Cromatografia em camada delgada

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CURSO TÉCNICO DE
QUÍMICA
2º módulo
CAPITULO 8
ANÁLISE QUÍMICA QUALITATIVA
UNIDADE 8.6
CROMATOGRAFIA
PROFESSOR MARCELO DE O. BIOLCATI
AGOSTO DE 2013
SURGIMENTO
Botânico, logrou a primeira
separação cromatográfica em
1903. Em 1906, deu à esta
técnica o nome de
“Cromatografia”
Mikhail S. Tswett, nascido em Asti (Itália) a 14-05-
1872, sendo a família originária da Rússia. Estudou
na Universidade de Genebra (Suíça), mudou-se
para São Petersburgo (Rússia) em 1896 onde
começou a trabalhar como assistente no
laboratório de botânica da Academia de Ciências
dos Imperadores Russos.
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Fase móvel
Fase 
estacionária
Experiência de Tswett
Tswett preparou um
extrato de folhas que
continham clorofila e
xantofila, utilizou éter
de petróleo como fase
móvel dispensando
sobre uma coluna de
vidro preenchida com
carbonato de cálcio
CaCO3
Éter de petróleo
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Depois de alguns minutos ele observou que os pigmentos
separavam-se em diferentes camadas coloridas na
coluna. Daí veio o nome cromatografia, de origem no
grego, “chroma + graphein”, tratada nesta época como
“escrita da cor”.
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O objetivo da cromatografia e separar
individualmente os diversos
constituintes de uma mistura de
substâncias
A cromatografia é um processo de
purificação e/ou separação de
componentes de uma mistura, por ação
do deslocamento de uma fase móvel
sobre uma fase estacionária
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Hoje a cromatografia é o nome dado um conjunto
de técnicas de separação que se baseiam na
diferença de distribuição dos componentes de uma
mistura entre duas fases. Estes métodos permitem
a separação, identificação e quantificação das
espécies químicas de uma amostra ou uma mistura.
Cromatografia em Camada Delgada – CCD
"Thin layer chromatography" - TLC
Desenvolvimento do cromatograma
Todas as técnicas cromatográficas têm em comum a
existência de duas fases: uma estacionária (sólida) e
outra móvel (líquida ou gás) sendo que esta entra em
contato com a primeira e é designada eluente.
A separação dos componentes existentes na fase
móvel verifica-se pela diferença de velocidade dos
mesmos, como conseqüência das diferentes
interações estabelecidas com a fase estacionária.
FASE ESTACIONÁRIA
• Também conhecida como fase adsorvente. É uma
placa recoberta ou sílica;
• Estas placas também podem ser recobertas por
alumina - Al2O3;
• A superfície desta fase porosa apresenta grupos
silanol (-Si-OH) e siloxano (Si-O-Si) que confere
diferentes polaridades à fase estacionária;
PREAPARAÇÃO DA
FASE ESTACIONÁRIA
• As placas cromatográficas são preparadas em
placas de vidro de cerca de 2 mm de espessura,
sendo o tamanho dependente do uso;
• A quantidade de adsorvente (espessura da camada)
deve ser de: 0,3 a 0,5mm para placas para ensaios
qualitativos e de 0,6 a 1,0 ou 3,0mm para ensaios
preparativos
• Para a preparação das placas, o analista deve
primeiramente assegurar a perfeita e completa
limpeza da mesma;
PREAPARAÇÃO DA
FASE ESTACIONÁRIA
• Prepara-se uma suspensão do adsorvente com um
solvente adequado e mantendo-se a placa na
horizontal transfere-se a suspensão para a superfície
da placa, espalhando-se de maneira bem uniforme;
• Essa atividade deve ser feita em estufa a
temperatura entre 105ºC e 110ºC por 30 minutos a 01
hora.
• Deixa-se em repouso por alguns minutos e então
faz-se a ativação das placas que consiste em deixar
a camada de adsorvente completamente seca, livre
do solvente usado no preparo da suspensão;
PREAPARAÇÃO DA
FASE ESTACIONÁRIA
• Opcionalmente, pode-se adquirir no mercado
placas já preparadas: as cromatoflohas de
alumínio que já vêm prontas para o uso;
FASE MÓVEL
• É o solvente ou uma mistura de solventes que têm
papel fundamental na separação de misturas;
• A escolha da fase móvel tem que considerar a
natureza química das substâncias a serem
separadas e a polaridade da fase móvel ;
• O poder de eluição está diretamente relacionado
com a polaridade. Portanto, deve-se tomar como
base a “série eluotrópica” dos solventes.
FASE MÓVEL
“SÉRIE ELUOTRÓPICA”
MECANISMO DE SEPARAÇÃO
DOS COMPONENTES
• O mecanismo de separação, por cromatografia,
das substâncias contidas numa amostra é
explicada pelo fenômeno de ADSORÇÃO;
• ADSORÇÃO, é o depósito ou a retenção seletiva de 
substâncias sobre a superfície de sólidos finamente 
divididos, por efeitos de forças eletrostáticas;
• Os adsorventes mais usados são a sílica (SiO2)
ligados a grupos silanol (-Si-OH) ou siloxano (Si-O-
Si) e a alumina (Al2O3).
ADSORVENTES
• Comercialmente, estes adsorventes são fornecidos
de vários tipos e suas aplicações são especificas
para cada técnica, são eles:
• Sílica “G” - apresenta em sua composição
substâncias aglutinantes (10 a 15% de gesso ou 1 a
3% de amido) com o objetivo de fixar o adsorvente
sobre a placa de vidro;
• Sílica “H”- não contém aglutinante e é usada em
cromatografia de coluna;
• Sílica “F”- contém substâncias fluorescentes;
• Sílica “P”- para uso em camadas preparativas.
APLICAÇ ÃO DAS AMOSTRAS NAS
PLACAS CROMATOGRÁFICAS
• Em geral aplicam-se soluções nas concentrações
de 0,1% a 1,0%, com auxilio de micropipetas ou
micro seringas;
• As amostras devem ser aplicadas a partir de 1,0 cm
a 1,5 cm acima da borda inferior da placa (ponto de
partida do cromatograma);
• O percurso da cromatografia geralmente é de 10
cm a 15 cm;
DESENVOLVIMENTO DO
CROMATOGRAMA
• A camada adsorvente não deve ser alterada;
• O halo de difusão da amostra não pode ser maior
que 2 mm;
• Soluções diluídas da amostra podem ser aplicadas
repetidamente;
• Mais de uma amostra podem ser aplicadas em uma
placa, mantendo-se uma distância de cerca 1 cm
entre os pontos.
DESENVOLVIMENTO DO
CROMATOGRAMA
• A placa, com a extremidade semeada para baixo, é
então mergulhada na fase móvel selecionada,
mantida em cuba fechada (câmara);
• O nível do solvente deverá ficar abaixo dos pontos
de aplicação (spot`s);
•Durante a corrida do solvente o sistema deve
permanecer fechado, e há que se evitar que a cuba
se movimente.
DESENVOLVIMENTO DO
CROMATOGRAMA
• Um pedaço de papel de filtro, colocado na parede
interna da câmara, acelera a saturação;
• Cromatoplaca deverá ser retirada da cuba somente
quando a frente do solvente atingir limite pré-
determinado na parte superior da placa (cerca de 1
cm).
• Após o desenvolvimento, as cromatoplacas devem
passar por processo de secagem, seja à temperatura
ambiente, seja por fazer passar corrente de ar ou
com uso de temperatura.
DESENVOLVIMENTO DO
CROMATOGRAMA
REVELAÇÃO DO CROMATOGRAMA
• Os reveladores podem ser agentes físicos:
• Radiação ultravioleta
• Ou reveladores químicos:
• Vapores de iodo;
• Solução de vanilina sulfúrica;
• Solução nitrato de prata;
• 2,4 – dinitrofenilidrazina;
• Verde de bromocresol;
• Ninhidrina.
REVELAÇÃO DO CROMATOGRAMA
REVELAÇÃO DO CROMATOGRAMA
REVELAÇÃO DO CROMATOGRAMA
IDENTIFICAÇÃO DOS ANALITOS
• Fator de retardamento, o Rf, é uma característica
do soluto, fato que permite a identificação dos
compostos.
• Em condições experimentais especificadas, em
condições constantes de temperatura, sistema de
solventes e adsorventes, qualquer soluto move-se a
uma razão constante em relação à frente de
solvente;
• Rf é a razão entre a distância percorrida na placa
pela substância e a distância percorrida pelo
solvente.
IDENTIFICAÇÃO DOS ANALITOS
• Para fins de identificação de uma substância a
fase móvel escolhida para a eluição deve carrear o
composto a um Rf entre 0,3 e 0,6 e um padrão deve
ser aplicado lado a lado na mesma placa, para
assegurar igualdade de condições experimentais.
I- semente de cacau
2- semente de café
T2- teobromina
T3- caféina 
T4- teofilina
T5-ácido clorogênico
IDENTIFICAÇÃO DOS ANALITOS
A B C
A: Padrão de cumarina
B: Extrato metanólico de M.oliveirae
C: Extrato metanólico de M.glomerata
Fase móvel: n-hexano: diclorometano (2:8)
Fase estacionária: cromatoplaca GF254 
(Merck 10.5554)
Revelação: UV 254nm
IDENTIFICAÇÃO DOS ANALITOS
1- opio (farmacopeia 
alemã DAB
2- opio
3- tintura de ópio 
(farmacopeia alemã)
T1 – morfina
T2 – codeina
T3 – papaverina
T4 – noscapina
CCD`s realizadas pela turma 2010
CCD`s realizadas pela turma 2010