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Cromatografia Líquida 
de Alta Eficiência
HPLC
KALIL LELIS CHARANEK KALIL@PEQ.COPPE.UFRJ.BR
22/NOV/2016
O que é HPLC?
- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
◦ Injeção de pequeno volume de amostra
◦ Tubo (coluna) com partículas (3 a 5 µm) – Fase Estacionária
◦ A amostra é forçada pela da coluna com um líquido (fase móvel) por alta pressão fornecida por bombas
- Separação pelo recheio da coluna
◦ Interações físicas / químicas
- Os compostos separados são detectados no final da coluna por um detector
- LC e HPLC tem o mesmo princípio, sendo HPLC mais eficiente, rápido, sensível e fácil de operar
O que é HPLC?
Tipos de separação em HPLC
- 4 Principais tipos de separação
◦ Cromatografia de troca iônica
◦ Cromatografia de exclusão
◦ Cromatografia de adsorção ou fase normal
◦ Cromatografia de fase reversa (mais comum)
Tipos de separação em HPLC
- Cromatografia de troca iônica
Tipos de separação em HPLC
Tipos de separação em HPLC
- Cromatografia de exclusão (SEC)
Tipos de separação em HPLC
Tipos de separação em HPLC
- Cromatografia de adsorção ou fase normal
- Recheio da coluna é polar
◦ Silica > amino > diol > ciano
- Fase móvel é apolar
◦ Hexano, iso-octano, acetato de etila, etc
Tipos de separação em HPLC
- Cromatografia de fase reversa
- Diferentes afinidades entre os analitos e a fase estacionária resultam na separação
◦ Analitos mais polares eluem mais cedo
◦ Analitos com grandes partes apolares são retidos por mais tempo
- Fase móvel
◦ Água (tampão)
◦ Água (tampão) com solvente orgânico (Metanol, Acetonitrila)
Uso do HPLC
- Separação e análise de compostos químicos e biológicos não voláteis
◦ Termicamente instáveis
- Compostos típicos
◦ Fármacos (Aspirina, ibuprofeno, etc)
◦ Sais (Cloreto de sódio, fosfato de potássio)
◦ Proteínas
◦ Polímeros (Poliestireno, polietileno)
◦ Hidrocarbonetos pesados
◦ Moléculas orgânicas pesadas
◦ Produtos naturais (Extrato de plantas)
◦ Compostos termicamente instáveis (Trinitrotolueno, enzimas, etc)
Uso do HPLC
- Análise qualitativa
Uso do HPLC
Uso do HPLC
- Análise quantitativa
Uso do HPLC
- Curva de calibração
Uso do HPLC
Uso do HPLC
- Análise de substâncias traço
Uso do HPLC
Compostos mais 
concentrados
Compostos traço
Sistema HPLC
- Bomba
Sistema HPLC
Sistema HPLC
- Autosampler
Sistema HPLC
- Coluna
Sistema HPLC
- Controle de Temperatura
◦ Forno (mais comum)
Bloco de aquecimento
Coluna
Detectores
- Ultra Violeta (UV), Visível (VIS) e Photo Diode Array (PDA – DAD)
Detectores
- Índice de Refração (RID)
Detectores
- Fluorescência (FL)
Detectores
- Espectrometria de Massas (MS)
◦ MS
Detectores
- Espectrometria de Massas (MS)
◦ MS
Detectores
- Espectrometria de Massas (MS)
◦ MS
◦ Alta seletividade e sensibildade (até fg/L)
◦ Mede a relação massa/carga de partículas carregadas (m/z)
◦ Qualitativo e quantitativo
◦ Comparação com bibliotecas para identificação
◦ Combinação do alto poder de separação do HPLC com o alto poder de detecção da MS
Detectores
- Espectrometria de Massas (MS)
◦ SCAN ou SIM (Selected Ion Monitoring)
Detectores
Detectores
- Estágios da análise LC-MS
◦ Separação dos componentes por HPLC
◦ Conversão em íons na fase gasosa (ionização)
◦ Separação de íons de acordo com a razão m/z
◦ Detector “conta” e amplifica o sinal dos íons 
◦ Alto vácuo
Detectores
- Ionização
◦ Adição ou remoção de elétrons das moléculas do analito
◦ Campos elétricos fortes
◦ API – Atmospheric Pressure Ionisation
- API
◦ ESI – Electrospray Ionization – fase condensada
◦ APCI – Atmospheric Pressure Chemical Ionisation – fase gasosa
◦ APPI – Atmospheric Pressure Photo Ionisation – fase gasosa
Detectores
- ESI
◦ Fase condensada (líquido)
◦ Técnicas de evaporação de íons
◦ Analitos devem estar ionizados
◦ Ionização por pH fase móvel
- Produção de gotículas carregadas
- Desolvação das gotículas
- Produção de íons em fase gasosa de gotículas carregadas
Detectores
Detectores
Detectores
Detectores
- Quadrupolo
◦ Campos elétricos separam íons de acordo com m/z
◦ Quatro varetas paralelas equidistantes
◦ 2 varetas CC e 2 com RF
Detectores
- Quadrupolo
Detectores
- Quadrupolo
- Vantagens
◦ Baixo custo
◦ Reprodutibilidade
- Desvantagens
◦ Baixa resolução
◦ Necessidade de “tuning”
Detectores
- TOF (Q-TOF)
◦ Time of Flight
◦ Íons são produzidos em “pacotes”
◦ Voltagem de aceleração para atrair os íons para o sistema
◦ Íons “voam” por um tubo
◦ Tempo de vôo é função da massa e da carga (m/z)
◦ Íons são detectados simultaneamente
◦ Alta sensibilidade
Detectores
- TOF (Q-TOF)
Detectores
- TOF (Q-TOF)
- Vantagens
◦ Alto limite de detecção
◦ Maior range de massas
◦ Erro de 0.0001 Da
- Desvantagens
◦ Baixa sensibilidade