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Cromatografia Líquida 
de Alta Eficiência
HPLC
KALIL LELIS CHARANEK KALIL@PEQ.COPPE.UFRJ.BR
21/NOV/2016
Introdução
- O que é HPLC?
- Tipos de separação em HPLC
-Uso do HPLC
- Sistema HPLC
O que é HPLC?
O que é HPLC?
- Cromatografia Líquida (LC)
◦ Injeção da amostra
◦ Tubo com partículas porosas (fase estacionária)
◦ Transporte dos componentes da amostra através do tubo (coluna) por um líquido (gravidade)
- Separação pelo recheio da coluna
◦ Interações físicas / químicas
- Coleta da amostra na saída da coluna
O que é HPLC?
O que é HPLC?
- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
◦ Injeção de pequeno volume de amostra
◦ Tubo (coluna) com partículas (3 a 5 µm) – Fase Estacionária
◦ A amostra é forçada pela da coluna com um líquido (fase móvel) por alta pressão fornecida por bombas
- Separação pelo recheio da coluna
◦ Interações físicas / químicas
- Os compostos separados são detectados no final da coluna por um detector
- LC e HPLC tem o mesmo princípio, sendo HPLC mais eficiente, rápido, sensível e fácil de operar
O que é HPLC?
Tipos de separação em HPLC
Tipos de separação em HPLC
- 4 Principais tipos de separação
◦ Cromatografia de troca iônica
◦ Cromatografia de exclusão
◦ Cromatografia de adsorção ou fase normal
◦ Cromatografia de fase reversa (mais comum)
Tipos de separação em HPLC
- Cromatografia de troca iônica
- Recheio da coluna contém grupos iônicos
◦ Amônio quaternário (Q), ácido sulfônico (S), dietilaminoetil (DEAE), carboximetil (CM), etc
◦ Faixas diferentes de pH
- Fase móvel é tampão em fase aquosa
◦ Fosfato, formiato, etc
Tipos de separação em HPLC
- Cromatografia de troca iônica
- Pouco utilizada
- Indicada para separação de íons orgânicos e inorgânicos em solução aquosa
Tipos de separação em HPLC
Tipos de separação em HPLC
- Cromatografia de exclusão (SEC)
- 2 modos
◦ SEC não aquosa (Cromatografia de permeação em gel – GPC)
◦ SEC aquosa (Cromatografia de filtração em gel – GFC)
- Não há interação entre a amostra e o recheio da coluna
◦ Moléculas difundem nos poros do meio
◦ Separação depende da relação entre tamanho da partícula e tamanho do poro
Tipos de separação em HPLC
- Cromatografia de exclusão (SEC)
- Escolha da fase móvel para dissolver o analito
- Principais aplicações
◦ Caracterização de polímeros
◦ Caracterização de proteínas
Tipos de separação em HPLC
Tipos de separação em HPLC
- Cromatografia de adsorção ou fase normal
- Recheio da coluna é polar
◦ Silica > amino > diol > ciano
- Fase móvel é apolar
◦ Hexano, iso-octano, acetato de etila, etc
- Retenção diminui com o aumento da polaridade da fase móvel
Tipos de separação em HPLC
- Cromatografia de adsorção ou fase normal
- Razões para escolha
◦ Analisar amostras altamente hidrofóbicas
◦ Separação de isômeros
◦ Amostra é em solvente apolar
Tipos de separação em HPLC
- Cromatografia de fase reversa
- Princípio
◦ Partição dos analitos entre fase móvel e fase estacionária (poro)
◦ Adsorção na superfície da fase estacionária
- Interações apolares do analito com superfície hidrofóbica
◦ C8, C18, Fenil, etc
Tipos de separação em HPLC
- Cromatografia de fase reversa
- Diferentes afinidades entre os analitos e a fase estacionária resultam na separação
◦ Analitos mais polares eluem mais cedo
◦ Analitos com grandes partes apolares são retidos por mais tempo
- Fase móvel
◦ Água (tampão)
◦ Água (tampão) com solvente orgânico (Metanol, Acetonitrila)
Tipos de separação em HPLC
- Cromatografia de fase reversa
- Aplicação
◦ Moléculas polares, apolares, ionizáveis e iônicas
- Geralmente empregado gradiente de eluição
Uso do HPLC
Uso do HPLC
- Separação e análise de compostos químicos e biológicos não voláteis
◦ Termicamente instáveis
- Compostos típicos
◦ Fármacos (Aspirina, ibuprofeno, etc)
◦ Sais (Cloreto de sódio, fosfato de potássio)
◦ Proteínas
◦ Polímeros (Poliestireno, polietileno)
◦ Hidrocarbonetos pesados
◦ Moléculas orgânicas pesadas
◦ Produtos naturais (Extrato de plantas)
◦ Compostos termicamente instáveis (Trinitrotolueno, enzimas, etc)
Uso do HPLC
- Análise qualitativa
◦ Identificação de compostos na amostra
- Parâmetro mais comum – tempo de retenção
◦ Dependendo do detector, também estrutura química, massa molar
Uso do HPLC
Uso do HPLC
- Análise quantitativa
◦ Medida da concentração de um composto na amostra
- Relação linear entre área (ou altura) e concentração
- Curva de calibração
◦ Amostra com concentração conhecida
◦ Várias diluições
Uso do HPLC
- Curva de calibração
Uso do HPLC
Uso do HPLC
- Análise de substâncias traço
◦ Composto de interesse
◦ Muito baixa concentração (ordem de µg/L)
- Interesse
◦ Fármacos, biomoléculas, toxicologia, ambiental
- Dificuldade na separação
◦ Detectores muito sensíveis
Uso do HPLC
Compostos mais 
concentrados
Compostos traço
Sistema HPLC
Sistema HPLC
- Bomba
◦ 2 tipos – Isocrática ou Gradiente
- Bomba Isocrática
◦ Composição da fase móvel constante
◦ Solventes pré-misturados
◦ Mais barato
- Bomba Gradiente
◦ Mistura solventes
◦ Pode fazer gradiente ou isocrática
Sistema HPLC
- Bomba
Sistema HPLC
- Condição Isocrática
◦ Composição da fase móvel constante com o tempo
◦ Melhor para separações simples
◦ Aplicação em controle de qualidade
- Condição Gradiente
◦ Mistura solventes (A e B) com o tempo
◦ Análises mais complexas
◦ Utilizado no desenvolvimento de métodos para misturas desconhecidas
◦ Gradientes lineares são mais populares
Sistema HPLC
Sistema HPLC
Sistema HPLC
- Injeção
◦ Manual ou Automática (Autosampler)
- Manual
◦ Usuário injeta amostra no injetor usando seringa
◦ Transfere amostra do injetor pra corrente de fase móvel
◦ A amostra segue então pra coluna
Sistema HPLC
- Autosampler
◦ Usuário coloca vials com amostras na bandeja (Mais de 100 amostras)
◦ Medição automática do volume de injeção
◦ Injeção automática
◦ Lavagem automática do sistema
Sistema HPLC
- Autosampler
Sistema HPLC
- Coluna
◦ Separação dos analitos
◦ Etapa crítica para uma boa análise
- Tipos de coluna
◦ Analítica (Diametro interno 1.0-4.6 nm)
◦ Preparativa (Diametro interno >4.6 nm)
◦ Capilar (Diametro interno 0.1-1.0 nm)
◦ Nano (Diametro interno <0.1 nm)
Sistema HPLC
- Material da coluna
◦ Inox (Mais comum)
◦ Vidro (Biomoléculas)
◦ Polímero (Biocompatível einerte a solventes)
- Recheio
◦ Partículas porosas (Mais comum 1.8, 2.1, 3.5 e 5 µm)
◦ C18, C8, etc
- Retenção do analito
◦ Função do recheio e fase móvel
Sistema HPLC
- Coluna
Sistema HPLC
- Temperatura da Coluna
◦ Reprodutibilidade, Solubilidade e Estabilidade
- Reprodutibilidade
◦ Retenção do analito na coluna é função da temperatura
◦ Se temperatura varia, o tempo de retenção também varia
- Solubilidade
◦ Compostos podem ter baixa solubilidade na fase móvel
- Estabilidade
◦ Alguns compostos (Bio) não são estáveis em temperatura ambiente
Sistema HPLC
- Controle de Temperatura
◦ Forno (mais comum)
Bloco de aquecimento
Coluna
Detectores
Detectores
- Ultra Violeta (UV), Visível (VIS) e Photo Diode Array (PDA – DAD)
- Índice de Refração (RID)
- Fluorescência (FL)
- Espectrometria de Massas (MS)
◦ MS
◦ Q-TOF
Detectores
- Ultra Violeta (UV), Visível (VIS) e Photo Diode Array (PDA – DAD)
Detectores
- Ultra Violeta (UV) e Visível (VIS)
◦ Boa sensibilidade para compostos que absorvem luz
◦ Boa estabilidade
◦ Fácil operação
◦ Depende da escolha do comprimento de onda
◦ UV 195-370 nm (254nm)
◦ VIS 400-700 nm
- DAD
◦ Detecta todo o espectro simultaneamenteDetectores
Detectores
- Índice de Refração (RID)
Detectores
- Índice de Refração (RID)
◦ Mede mudança no índice de refração do sistema
◦ Menor sensibilidade que DAD
◦ Adequado para praticamente todos os compostos
◦ Álcoois, açúcares e íons inorgânicos não absorvem UV
◦ Aplicável quando o solvente absorve UV (GPC)
◦ Relação direta entre intensidade e concentração do analito (SEC)
Detectores
- Índice de Refração (RID)
Detectores
- Fluorescência (FL)
Detectores
- Fluorescência (FL)
◦ Alta sensibilidade para alguns compostos
◦ Compostos absorvem em um comprimento de onda e emitem em outro
◦ Comprimento de onda de excitação
◦ Comprimento de onda de emissão
- Derivatização
◦ Reagir amino ácido com reagente fluorescente
◦ Alta sensibilidade
◦ Muito comum
◦ OPA, Dansyl Chloride, etc
Detectores
- Espectrometria de Massas (MS)
◦ MS
Detectores
- Espectrometria de Massas (MS)
◦ MS
◦ Alta seletividade e sensibildade
◦ Mede a relação massa/carga de partículas carregadas (m/z)
◦ Qualitativo e quantitativo
◦ Comparação com bibliotecas para identificação
Detectores
- Espectrometria de Massas (MS)
◦ MS