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Técnicas de Imunodiagnóstico I: Precipitação, Aglutinação e Lise Professora: : Amanda Vasconcelos do Nascimento, Bsc em Professora: : Amanda Vasconcelos do Nascimento, Bsc em Biomedicina, UFPE. Mestranda em Biociências e Biotecnologia em Saúde, Fiocruz-PE Testes Imunológicos Qual a utilização ??? Diagnóstico de Diversas Doenças COMO ?? Utilizando técnicas para a detecção e quantificação de antígenos e anticorpos, ou outras substâncias que desepenhem o papel do antígeno no ensaio, tais como drogas, hormônios, ácidos nucléicos, citocinas, receptores celulares, etc. Testes Imunológicos • Reagentes não marcados – Reações de Precipitação – Reações de Aglutinação – Reações de Lise • Reagentes marcados – RIA (Radioimunoensaio) – ELISA – Imunofluorescência – Western Blotting Reações de Precipitação • Para que a imunoprecipitação ocorra, é necessária a equivalência entre quantidades de antígeno e de anticorpo na reação. • O fenômeno de pró-zona ocorre quando há um excesso de anticorpo , e pode causar erros na interpretação dos resultados , sendo necessário a realização da titulação de anticorpos . Reações de Precipitação � Imunodifusão � Imunoeletroforese � Eletroimunodifusão � Automação: Nefelometria e Turbidimetria.� Automação: Nefelometria e Turbidimetria. Imunodifusão • Princípio da Técnica – É baseada na difusão de substâncias solúveis por movimentos moleculares aleatórios – Pode ser realizada em gel de agarose ou em ágar. – A visualização da reação é feita quando há formação– A visualização da reação é feita quando há formação de imunocomplexos de elevado peso molecular, que precipitam no suporte – Fatores como concentração dos reagentes, especificidade e avidez dos soros imunes e a escolha dos extratos antigênicos definem a eficiência do teste. Imunodifusão �Simples: Um dos componentes o antígeno ou o anticorpo é fixado em um suporte sólido enquanto o outro migra até a formação de Imunocomplexo; � Dupla: Os dois elementos migram simultaneamente;Dupla: Os dois elementos migram simultaneamente; �Linear: Possui movimentos orientados para uma direção sob a influência de uma corrente elétrica ou gravidade; �Radial: Movimento das partículas ao acaso e em todas as direções. Imunodifusão simples radial • Método : O anticorpo é fixado no gel e o antígeno é adicionado no poço. • Interpretação : O tamanho do alo formado é proporcional a quantidade de antígeno . Antígeno Anticorpo Imunodifusão dupla radial • Método : Os dois componentes difundem-se em todas as direções até encontrarem-se e formarem o precipitado. • Desvantagens : Possui uma baixa sensibilidade e necessita de uma alta concentração de antígeno e anticorpo. Ex.: Identificação de Determinantes Antigênicos Imunoeletroforese • É a combinação de dois métodos , a eletroforese em gel , seguida da imunodifusão e precipitação das proteínas • Variáveis: Tamanho das partículas , pH do meio, carga,• Variáveis: Tamanho das partículas , pH do meio, carga, concentração, temperatura, viscosidade e intensidade do campo elétrico. Eletroimunodifusão • Método: A migração Ag e do Ac é dirigida por um campo elétrico, aumentando a velocidade de reação e a sensibilidade da técnica. • Pode ser dividida em: – Simples Linear (Laurell ou Foguete) : Anticorpo é– Simples Linear (Laurell ou Foguete) : Anticorpo é incorporado ao gel de agarose. – Dupla Linear ou contra-imunoeletroforese: São pares de orifícios, um contendo Ag e outro contendo Ac e ambos submetidos à eletroforese Técnicas Automáticas de ensaios de Imunoprecipitação • Nefelometria: Reações de precipitação entre Ag e Ac (imunocomplexos) em soluções diluídas produzem aumento da reflexão da luz, que pode ser medida diretamente pela dispersão da luz incidente através de uma cubeta fotométrica. O sinal emitido pode ser matematicamente relacionado àO sinal emitido pode ser matematicamente relacionado à concentração de Ag ou Ac presente na amostra. • Tubirdimetria: A diferença dos sistemas nefelométricos é o sinal de detecção, que neste caso é a absorbância em vez de intensidade de luz dispersa. Reações de Aglutinação • Definição: São caracterizadas pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que possuem determinantes antigênicos em sua superfície. • Método: O Ag ou Ac é adsorvido a micropartículas• Método: O Ag ou Ac é adsorvido a micropartículas insolúveis ou células, permitindo leitura visual e rápida, com a formação de agregados insolúveis. • Vantagens: Elevada sensibilidade; baixo custo; leitura visual; facilidade de execução. • Desvantagens: Reprodutibilidade dos lotes de reagentes; estabilidade da ligação Ag-Ac no suporte. Reações de Aglutinação • Direta : – O Antígeno faz parte naturalmente da célula. Haverá aglutinação dessas células quando em contato com amostra contendo anticorpos contra este Ag. – Ex : tipagem de grupos sanguíneos ABO e Rh.Ex : tipagem de grupos sanguíneos ABO e Rh. Reações de Aglutinação • Inibição da hemaglutinação direta – É baseada na capacidade que certos antígenos virais têm de, espontaneamente, aglutinar certos tipos de hemácias. – A reação é positiva quando não ocorre aglutinação – Detecta Acs contra rubéola, sarampo, influenza, enterovírus .enterovírus . Reações de Aglutinação • Indireta – Emprega a adsorção de Ags solúveis protéicos ou polissacarídeos ou Acs na superfície de micropartículas inertes(suporte). – Micropartículas de látex ou poliestireno são as mais– Micropartículas de látex ou poliestireno são as mais usadas. Reações de Aglutinação • Hemaglutinação indireta – O suporte utilizado para ser sensibilizado com o antígeno é a hemácia • Vantagens da utilização das hemácias – Possui baixo custo; fácil obtenção; podem ser armazenadas por longos períodos; superfície complexa que facilita apor longos períodos; superfície complexa que facilita a ligação de muitos antígenos. • Há kits comerciais para pesquisa de anticorpos com essa técnica – Exs: Trypanosoma cruzi, Treponema pallidum, toxoplasma gondii, etc. Reações de Aglutinação Reações de aglutinação • Inibição da aglutinação indireta – Consiste na adição de antígeno solúvel à amostra contendo anticorpos visando ao bloqueio dos sítios de ligação, para que não reaja com os Ags presentes nas partículas sensibilizadas.sensibilizadas. Reações de Aglutinação • Floculação (VDRL) – O teste de VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) emprega cristais de colesterol que são sensibilizados com lecitina e cardiolipina, para a pesquisa de anticorpos da sífilis.sífilis. – Os Acs contidos na amostra interagem como Ag (cardiolipina), formando imunocomplexos que se depositam sobre cristais de colesterol, formando grumos visualizados em microscopia óptica. Amostras devem ser tituladas, para evitar pró-zona(falso-negativos). Reações de Aglutinação Procura de Acs da doença Reações de Lise • O resultado consiste na presença ou ausência de hemólise. �Ensaios Líticos com toxinas bacterianas �O Teste de Inibição da Hemólise é empregado para pesquisa de Acs antiestreptolisina O (ASO), como auxíliopesquisa de Acs antiestreptolisina O (ASO), como auxílio diagnóstico de infecções crônicas por Streptococcus Beta- hemolítico do grupo A e sua associação com febre reumática. �Fundamento: Os Streptococcus produzem toxinas que provocam lise de hemácias e estimulam a produção de Acs. Reações de Lise Obrigada !!!
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