Micropropagação Hetro e Fotoautotrofica

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MICROPROPAGAÇÃO
Propagação Heterotrófica e/ou 
Fotomixotrófica
MICROPROPAGAÇÃO
Propagação vegetativa in vitro viabiliza a CLONAGEM 
de várias espécies, permitindo a formação de 
INDIVÍDUOS GENETICAMENTE IDÊNTICOS a partir de 
células, órgãos ou pequenos fragmentos (EXPLANTES) 
de uma PLANTA MATRIZ (Genótipo Selecionado).
MICROPROPAGAÇÃO
VANTAGENS:
• Inicia com pequenos partes da planta
• Pequenos espaço é requerido (gde nº)
• Propagação é feita em meio asséptico
• Plantas certificadas livre de vírus em gde nº 
• Mais flexível ajustar fatores que afetam a regeneração 
• Taxa de propagação é muito maior e maior nº de 
plantas num período - Macropropagação 
• Numerosas plantas produzidas em tempo curto
• Propagar clones de difícil e lenta propagação 
• Plantas podem adquirir uma nova caract. Temporária.
(maior nº de estolões morango, plantas ornamentais de vaso com maior brotação)
• Produção é independente da estação do ano
• Material que reproduz vegetativamente pode ser 
armazenado por longo período
• Menor cuidado entre as subculturas (não precisa irrigar, 
pulverizar, plantas invasoras etc.) 
MICROPROPAGAÇÃO
DESVANTAGENS:
• A principal é conhecimento requerido na operação
• Maior gasto no local de produção de propagação
• Métodos específicos para cada espécie e variedade
• O custo é relativamente mais alto
• As plântulas no inicio não produzem matéria orgânica 
suficiente para fotossíntese
• As plântulas não são autotróficas
• As plântulas são mais susceptível a perda de água no 
ambiente externo 
• Cuidado especiais na aclimatização das plântulas –
(decrescendo a umidade e aumentando a intensidade de luz)
1) SELEÇÃO da Planta Matriz
PROCEDIMENTOS BÁSICOS PARA A 
MICROPROPAGAÇÃO
2) TIPO DE EXPLANTE
3) MEIO DE CULTURA
4) CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO
DIVERSOS TIPOS 
DE EXPLANTES
PARA INICIAR 
UM CULTIVO 
in vitro
OS PASSOS BÁSICOS DA MICROPROPAGAÇÃO
Aclimatizar
Planta
Matriz
Explante Micropropagação
Alongamento e
Enraizamento
Planta
ESTÁGIOS (etapas) 
DA MICROPROPAGAÇÃO
1) Estágio 0 – PREPARATÓRIO
2) Estágio 1 - ESTABELECIMENTO
3) Estágio 2 - MULTIPLICAÇÃO
4) Estágio 3 - ALONGAMENTO E ENRAIZAMENTO 
(desenvolvimento)
5) Estágio 4 - ACLIMATIZAÇÃO
Estágio 0 – PREPARATÓRIO
- SELEÇÃO DA PLANTA MATRIZ (espécies e variedades) 
O QUE É ESTE ESTÁGIO? QUAIS OS CUIDADOS DEVEMOS TER?
- IDADE FISIOLÓGICA DA PLANTA, ETC.
- LIVRE DE ALGUM SINTOMA DE DOENÇA
- PODE SER VANTAJOSO TRATAR A PLANTA OU PARTE
CRESCIMENTO, MORFOGÊNESE E TAXA DE PROPAGAÇÃO 
in vitro pode ser aumentado por um AMBIENTE APROPRIADO 
e um PRÉTRATAMENTO DA MATRIZ (químico, adubação etc.)
Estágio 1 – ESTABELECIMENTO
O QUE É ESTE ESTÁGIO? QUAIS OS CUIDADOS DEVEMOS TER?
- CULTURA ASSÉPTICA da planta selecionada (explante)
- SATISFATÓRIO - qdo um número suficiente de explante 
sobreviverem SEM CONTAMINAÇÃO
- Seguido por algum TIPO DE CRESCIMENTO
- Variável - 30 a 60 dias. É comum não utilizar RC p/ melhor 
adaptação do explante.
Estágio 2 - MULTIPLICAÇÃO
O QUE É ESTE ESTÁGIO? 
- MEIO DE CULTURA SUPLEMENTADO com RC
- Nesta fase SUBCULTIVOS SUCESSIVOS (repicagem) 
(NÃO FORÇAR a taxa de multiplicação (TM) NEM PROLONGAR esta fase)
- Intervalo de 30 a 40 dias p/ diversas espécies. Melhor seria 
repicagem durante FASE DE CRESCIMENTO ATIVO das partes aéreas e 
máximo vigor de crescimento com uma TM elevada.
- PRODUÇÃO ADEQUADA de propágulos
Estágio 3 - Alongamento e Enraizamento 
(desenvolvimento)
O QUE É ESTE ESTÁGIO? 
- Algumas espécies precisam passar POR ALONGAMENTO
- É muito importante passo de qualquer propagação in vitro. 
Enraizamento in vitro ADIÇÃO de RC (auxina)
- Uma maneira é REDUZIR A CONCENTRAÇÃO de macro e/ou micro
- Enraizamento ex vitro por meio microestacas
- PREPARAÇÃO para o crescimento no ambiente natural
- Brotos ou plântulas do estágio 2 são pequenas, e não são ainda 
capazes de suportar o seu próprio crescimento no solo.
(Podem ser individual ou “clusters” de brotos)
- Estágio 3 a - alongamento adequado formado no estágio 2 (tamanho adequado)
- Estágio 3 b - enraizamento in vitro ou extra vitrum
MÉTODOS ALTERNATIVOS DE ENRAIZAMENTO DE 
BROTOS MICROPROPAGADOS
Enraizamento
in vitro
Enraizamento
extra vitrum
Estágio de 
multiplicação
Adição de 
solução liq. 
de auxina
em cima do 
agar 
Brotos 
plantados 
em 
substrato 
Brotos enraizados e 
aclimatizados ao 
mesmo tempo
Plântulas enraizadas e 
aclimatizadas 
Plântulas 
enraizadas
Brotos transferidos p/ meio sem 
auxina p/ enraizar
Enraizamento algumas vezes ocorre no 
mesmo meio sem transferir
Brotos separados
Indução de raiz
Cultura de brotos 
no meio com 
auxina
Indução de raiz
Indução 
de raiz
Sem
tratamento
Brotos separados
Base do broto mergulhado em sol. 
de auxina ou pó
Broto cultivado em curto intervalo no 
meio com auxina
Indução de raiz Brotos separados
Brotos plantado em substrato
MÉTODOS DE ENRAIZAMENTO EM BROTAÇÕES
Estágio 4 – ACLIMATIZAÇÃO
O QUE É ESTE ESTÁGIO? QUAIS OS CUIDADOS DEVEMOS TER?
- ATENÇÃO ESPECIAL – pode resultar numa perda grande de plântulas
- Plântula é “FRÁGIL” (2 razões: a) propagação em alta umidade e 
baixa intensidade de luz; b) suprimento de açúcar)
- Pode ocorrer ESTRESSE HÍDRICO E DESIDRATAÇÃO
- Transferir para o ambiente natural
PORQUE DO CUIDADO COM – PLÂNTULAS MICROPROPAGADAS
a) Redução do TECIDO PALIÇÁDICO
b) Qtde de CLOROFILA menor
c) Tecido de SUSTENTAÇÃO FRÁGIL
d) SISTEMA VASCULAR pouco desenvolvido
e) Células com PAREDES DELGADAS E RICAS EM ESPAÇOS 
INTERCELULARES
f) FOLHAS TENRAS E DELGADAS, reduzida qtde de cera e 
fotossinteticamente inativa
g) NÚMERO DE ESTÔMATOS REDUZIDOS e mal funcionamento de 
abertura e fechamento
h) RAÍZES POUCO VASCULARIZADAS (compromete absorção de água e 
nutrientes)
COMO REDUZIR O IMPACTO NO TRANSPLANTIO
Laboratório comercial coloca em 70% da redução de intensidade 
luminosa (Sombrite ou Aluminet) e nebulização com 100% de 
umidade (névoa)
COMO REDUZIR O IMPACTO NO TRANSPLANTIO
Laboratório comercial coloca em 70% da redução de intensidade 
luminosa (Sombrite ou Aluminet) e nebulização com 100% de 
umidade (névoa)
NECESSIDADE DE APROXIMAR AS CONDIÇÕES DO CULTIVO IN VITRO 
AO SISTEMA NATURAL
a) REDUÇÃO DO AÇÚCAR in vitro
b) AUMENTAR A INTENSIDADE LUMINOSA
c) DIMINUIR A UMIDADE (abertura dos frascos antes de levar as 
plântulas p/ casa de vegetação)
d) Utilização de MEMBRANAS POROSAS
COMO REDUZIR O IMPACTO NO TRANSPLANTIO
Necessário fazer um procedimento de HIGIENIZAÇÃO ou TOALETE na plântula
a) Retirada do frasco deve ser em LUGAR FRESCO E 
SEM VENTILAÇÃO
COMO REDUZIR O IMPACTO NO TRANSPLANTIO
Necessário fazer um procedimento de HIGIENIZAÇÃO ou TOALETE na plântula
a) Retirada do frasco deve ser em LUGAR FRESCO E 
SEM VENTILAÇÃO
b) ÁGUA ABUNDANTE para lavagem das raízes e 
eliminação do ágar
c) PODAR AS RAÍZES
PRINCIPAIS MÉTODOS 
DE
MICROPROPAGAÇÃO
PRINCIPAIS MÉTODOS DE MICROPROPAGAÇÃO
Cultura de Meristema
Embriões somáticos
Brotos adventícios
ou
TIPOS DE REGENERAÇÃO
COMO O EXPLANTE PODE 
REGENERAR?
Diferenciar, iniciar ?
PLANTAS COM ALONGAMENTO ou
FORMAÇÃO DE MÚLTIPLOS BROTOS
Cultura nodal com UM ou VÁRIOS SEGMENTOS NODAIS. 
(Pode iniciar da cultura de meristema ou segmento apical, segmento nodal)
CULTURA 
DE 
MERISTEMA
DOME APICAL
2 regiões diferentes
TÚNICA – 1 a 3 camadas de células, 
a mais externa forma a epiderme e 
as outras produzem a folha ousomente epiderme foliar
CORPUS – camada mais interna, 
responsável pela formação do 
restante da planta.
CORPUS – divisão periclinal (paralelo) e anticlinal
TÚNICA – divisão anticlinal (perpendicular)
Ponta da brotação
(tamanho pode 
variar)
5 a 10 mm
CULTURA DE 
GEMA
T + C + PF + folhas 
complet/ formadas
Dome 
meristemático
(25 a 80 micra)
T + C
Ponta do 
meristema
(0,2-1,0 mm)
CULTURA DE 
MERISTEMA
(T + C + PF)
Primórdio 
Foliar (PF)
Local da gema 
axilar
Corte da gema mostrando a localização e o tamanho relativo do -
Dome meristemático; ponta do meristema e ponta da brotação 
DUAS HIPÓTESES DO MERISTEMA 
SER LIVRE DE PATÓGENOS
1) Crescimento contínuo do 
tecido
2) Ausência do tecido vascular 
(floema e xilema)
Fatores que afetam a Variabilidade Genética na CULTURA DE CALOS e 
em plântula regeneradas 
Baixa 
variabilidade 
em plântulas
regeneradas
Alta 
variabilidade 
em plântulas
regeneradas
Genótipos estáveis
ex. diplóides
Genótipos surgem 
alta variabilidade
ex. poliplóides ou 
quimeras
Planta matriz Explante
Explante de tecido 
meristemático
Explante de tecido 
diferenciado
Calos
Calos
Organogênese 
rápida
Frequência de 
subcultivo
Morfogênese
Método de cultura ou 
subcultivo
Subcultivo somente de tecido 
organogênico
Morfogênese
Protoplastos
Longo intervalo entre os 
subcultivos 
Outros fatores que 
influenciam
Meio simples
Baixa concentração de RC
Subcultivo de tec. meristemático
Selecionar um calos semi-
organizado p/ subcultivo 
Organog. na 1ª passagem ou após 
somente poucos subcultivo 
Regenerar a plântula o 
mais rápido possível
Meio rico (alto nível de N)
Alta concentração de RC
Subcultivo tecido 
desorganizado
Longo período de 
cultura antes 
regeneração da plântula
Fator mutagênico 
(químico ou físico)
TIPO DE CULTURA
Brotação
Nodal Muito seguro
Seguro, mas tenha 
certeza que a regen. 
Indireta tbe não 
ocorreu
Evitar, ou se não tem 
método alternativo, 
tomar cuidado 
Reg. Direta de broto ou 
embrião 
Ou
Embriogênese de 
“calos” de Prédet. 
Embr. células
Embriogênese 
indireta de calos
Ou 
Regen. Indireta 
broto de calos
Seguro,
alta taxa de multiplicação pode 
dar problemas .
Evitar brotos adventícios da 
base do calos
Comentários
Métodos de micropropagação Seguro e Menor para produzir plantas com 
variação genética
Não recomendado
FONTE DE VARIAÇÃO EM CULTURA DE GEMA
Evento Resultado Comentário
Bom protocolo Plantas normais
Regulador de 
Crescimento altera 
fisiologia 
da planta
Possibilidade de 
mudanças 
epigenéticas na 
planta
Vantagens e 
desvantagens 
nas possíveis 
mudanças
Perda das 
características 
de quimera
Falha em 
propagar a 
quimera é 
desvantajoso
Possibilidade de 
alterar 
geneticamente a 
planta
Mudanças são 
normalmente 
deletérias
Brotos surgem 
adventiciamente
(base do calos)
Camadas de células no ápice de 
plantas com quimera torna 
rearranjada
(provavelmente devido RCs induzir 
alta anormalidade na taxa de div. 
Celular)
Três métodos de transformação no qual depende da cultura de tecido 
e micropropagação
Isolam/ 
do gene
Plasmídeo
com o DNA
Agrobateriumcom 
plasmídeo
Seleção do 
gene e 
clonagem
Micropartículas 
recoberta com 
DNA
Protoplastos
Eletroporaçãoo ou 
com PEG
Protoplastos
Tecido de folha 
infectado com 
Agrobaterium
Cultivo explante 
com antibiótico 
para matar a 
Agrobaterium
Explante 
bombardeado 
com 
micropartículas
Aplicação do 
antibiótico 
seletivo
Regeneração 
de plântula
Aplicação do 
antibiótico seletivo
Transformação por 
Agrobacterium
Transformação por 
protoplasto
Regeneração 
de plântula
Transformação por 
penetração direta do 
DNA
Regeneração 
de plântula
Formação de 
calos no explante
Regeneração 
de plântula
Dois estágios seleção
Explante no meio 
com antibiótico 
seletivo (seleção 
direta)
Cultura ”Nurse” de 
protoplastos é benefico
Seleção direta de colônias resistentes 
com antibiótico em estágio precoce
PROPAGAÇÃO 
FOTOAUTOTRÓFICA
Heterotrófica Fotomixotrófica Fotoautotrófica
CHO absorção do meio
C02 fixação (fotossíntese)
Cultura com órgão 
ativo 
fotossinteticamente
Cultura sem órgão 
ativo 
fotossinteticamente
Fonte de luz Fonte de luz
Sistema Fotoautotrófico
O conceito desse sistema se baseia no 
fato de que culturas “CLOROFILADAS” 
possuem capacidade fotossintética 
relativamente alta com consequências 
positivas sobre o CRESCIMENTO E 
PERCENTUAL DE SOBREVIVÊNCIA ex 
vitro, aumentada ainda mais com 
AUMENTO DA TAXA DE VENTILAÇÃO
nos recipientes de cultivo (Kozai et al., 
1999).
CO2CO2
Estágio de 
Multiplicação
Alongamento/Enraizamento
Condição 
fotomixotrófica
Condição 
Fotoautotrófica
• „Sugar-free‟
• Alta [CO2]
• Alta DFF(luz)
• Florialite
• Vermiculita
Sistema de micropropagação fotoautotrófico
Sistema de micropropagação fotomixotrófico
Transplantio p/ 
ex vitro
Multiplicação 
e 
enraizamento
Introdução e 
Estabelecimento da cultura 
asséptica
Planta 
ex vitro
Planta 
ex vitro
Introdução e 
Estabelecimento da cultura 
asséptica
Multiplicação 
Enraizamento 
e
alongamento
Aclimatização
(in vitro e ex 
vitro)
Transplantio p/ 
ex vitro
O sistema de CULTURA FOTOAUTOTRÓFICO 
utiliza MEIO SEM FONTE DE AÇÚCARES (“sugar-
free”), tornando o crescimento e o acúmulo de 
carboidratos DEPENDENTE DA FOTOSSÍNTESE E 
DE ABSORÇÃO DE NUTRIENTES INORGÂNICOS 
DO MEIO.
Sistema Fotoautotrófico
Ambiente in vitro x ex vitro
Kozai, 2005
No frasco Na casa de vegetaçãoFatores ambientais
Valores típicos ambientais no frasco e ambiente controlado em casa de 
vegetação para propagação e transplante de plantas.
Irradiação durante fotoperiodo (µmol m-2 s-1)
Velocidade do ar durante fotoperiodo (mm s-1)
Temperatura (C)
Umidade relativa (%)
Concentração CO2 (µmol mol
-1) 
Concentração C2H4 (µmol mol
-1) 
10-100 100-1000
1-20 10-1000
20-30 10-35
80-100 30-100
100-10000 250-400
0-1,0 menor 0,01
VANTAGENS na Micropropagação 
Fotoautotrófica
• Possibilidade de melhor aclimatização do que no sistema convencional
• As desordens morfo-fisiológicas são MINIMIZADAS
• Relativa uniformidade do crescimento e desenvolvimento das culturas
• Perdas de culturas por contaminação são minimizadas
• Há possibilidade de uso de maiores recipientes de cultivo, com ou sem 
ventilação forçada
• Maior possibilidade de controle do ambiente nos frascos de cultivo 
• Maiores taxas de sobrevivência 
TRANSPIRAÇÃO ALTO 
CO2
ALTO 
IRRADIAÇÃO
VENTILAÇÃO
(ALTA TROCA DE 
AR)
BAIXA 
UMIDADE 
RELATIVA
ALTA 
FOTOSSINTESEMEIO LIVRE DE AÇUCAR
FORMAÇÃO DE CERA
Estômato funcional
Extensiva formação de raiz
Alto influxo de oxigênio
Rápida aclimatização ex vitro
Mais rápido crescimento 
ex vitro
Beneficio no crescimento 
da planta
Transpiração
Controle na perda de água Alta absorção de água
e nutrientes
Aumenta a % de
sobrevivência 
ex vitro
- Previne a planta de 
dessecação; 
- Reduz o aquecimento na 
folha
por refletir a luz
Ventilação ForçadaSumário do impacto benéfico da micropropagação sob ventilação forçada
Alta 
SOBREVIVÊNCIA 
ex vitro
Aumenta o
CRESCIMENTO
ALTA TAXA 
FOTOSSINTETICA
ALTA 
CONCENTRAÇÃO
(>1% TÓXICO 
P/PLANTA)
REDUZ O ACUMULO DE 
C02 
NO ESCURO
REDUZ DEPLEÇÃO 
(DIMINUIÇÃO) C02
NA LUZ
CONTROLA UMIDADE 
RELATIVA
Torna possível o
uso de grandes 
frascos
-Aumenta a formação de cera 
-estômato funcional
- aumenta espessura da folha
- estrutura normal do tecido
-Frascos grandes com poros aumenta 
o cresc. da raiz
-Reduz o custo de produção
-Comercialização da produção da 
planta
Segura o nível 
atmosférico de Oxigênio 
(dia e noite)
Reduz o fluxo de 
potenciais gases tóxicos 
(ex. etileno)
-Previne a necrose no calos
-Aumenta conteúdo de clorofila
-Previne hiperhidratação
-Previne queda prematura da 
Folha; Flor e gema
-Previne curvatura da folha
-Aumenta espessura da folha e 
área foliar
Crescimento in vitro de planta de paulownia afetada pela caoncentração de 
sacarose e o material de suporte em 30 dias
em 30 dias
Meio contendo sacarose 
(20 g/L)
Meio livre de sacarose 
(0 g/L)
Agar
Agar
Gelrite
Gelrite
Florialite
Florialite
Areia
Areia
Vermiculita
Vermiculita
Efeito diferente tipo de ventilação no crescimento de planta de Paulownia 
fortunei (Nguyen e Kozai, 2001)
em 28 dias
Ventilação natural
(15 g/L sacarose)
Ventilação forçada
(0 g/L sacarose)
Ventilação naturalVentilação forçada
AgarFlorialiteFlorialite
Aumento do crescimento de plântula de bambu (Pthyrsostachys siamensis) 
em cultivo fotoautotrófico em sistemas de ventilação forçada e natural aos 25 
dias.
Plântula de Zantedeschia elliottiana em 15 dias em meio de cultivo 
no sistema fotomixotrófico e fotoautotrófico
30 g/L sacarose
No sistema
Fotomixotrófico
0 g/L sacarose
No sistema
Fotoautotrófico
30 g/L sacarose
1 mg/L ANA
Fotomixotrófico
0 g/L sacarose
0 mg/L ANA
Fotoautotrófico
0 g/L sacarose
1 mg/L ANA
Fotoautotrófico
Plântula de Cunninghamia lanceolata em 28 dias em meio de cultivo 
no sistema fotomixotrófico e fotoautotrófico
Hypericum (St. John’s wort) aos 21 dias de cultura em sistema 
fotoautotráfico (Pa) ou fotomixotrófico (Pm), a partir de 
segmentos nodais
Measurement
Treatament
Pa Pm
Fresh root mass (mg / plantlet) 163.7 + 14.1 a 9.36 + 0.9 b
Fresh shoot mass (mg / plantlet) 119.9 + 20.5 a 24.5 + 3.6 b
Dry root mass (mg / plantlet) 13.1 + 1.4 a 1.0 + 0.1 b
Dry shoot mass (mg / plantlet) 14.8 + 1.3 a 5.8 + 0.8 b
Number of leaves (number / plantlet) 16 + 1 a 8 + 1 b
Leaf area (cm2) 4.5 + 0.3 a 1.2 + 0.1 b
Pn (µmol h-1 / plantlet) 4.7 + 0.2 a 0.3 + 0.1 b
Elongated rooted plantlets* (%) 100 + 0 a 73 + 8 b
Stomatal density (number / mm2 leaf 
area)
305 + 12 a 232 + 10 b
Chlorophyll concentration (mg g-1 fresh 
mass)
691 + 40 a 463 + 63 b
Couceiro, 2006
 
A 
 
 
B 
Detalhe de estômatos de plantas propagadas in vitro sobre condições 
fotoautotróficas (A) e fotomixotróficas (B) 
Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen(Larema, 2007)
Vedações
- Filme plástico de PVC transparente;
- Tampa rígida de polipropileno (TRP) autoclavável;
- TRP com um orifício* de 10mm;
- TRP com dois orifícios* de 10 mm;
*Cobertos por membranas permeáveis a trocas
gasosas (MilliSeal® AVS-045 Air Vent) de 0,22 m.
Vedação 
Ribeiro et al.
Segmento 
apical
Segmento 
nodal
Plântula de 
segmento 
nodal
Plântula de 
segmento 
apical
Crescimento
X: Ciclo em semanas 
de subcultivo
Um exemplo de micropropagação no sistema 
fotoautotrófico
PRODUÇÃO EM LARGA ESCALA DE STEVIA – BIORATORES 
500 L
 Sistema de Ventilação Natural
 Promoção do crescimento; 
 Fotossíntese;
 Sobrevivência aclimatização;
 Eliminação de desordens 
fisiológicas e morfológicas;
 Menos contaminação.
(Kozai et al., 2005)
MEMBRANAS POROSAS
MEMBRANAS POROSAS
CIDRÃO
SEM AÇÚCAR
0 1 filtro 2 filtros 4 filtros
MALVARISCO
Tipos de sistemas 
de cultivo
BSC 
(mg planta-1)
BSF 
(mg planta-1)
BSR 
(mg planta-1)
BST 
(mg planta-1)
SC 7,49b 18,54d 3,77c 29,80c
SV1 9,26b 26,74c 7,07b 43,07b
SV2 11,89a 32,08b 8,23b 52,20b
SV4 12,41a 38,44a 10,24a 61,09a