com “filme negativo” ( esse negativo tem que virar RNAm para começar a síntese proteica(?) SLIDE : DIFERENÇA DE RESISTÊNCIA ENTRE VÍRUS ENVELOPADO E NÃO ENVELOPADO Enquanto que em consequência disso podem ser facilmente disseminados (em fomites, das mãos para as mãos, na poeira, em pequenas gotículas). Podem secar e manter a infectividade. Podem sobreviver às condições adversas do intestino. Quais são as condições adversas do intestino? O estômago produz o que? Ácido, acidez gástrica. O fígado produz o que? Bile, que é um detergente. O vírus não envelopado resiste aos ácidos graxos e à ação da bile. Podem ser resistentes a detergentes e ao tratamento inadequado do esgoto. Os anticorpos podem ser suficientes para imunoproteção, ou seja, um anticorpo formado contra a proteína de adesão viral vai ligar a ela e impedir a infecção pelo vírus, impedindo a interação dele com a célula- alvo. A ação dos anticorpos é importante para evitar a infecção. Depois da infecção já instalada, sendo o vírus intracelular, os anticorpos são pouco eficazes. Agora os vírus com envoltório, com envelope. Componentes: membrana com bicamada lipídica, lipídios, proteínas e glicoproteínas virais. Propriedades: lábil, sofre ruptura nas seguintes condições ambientais: não resiste ao meio ácido, detergentes, ressecamento, calor. Então o vírus influenza, da gripe tem que estar num ambiente úmido, senão ele não resiste. É liberado por brotamento ou lise celular. Consequências: deve permanecer úmido; não pode sobreviver no trato gastrointestinal, então vírus de transmissão fecal-oral, como o da poliomielite tem que ser NÃO ENVELOPADO, para que sobreviva no trato gastrointestinal, caso contrário o envelope será degradado pelo ácidos graxos, pela bile (como o capsídeo é proteico, consegue resistir às ações dos ácidos graxos e da bile, estando o sítio de ligação no capsídeo, este ficará intacto, entretanto, se o sítio de ligação estiver no envelope e este for degradado, o vírus perde a infectividade; por isso, os vírus não envelopados podem ser de transmissão fecal- oral e os envelopados não podem); dissemina-se através de grandes gotículas, secreção, transplante de órgãos e transfusões sanguíneas; não precisa matar a célula para sofrer disseminação; pode necessitar de resposta imune mediada por anticorpos e células para proteção e controle, mas como ele se reproduz por brotamento da célula, a resposta celular é muito importante para destruir a célula infectada; provoca hipersensibilidade (geralmente tardia, mas também pode ser tipo III ou II) e inflamação (causa lesão, mas se não tivesse inflamação seria bem pior, porque a infecção se disseminaria livremente) para causar imunopatogênese. Existe alguma vantagem do vírus ter envelope? Ele não destrói a célula hospedeira, ele sai por brotamento. Aquele vírus que se multiplica muito rápido, mata a célula. Então vamos ver rapidamente as etapas da replicação viral. 1º passo é o reconhecimento da célula-alvo, através de adesão específica, o vírus vai então encontrar a célula com a maquinaria que ele precisa. Fixação à superfície da célula. Penetração: alguns vírus penetram diretamente, os que dependem do pH precisam entrar no fagossomo. Desnudamento, que é a liberação da membrana, envelope e capsídeo. Síntese macromolecular, que é a síntese de proteínas não-estruturais, proteínas que participam da replicação, mas não compõem a estrutura do vírus: síntese inicial de mRNA e proteínas não estruturais: genes para enzimas e proteínas de ligação do ácido nucléico; replicação do genoma; síntese tardia de mRNA e proteínas estruturais (já tem genoma,então vai formar agora as proteínas do capsídeo) (alguns vírus formam o capsídeo separado do genoma e depois inserem o genoma no capsídeo, já outros formam o capsídeo em torno do genoma); modificação pós-tradução da proteína (algumas proteínas virais são glicosiladas, fosfatadas). Organização do vírus. Brotamento dos vírus com envoltório. E liberação dos vírus. Normalmente, uma célula produz cerca de 100 mil vírus. Destes, 10 a 20% são infectantes, os outros sofreram muitas mutações e não são mais infectantes. Os vírus envelopados têm outra vantagem: escapam da resposta humoral; uma célula infectada pode se ligar a uma vizinha não infectada e transferir os vírus para esta. Para destruir essas células, só a ação dos CTL. Nós vamos ver que muitos vírus escapam da ação dos CTL por impedir a síntese de MHC I, que é um mecanismo importante, porque a ação dos CTL é a principal defesa contra vírus. As células sem MHC I dependem da ação das células NK para serem “mortas”. Aqui é um desenho mostrando a temperatura independente da adsorção, requer proteínas de ligação viral (VAP) e receptores celulares. A penetração dos vírus envelopados se dá através de fusão com a membrana plasmática ou via endossomas, através de fusão com a membrana do endossoma ácido. A captação de vírus via endossomas pode se dar por viropexia, endocitose ou pinocitose. Os vírus não envelopados entram diretamente através da membrana plasmática. O desnudamento é necessário para a produção de novos genomas. Após o desnudamento, tem início a fase de eclipse, na qual o vírus está sem o capsídeo e sem o envelope, estando apenas o genoma. Nesse momento o vírus não é infeccioso. A fase de eclipse termina quando as primeiras novas partículas virais são formadas. Síntese de ácido nucleico e proteínas virais: muitas estratégias (cada vírus tem seus meios de sintetizar seu genoma e suas proteínas); o ácido nucleico pode ser produzido no núcleo ou no citoplasma (regra geral: a multiplicação dos vírus de DNA se dá intranuclear e a dos vírus de RNA se dá no citoplasma, mas há exceções, como o HIV, que é um retrovírus, é de RNA, mas a multiplicação se dá intranuclear, o vírus da varíola é de DNA, mas a replicação é intracitoplasmática); a síntese proteica é sempre no citoplasma. Organização e maturação: no núcleo, no citoplasma, na membrana. Liberação: por lise, mais comum nos vírus não envelopados; brotamento através da membrana plasmática que é o mais comum nos vírus envelopados; nem todo vírion liberado é infeccioso (foi o que eu falei para vocês, são liberados cerca de 100 mil, mas apenas 10 a 20 mil são infectantes). Proteínas virais: proteínas estruturais (todas as proteínas em um vírion maduro); proteínas não estruturais (proteínas codificadas pelo vírus, mas não acondicionadas no vírion). Efeitos no hospedeiro: pode inibir a síntese de DNA, RNA ou proteína do hospedeiro (os vírus penetram a fábrica, a célula-alvo e utilizam todas as estruturas para sua própria replicação). Efeito citopático é justamente causado por aqueles vírus que causam lesão na célula, podendo causar morte celular. Uma grande importância do efeito citopático é no diagnóstico histopatológico. Tem vírus que causam efeitos citopáticos característicos, podendo ser identificados pelo patologista. Então, o efeito citopático é qualquer alteração detectável na célula hospedeira: alterações morfológicas, morte, apoptose, crescimento indefinido. A apoptose é interessante para o vírus? Não. Então, nós vamos ver que alguns vírus bloqueiam a apoptose. Bom, como cultivar vírus? Vírus são cultivados normalmente em monocamadas, utilizando-se células contínuas. Pode-se utilizar não só para diagnóstico, como também para quantificar a carga viral (na urina, no líquor, na saliva). Aqui há células em monocamada e podemos observar como elas mudam a sua morfologia quando infectadas (slide 51). É importante mandar o material para ser avaliado pelo laboratório junto à história do paciente: sintomas, viagens recentes, dados de exames. Isso facilita o diagnóstico histopatológico. Isso aqui é o que eu falei, a unidade formadora de placa. Você pode produzir para saber a carga viral. Então, eu tenho a minha monocamada de células. Aí eu adiciono uma espécie de líquido (líquor, urina), um material. Uma partícula viral penetrou a célula e vai começar a replicar. Novas partículas nas células. Há contaminação de células vizinhas. Eu então diluo para poder quantificar. Aqui, por exemplo, eu posso contar 5 na diluição de 1000. Então, há 5 para cada 1000ml da amostra. Patogênese da infecção viral: fase de penetração – pele (tem que haver uma solução de continuidade, uma lesão um corte, não penetram a pele íntegra), aparelho respiratório, aparelho digestivo, aparelho gênito-urinário, conjuntiva (as mucosas ele penetra diretamente, não precisam estar lesadas); fase de disseminação – sangue, linfa, célula nervosa – viremia; período de incubação (pode variar muito, até chegar ao órgão-alvo o vírus vai causar dor de cabeça, mal-estar, os chamados sintomas gripais que muitos vírus provocam, até que atingem o órgão-alvo e causam a doença específica); fase de manifestação dos sintomas (aí a infecção já está estabelecida). Infecção aguda: sistêmica (sarampo), localizada (influenza = gripe). Infecção persistente: crônica (hepatite B, C – a infecção persiste, sem sintomas e continua liberando vírus), latente (herpes, catapora – por exemplo, o indivíduo tem catapora na infância e de repente os sintomas desaparecem, mas o vírus fica ali, ainda que não se replique, podendo recidivar; no caso do vírus da catapora pode causar herpes zoster), lenta (HTLV – retrovírus em geral, podem ficar até 30/40 anos sem apresentar a doença). Aqui está todo o mecanismo de infecção viral: 1. O microorganismo penetra o corpo seguinte para a corrente sanguínea – denominado Viremia Primária (que é baixa); 2. Segue para outros órgãos, onde sua replicação é maior – sendo denominado Viremia Secundária (que é bem alta); 3. Seguem para órgão alvo, onde terão diferentes representações clínicas: - Na pele: Varicela, Varíola. - Nas glândulas salivares: CMV (citomegalovírus), caxumba e EBV (Vírus Epstein-Barr – causa comum de mononucleose). - Nos rins: Vírus lassa (causa febre lassa), Hantavírus e CMV - No cérebro: Polio e Sarampo. Relação entre sítio inicial da infecção viral e produção da doença Local da infecção Infecção Local Infecção Sistêmica OROFARÍNGE Citomegalovírus (CMV) Epstein-Barr (EBV) Herpes Simples 1 TRATO RESPIRATÓRIO Vírus influenza Vírus sincicial respiratório Rinovírus Sarampo Caxumba Rubéola Varicela Vírus Lassa TRATO INTESTINAL Norwalk Rotavírus Hepatite A Polio TRATO GENITAL Papilomavírus Hepatite B Hepatite C HIV Transmissão Viral Modo de transmissão Exemplo Comentário Disseminação respiratória ou salivar Vírus influenza EBV Sarampo Cachumba Transmissão é de difícil controle Disseminação fecal-oral Polio Rotavírus Hepatite A Controle através de medidas públicas de saúde Disseminação Venérea HSV HIV HPV Controle por precauções apropriadas Zoonoses Inseto-Humano Animal-Humano Dengue Raiva Lassa Hantavírus Infecção humana pode ser contolada através do controle de vetores(insetos) e/ou controlando a infecção de animais. Não há ou é raro a infecção entre humanos. Animal-Inseto-Humano Febre amarela Padrões de infecção viral II. Infecção Viral Aguda seguida por períodode latência e reativação viral – Padrão característico de Herpes Vírus, Varicela, Herpes Simples 1, Herpes simples III. Infecção aguda seguida por diminuição da carga viral. Paciente pode estar assintomático, contudo, continua capaz de transmitir vírus pois ainda está infectado. Padrão característico de Hepatite B e Hepatite C. Padrão de resposta durante uma infecção primária aguda I. Na resposta imune inata, os interferons são importantes inibidores da replicação viral. Algumas citocinas e as células NK também são importantes neste tipo de resposta imune. II. Alguns vírus são capazes de vencer a barreira formada pela imunidade inata. Neste período, ocorre uma resposta mediada por células T. Células Th1-Cd4+, células Th2-Cd8+ e CTLs. III. As citocinas produzidas pelas células T serão extremamente importantes para a ativação de células B. IV. As células B uma vez ativadas produzem anticorpos específicos contra os patógenos. - Os corpúsculos de inclusão são facilitadores do diagnóstico direto. - Todas essas estruturas são facilitadoras do diagnóstico laboratorial. Principalmente a histopatologia. Diagnóstico laboratorial das infecções virais - Espécime clínico: natureza, coleta, transporte,manutenção. A coleta pode, dependendo da virose, ser o líquor, o sangue, fezes, urina. O importante é o transporte. Se for um vírus envelopado, o transporte deve ser o mais rápido possível, já que uma coleta contaminada com bactérias e fungos pode determinar a morte do vírus. Esse transporte deverá ser feito em temperatura ideal, nem congelado, nem com temperatura elevada. Normalmente o transporte é feito em reservatório com gelo (provoca a morte de bactérias e fungos). - Processos laboratoriais: • Exame citopatológico – ECP Pode determinar imediatamente o diagnóstico através da histopatologia. • Microscopia eletrônica e imunoeletrônica Restrita a determinadas instituições. Utiliza anticorpo específico para determinado vírus. Este anticorpo facilita a agregação viral e posterior identificação. Logo, a imunoeletrônica é um facilitador para a detecção rápida de um vírus. • Isolamento e crescimento viral em animal, ovo embrionado, cultura de tecido primário e imortalizado A maioria dos vírus cresce em tecido imortalizado. Efeitos citopatológicos: a. Morte celular: arredondamento da célula, degeneração, agregação, perda da fixação ao substrato b. Alterações histológicas: corpúsculos de inclusão no núcleo ou citoplasma, marginação da cromatina c. Sincícios: células gigantes multinucleadas (fusão celular) d. Alterações da superfície celular: expressão de Ag viral, hemadsorção (expressão de hemaglutinina) – Em cultivo, o vírus infecta a célula, que passa a expressar em sua superfície a hemaglutinina. Se forem adicionadas hemácias à este cultivo, estas aglutinarão. Interação Vírus-Células: Corpúsculos de inclusão Diagnóstico laboratorial das infecções virais Pode ser feito através de três métodos diferentes: • Detecção de proteínas virais a. Perfis protéicos (eletroforese) Certos vírus possuem perfis eletroforéticos diferenciados, permitindo o diagnóstico de imediato. b. Atividades enzimáticas (transcriptase reversa) c. Hemaglutinação e hemadsorção d. Detecção do Ag (fluorescência indireta, ELISA, Western blot) • Detecção de material genético viral a. Perfis de clivagem da endonuclease de restrição específica b. Mobilidades eletroforéticas do RNA para vírus de RNA segmentado (eletroforese) c. Hibridação do genoma de DNA in situ (citoquímica) d. Southern blot (1ª técnica para detectar DNA) e Northern blot e. Reação da polimerase em cadeia – PCR – (DNA) – Importante para detectar carga viral em pacientes com HIV. f. Reação da polimerase em cadeia com transcriptase reversa – RT-PCR – (RNA) • Sorologia (conversão sorológica) Conversão sorológica é importante na confirmação de infecções recentes. Sendo o tílulo normal para determinada infecção 1:32, um paciente que possui titulação 1:120 está infectado. Contudo, não é possível afirmar se essa infecção é recente ou prévia. Por isso, pede-se ao paciente que retorne 3 semanas depois para que outro teste seja feito. Para que a infecção seja determinada recente é necessário que o novo título esteja 4 vezes maior que o título inicial. Ex: Mulher grávida com titulação positiva para rubéola. Testes sorológicos: neutralização, inibição da hemaglutinação, hemaglutinação passiva, aglutinação látex, Imunofluorescência direta e indireta, ELISA, RIA, Western blot. Neutralização: Teste baseado na especificidade entre partículas virais ou antígenos e anticorpos monoclonais específicos. Quando ocorre a neutralização, há confirmação diagnóstica para a infecção pesquisada. Hemaglutinação passiva: Pega-se o soro do paciente que suspeita-se possuir o anticorpo contra determinado antígeno viral. Caso haja aglutinação das hemácias, a suspeita é confirmada. Se não existem anticorpos no meio as hemácias vão sedimentar naturalmente no fundo da placa, caracterizando o aspecto negativo de teste em botão. Pode ser utilizada tanto para a pesquisa de antígenos quanto de anticorpos. Aglutinação do látex: As partículas do látex são sensibilizados com anticorpo ou antígeno viral. Fazem o mesmo papel da hemácia na Hemiaglutinação passiva, a diferença é que o látex é um material inerte. Imunofluorescência: É definida como uma técnica que possibilita a visualização de antígenos nos tecidos ou em suspensões celulares, por meio da utilização de anticorpos específicos, marcados com fluorocromo, capazes de absorverem a luz ultra-violeta (UV), emitindo-a num determinado comprimento de onda, permitindo sua observação ao microscópio de fluorescência (com luz UV). Dentre os fluorocromos mais comumente utilizados estão: Fluresceína (FITC); Rodamina (TRICT). Após os fluoróforos serem excitados por um determinado comprimento de onda, emitem fótons de luz fluorescentes a um comprimento de onda superior. Imunofluorescência Direta Utiliza-se esta técnica, também conhecida como técnica de camada simples, para detecção de antígenos em amostras clínicas utilizando-se anticorpos marcados com fluorocromos. As etapas deste procedimento compreendem: Fixação do esfregaço da lâmina; Tratamento com anticorpo marcado; Incubação; Lavagem para remover excesso de anticorpos marcados não ligados; Visualização no microscópio fluorescente. As indicações desta técnica são: detecção de vírus, parasitas, antígenos de tumor de amostras ou monocamadas de células do paciente. É utilizado também na identificação da distribuição de um antígeno no interior de um tecido ou compartimento de uma célula. Imunofluorescência Indireta Utiliza-se este tipo de imunofluorescência, também conhecida como técnica de dupla camada, na detecção de anticorpos no soro do paciente por meio de antígenos fixados em uma lâmina, na qual se aplica primeiramente um anticorpo específico não fluorescente. Por fim, coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinados antígenos do primeiro anticorpo usado para reagir com o antígeno. Esta técnica tem como vantagem possibilitar uma fluorescência mais evidente, uma vez que os anticorpos fluorescentes associam-se somente aos anticorpos primários, além de permite trabalhar com diversos anticorpos primários específicos para distintos tipos de antígenos, sendo capaz de identificar qual a classe a qualo anticorpo pertence. Habitualmente, a imunofluorescência indireta é utilizada na detecção de auto-anticorpos, e também, na detecção de anticorpos anti-nucleares encontrados no soro de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico. ELISA: Mesma técnica utilizada na imunofluorescência. Possui também 2 tipos: ELISA indireto (detecção de anticorpos) e ELISA sanduíche (detecção de antígenos). A diferença básica consiste no fato de a imunofluorescência usar fluoróforos e o ELISA usar cromógenos. Western-Blot: O teste de Western Blot é o teste que confere maior segurança. O Western Blot conjuga a ligação do anticorpo específico, em sítios também específicos, uma vez que o anticorpo vai se ligar a proteínas que são separadas por diferentes pesos moleculares . Em um laboratório de pesquisa faz-se um gel que é capaz de separar proteínas. Coloca-se um pente que vai fazer os poçinhos para o gel. No primeiro poçinho que eu escolher, eu vou pipetar um marcador de peso molecular, que é um conjunto de proteínas ou fragmento proteicos com pesos moleculares conhecidos. Esse marcador de peso molecular serve para eu saber qual é a posição da proteína a hora da “corrida”. Aí eu aplico uma corrente elétrica que vai fazer as proteínas migrarem, separando-se no gel pelo peso molecular (e eu vou saber o peso molecular por causa do marcador). Até aí não vi nada.Nesta etapa, transfere-se o gel para uma membrana e é aplicada nova corrente elétrica, que vai fazer com que essas proteínas migrem do gel para membrana. Todas as proteínas estão imobilizadas na membrana. É nessa membrana aonde eu vou colocar a amostra para ver se eu tenho alguma reação positiva. Se esse anticorpo conseguir se ligar ao antígeno que está imobilizado, ele vai ficar fixo ali. Aí eu lavo, coloco um segundo anticorpo, que pode ser conjugado a uma enzima que produz alteração de cor ou que produz luminescência. Esse segundo anticorpo só vai se ligar se tiver anticorpo em amostra e aí vai imprimir naquela posição do antígeno, no peso molecular que eu quero, vai se precipitar o substrato. Aí eu lavo de novo, coloco a membrana dentro de um cassete de filme, coloco um filme de raio-X e exponho. Aí eu tenho uma banda que corresponde ao tamanho da banda que eu espero, porque aqui do lado eu tenho um marcador e na hora que eu junto com o filme, eu vejo qual o tamanho da banda.
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