Relatório de Aula Prática de Micologia Clínica

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UNIVERSIDADE CEUMA
PRÓ-REITORIA DE GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA
COORDENAÇÃO DE BIOMEDICINA
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA DE MICOLOGIA CLÍNICA REALIZADA NO DIA 01 DE NOVEMBRO DE 2016 ADMINISTRADA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DA UNIVERSIDADE CEUMA.
São Luís
2016
TELMA CARVALHO
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA DE MICOLOGIA CLÍNICA DO DIA 01 DE NOVEMBRO DE 2016 ADMINISTRADA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DA UNIVERSIDADE CEUMA.
Relatório de aula prática apresentado ao curso de Biomedicina, na disciplina de Micologia clínica da Universidade Ceuma, para obtenção parcial de nota.
Professor (a): Profª. Drª. Cristina Monteiro.
São Luís
2016
SUMÁRIO
	I. INTRODUÇÃO
	II. O OBJETIVOS DA AULA PRÁTICA
	III. MATERIAIS E MÉTODOS
III-I. MATERIAIS UTILIZADOS NA AULA PRÁTICA
III-II. METODOLOGIA DA AULA PRÁTICA
	IV. RESULTADOS 
	V. CONCLUSÃO
VI. REFERÊNCIAS
	
São Luís
2016
I. INTRODUÇÃO
Durante muitos anos, os fungos foram considerados como vegetais, porém, a partir da década 60, passaram a ser classificados em um reino à parte. Por apresentarem características próprias, tais como: não sintetizar clorofila, não possuir celulose na sua parede celular (exceto alguns fungos aquáticos), e não armazenar amido como substância de reserva, eles foram diferenciados das plantas.
 
São seres vivos eucarióticos, com um só núcleo. Estão incluídos neste grupo organismos de dimensões consideráveis, como os cogumelos, mas também muitas formas microscópicas, como bolores e leveduras. Diversos tipos agem em seres humanos causando várias doenças como, por exemplo, micoses.
Os fungos representam um diverso grupo de organismos ubíquos que tem como principal objetivo degradar a matéria orgânica. Os principais fungos de interesse clinicos apresentam-se sob duas formas: leveduriforme e filamentosos. Os fungos leveduriformes são prevalentemente unicelulares enquanto que os filamentosos são multicelulares. E dependendo da temperatura e ambiente podem ser dimórficos, ou seja apresentam -se sob as duas formas.
Nas ultimas décadas os fungos tornaram-se uma das principais causas de doenças em humanos, principalmente entre indivíduos imunocomprometidos ou hospitalizados com doenças de base grave (ZAITZ et al.,2010)
Nos últimos dez anos, o número de casos de infecções causadas por fungos tem crescido bastante. Estas infecções ocorrem principalmente em ambientes hospitalares e em indivíduos com o sistema imune suprimido (TORTORA, 2010). As leveduras do gênero Candida são descritas como os maiores agentes de infecção hospital, e estas estão relacionadas como um empecilho no tratamento e recuperação de pacientes graves, com o sistema imune comprometido e indivíduos em período pós-operatório (ANVISA, 2004).
Não somente leveduras, fungos filamentosos também estão presentes no ambiente hospitalar e podem causar infecções em pacientes comprometidos. Fungos do gênero Aspergillus sp. (Aspergillus terreus, A. fumigatus, A. flavus e A. niger) são considerados oportunistas, uma vez que costumar infectar pacientes transplantados, aidéticos ou com quadros clínicos graves. A infecção por Aspergillus é chamda de aspergilose, e sua principal transmissão se dá pela inalação de esporos. Outros espécies de fungos patogênicos, incluem Fusarium sp., Acremonium sp. e Penicillium sp.(ANVISA, 2004). 
O rápido diagnostico das infecções fúngicas requer um alto índice de suspeita clinica e uma revisão dos fatores de riscos predisponentes ao paciente. O procedimento operacional padrão na maioria das vezes é submeter à amostra ao exame microscópico após a chegada do material ao laboratório, além disso, a realização de cultura em meios específicos para isolar e identificar o patógeno (MINAMI, 2003). Para isto, é necessário que os profissionais da área da saúde, em especial os que trabalham em laboratórios estejam estar preparados para a identificação dos agentes causadores dessas infecções, assim como conhecer os procedimentos analíticos, os cuidados necessários, as variáveis interferentes, as limitações dos métodos e a interpretação dos resultados (AZEVEDO et al., 2011; GUILHERMETTI et al., 2004).
Assim como em todos os tipos de processos infecciosos, o diagnostico laboratorial da infecção fúngica é diretamente dependente da coleta adequada do material clinico.
 MEIO ÁGAR DIFUSÃO
Para isolamento de fungos a partir de qualquer tipo de amostra, devem ser utilizados meios não seletivos, que permitam crescimento de fungos patogênicos e bolores de crescimento rápido (< de 7dias). Estes fungos, apesar de serem contaminantes de meio ambiente, podem ser agentes de micoses em pacientes suscetíveis, ou seja, são potencialmente, oportunistas. O isolamento desses fungos, em meio de cultura está sendo, cada vez mais, importante para diagnóstico laboratorial das infecções oportunistas.(ANVISA, 2004).
O meio básico em laboratório de micologia é o ágar Sabouraud dextrose (ASD), Para impedir o crescimento de bactérias que poderiam prejudicar o isolamento de fungos usa-se um antibiótico, o cloranfenicol é o mais indicado, pois resiste à autoclavação. Pode ser colocado tanto no ASD como em outros meios de cultura para fungos. Os meios de cultura ditos seletivos para fungos patogênicos contém cicloheximida que inibe parcialmente, ou totalmente, fungos anemófilos. Estes meios são indicados para cultivo de materiais coletados de lesões com suspeita de dermatofitose, para aumentar a sensibilidade no isolamento de dermatófitos. Mas, deve-se ressaltar que esta substância poderá inibir o isolamento de fungos oportunistas, como Aspergillus sp, além de Histoplasma capsulatum na fase leveduriforme e certas leveduras patogênicas dos gêneros Candida e Cryptococcus .(ANVISA, 2004).
 TÉCNICA DE MICROCULTIVO
As técnicas utilizadas para a observação microscópica dependerão do objetivo do estudo, pode-se observar a estrutura fúngica diretamente com o preparo de lâmina, ou fazendo-se o microcultivo, sendo que o primeiro método é o mais utilizado, visto que o microcultivo é utilizado quando se necessita observar as pseudo-hifas e esporos. O microcultivo se fundamenta na cultura do fungo em pequenos pedaços de meio de cultura, entre lâmina e lamínula, onde o crescimento do fungo se espande e fixa na porção inferior da lamínula, que quando retirada com cuidado mantém as estruturas que formam esporos (corpo de frutificação), intacta, o que facilita melhor identificar as características dos fungos. (ANVISA, 2004).
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II. OBJETIVOS DA AULA PRÁTICA
Montar lâmina com fungo filamentoso para visualização.
Observar o aspecto microscópico de fungos filamentosos após microcultivo.
Analisar o aspecto microscópico de fungos filamentosos. 
Testar uma solução teste em meio de cultivo com fungo leveduriforme. 
Aprender a realizar o método de disco-difusão em Ágar.
III. MATERIAIS E METÓDOS
III.I MATERIAIS UTILIZADOS NA AULA PRÁTICA
EPIs (jaleco, luvas e máscaras descartáveis).
Placas de Petri.
Tubos de ensaio com salina estéril.
Meios de cultura (ágar Sabouraud)
Microscópico óptico.
Pipeta.
Agulha.
Ponteira de 1.000. 
Lâminas de fungos filamentosos e leveduriformes.
Alças estéril.
Cultura de Cândida em meio Sabouraud.
Bico de Bunsen.
Solução padrão (Anfotericina B e Itraconazol).
Solução teste (extrato de amendoeira).
Lâmina.
Lamínula.
Swab.
Canudo.
Agulha.
Corante azul de algodão (lactofenol).
Escala de McFarland 0,5.
III.II METODOLOGIA DA AULA PRÁTICA
	Na aula pratica verificamos o resultado do micro cultivo, para isso preparamos primeiro a lâmina faz-se a sua identificação, adiciona duas gotas do corante azul de algodão (Figura 01) e com a alça flambada tira-se a primeira lamínula do microcultivo e põe na primeira gota, flamba a alça e tira a lamínula que está abaixo do pedaço do meio Sabouraud no microcultivo e põe sobre a segunda gota do corante azul de algodão, a partir daí leva parao microscópio para a observação de hifas e esporos. (Figura 02)
Figura 01: Preparação da lâmina. Fonte: Autores, 2016.
Figura 02: Preparação de lâmina	. Fonte: Autores 2016		
No segundo momento da aula prática, foi realizado o Antifungigrama que tem como objetivo testar uma droga ou uma substância como atividade antifúngica. Antes de sua execução tem que se preparar o inóculo do microrganismo a ser testado, pega-se de uma a duas colônias da cultura de Cândida e adicionar no tubo de ensaio com salina estéril agita no Vortex e compara sua turvação com a escala de MacFarland a 0,5 (Figura 03). Com o swab faz estriamento cheio (Figura 04) na placa com Sabouraud e logo após com canudos ou ponteira de 1000 faz poços na placa, a quantidade de poços depende de quantas substâncias a serem testadas, com uma agulha retira-se o meio de cultivo para fica o poço e em seguida acrescentasse 100ul de Anfotericina B, de Itraconzol que são considerada como padrão ouro e no ultimo poço adicionar a solução a ser testada que é o extrato de amendoeira espera 1 hora até secar em temperatura ambiente para inverter a placa e incuba por 48 horas, geralmente esse teste é feito em duplicata. (Figura 05)
Figura 03: Comparação do inóculo com a escala de MacFarland.
Figura 04: esfregaço a partir da cultura de Cândida.
	Figura 03: materiais para o Antifungigrama
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IV RESULTADOS
	
	Nessa aula obteve-se apenas o resultado do microcultivo, que através da preparação da lamina pôde se observar as estruturas do fungo filamentoso Aspergillus que através destas podemos diferenciar as mais variadas espécies de fungos filamentosos, facilitando assim na identificação do causador da possível infecção. (Figura 06) 
	A medição do halo de inibição do ágar difusão será realizado em sala de aula.
Figura 06: visualização microscópica do resultado do microcultivo.
V CONCLUSÃO
	Fungos são os principais agentes de infecções hospitalares em todo o mundo. Conhecidos como “parasitas oportunistas”, agridem em sua grande maioria indivíduos com o sistema imune comprometido, pacientes pós-cirúrgicos, aidéticos e entre outros. Dentre os principais fungos patogênicos, são descritos leveduras do gênero Candida, entre elas, a Candida albicans é considerada o maior causador de infecções no ambiente nosocomial. A aspergilose, infecção causada por fungos do gênero Aspergillus, está entre as principais infecções do trato respiratório. 
Diante disso as técnicas realizadas em aula o micro cultivo e o antifungigrama auxiliam no diagnostico dessas infecções, contribuindo para o tratamento certo do paciente com base na identificação do agente causador, tendo uma recuperação rápida e eficaz. Esse conhecimento adquirido em laboratório contribui de maneira crucial para nossa formação, uma vez que nós como biomédicos realizaremos essas técnicas. 
VI. REFERÊNCIAS 
Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Detecção e Identificação de fungos de importância médica, módulo VI, 2004.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 10 ed. Porto alegre: Artmed, 2010.
Serviço de Referência. Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica. Disponível em:
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_7_2004.pdf. Acesso em: 07 nov 2016.
AZEVEDO, A. C.; BIZERRA, F. C.; MATTA, D. A.; ALMEIDA, L. P.; ROSAS, R.; COLOMBO, A. L. In vitro susceptibility of a large collection of Candida strains against fluconazole and voriconazole by using the CLSI disk diffusion assay. Mycopathologia, Dordrecht, v. 171, n. 6, p. 411-416, jun. 2011.
GUILHERMETTI, E.; KIOSHIMA, E.S.; SHINOBU, C.; SILVA, S. C.; MOTA, V. A.; SVIDZINSKI, T. I. E. Micologia médica: uma área das análises clínicas que está em expansão. Revista Brasileira de Análises Clínicas, Rio de Janeiro, v. 36, n. 1, p. 51-53, jan./mar. 2004.