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FACULDADE SUDOESTE PAULISTA CICLO DE VIDA E DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DOS PROTOZOÁRIOS E HELMINTOS 2015 PROFESSORA DOUTORA KARINA PONSONI ITAPETININGA MARÍLIA RODRIGUES SILVA – RA: 010718 BIOMEDICINA 4º TERMO NOTURNO MARÍLIA RODRIGUES SILVA – RA: 010718 CICLO DE VIDA E DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DOS PROTOZOÁRIOS E HELMINTOS ITAPETININGA 2015 Trabalho apresentado à disciplina de Parasitologia, do curso de Biomedicina, 4º termo, período noturno, da Faculdade Sudoeste Paulista. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Karina Ponsoni 3 SUMÁRIO INTRODUÇÃO ................................................................................................ 4 PROTOZOÁRIOS ........................................................................................... 5 Giardia lamblia ............................................................................................. 5 Entamoeba histolytica .................................................................................. 6 HELMINTOS ................................................................................................... 8 Trematoda - Schistosoma mansoni ............................................................. 8 Cestoda – Taenia ...................................................................................... 11 Ascaris lumbricoides .................................................................................. 12 Ancylostoma duodenale e Necator americanus ......................................... 14 Enterobius vermicularis ............................................................................. 15 Trichomonas vaginalis ............................................................................... 17 Strongyloides stercoralis ............................................................................ 18 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL ................................................................ 19 REFERÊNCIAS ............................................................................................ 22 4 INTRODUÇÃO Os parasitos intestinais, conhecidos como enteroparasitores, são assim denominados porque possuem como habitat o intestino grosso ou delgado do hospedeiro humano. Esse tipo de relação é sempre desarmônica, por gerar prejuízos ao hospedeiro, sendo ou não acompanhada de manifestações clínicas responsáveis pela identificação da presença de tal, o que na maioria das vezes só acontece com o desequilíbrio hospedeiro-parasito, onde fatores inerentes ao agressor acabam por se tornar maiores que os mecanismos de defesa do hospedeiro, caracterizando a doença parasitária. O número de casos chega a um terço da população de países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento, por conta da precariedade no saneamento básico - principal motivo para a transmissão do agente infeccioso - pela precariedade do sistema de saúde pública e os aspectos socioeconômicos, que também permitem a disseminação de diversas doenças (ROSA, 2011). No mundo cerca de 3,5 bilhões de pessoas são hospedeiros assintomáticos de enteroparasitores e deles, 450 milhões já desenvolvem a doença, que é mais frequente em crianças pela falta de higiene e mecanismos de defesa menos eficazes (BELLOTO et al, 2011), podendo gerar a morte em imunodebilitados e causar desnutrição, diarreia e afetar o desenvolvimento físico e mental do hospedeiro. Tem-se como principais parasitores intestinais os Protozoários e Helmintos, que geram as protozooses e as helmintíases, respectivamente, sendo chamado de monoxênico o ciclo de vida dos animais que possuem apenas um hospedeiro para completar seu desenvolvimento e de heteroxênico o ciclo de vida daqueles com mais de um hospedeiro (NEVES, 2006). É importante a distinção do ciclo biológico de cada espécie para possibilitar o pedido de diagnostico laboratorial adequado de acordo com a suspeita, sabendo-se que não existe um método capaz de detectar todas as doenças causadas por enteroparasitores já que cada animal tem peso e sobrevida diferente, mas os mais abrangentes e utilizados rotineiramente são os métodos de sedimentação espontânea e os métodos de centrifugação, já que os demais são mais específicos (FERREIRA, 1996; NEVES, 2005; REY, 2011). 5 PROTOZOÁRIOS Giardia lamblia São flagelados e pertencem a família Hexamitidae, ordem Diplonadida, classe Zoomastigophora, subfilo Mastigophora e filo Sarcomastigophora, sendo mais frequente em locais com climas temperados e zonas tropicais, por isso a alta incidência no Brasil. É muito conhecido por ser a causa mais frequente de diarreia em crianças menores de 5 anos e pessoas com baixa quantidade de anticorpos no sangue, o que as torna mais suscetíveis a infecções. O trofozoíto, fase ativa do parasito, pode medir 20 µm x 10 µm e tem cariossoma em posição central em seus dois núcleos, que ficam próximos aos corpos medianos e ao disco ventral, caracterizando bem sua estrutura ao visualiza-lo juntamente de seus quatro pares de flagelos. No estado infeccioso, chamado de cisto, mede 12 µm x 8 µm, tem fibrilas e pode ter de 2 a 4 núcleos, podendo conservar a vitalidade do parasito na água por dois meses ou mais. O ciclo biológico deste parasito é monoxênico direto, ou seja, só necessita de um hospedeiro para completa-lo, no caso o ser humano, que adquire o cisto do protozoário via oral. Ao chegar a luz estomacal, pelo contato com enzimas digestivas no meio ácido existente, inicia-se o desencistamento e a colonização se dá no duodeno e jejuno pelos trofozoítos. Essa região é a mais atingida pela parasitose, já que também é onde ocorre a multiplicação dos trofozoítas através da divisão binária longitudinal, originando novos trofozoítas que migrarão até o intestino grosso, onde o pH e a concentração de enzimas e sais desencadeia o mecanismo de encistamento, para que o cisto seja eliminado nas fezes e complete o ciclo (MALTEZ, 2002; NEVES, 2005). Resumidamente, tem-se o ciclo de vida da Giardia lamblia esquematizado a seguir. Figura 1. Esquema do ciclo de vida da Giardia lamblia 6 Ao se aderir às microvilosidades do intestino delgado, através do seu disco ventral, lesiona a mucosa e causa inflamação, que impede a absorção de nutrientes no local e gera um volume excessivo de gordura nas fezes, chamado de esteatorreia (MALTEZ, 2002). Também causa perda de peso, irritabilidade, náuseas e vomito, mas na maioria das vezes é assintomático, liberando cistos nas fezes por um longo período de tempo. Tal protozoose é também chamada de “doença dos viajantes” por ser comum a transmissão para turistas que visitam locais com saneamento inadequado, visto que o contágio se dá por agua e alimentos contaminados com fezes carregadoras de cistos ou pelo mecanismo mão - boca, em locais onde a higiene é precária. O diagnóstico laboratorial dependerá da forma em que as fezes se encontram, sendo utilizado os métodos Direto ou Hematoxilina férrica para fezes liquefeitas e o método de Faust ou até mesmo testes imunológicos para fezes sólidas. Entamoeba histolytica São as amebas, pertencentes a família Entamoebidae, ordem Aemoebida, classe Lobozia, superclasse Rhizopoda, subfilo Sarcodina e filo Sarcomastigophora, sendo a mais estudada por ser uma importante causa de morbimortalidade no humano (NEVES, 2005). Assim como a Giardia lamblia, sua alta incidência em regiões tropicais se une ao fato de existirem condições sanitárias precárias nesses locais, o que contribui para adisseminação (DOURADO, 2006; SILVA, 2005). Possui quatro fases, sendo elas: trofozoíto, pré - cisto, cisto e metacisto. O trofozoíto se diferencia de outras espécies de amebas por conter o citoplasma divido em endoplasma e ectoplasma, com o primeiro granular e o segundo claro e hialino, pode chegar até 60 de tamanho e possui o cariossoma pequeno e central no núcleo. A fase pré – cisto é intermediária entre trofozoíto e cisto, tendo forma mais oval e menor que o trofozoíto. O cisto da Entamoeba histolytica contém quatro núcleos, é esférico ou oval e pode chegar até 20 µm de tamanho com a presença de corpo cromatóide. A fase metacisto é a que emerge do cisto e dá origem ao trofozoíto, sendo multinucleada. O ciclo biológico é monoxênico, onde o hospedeiro humano adquire o parasita via oral através da ingestão de cistos, que passam pela barreira gástrica no estomago, onde ocorre o desencistamento e a saída do metacisto, dando origem a oito trofozoítos após sofrer diversas divisões binárias, e chegam a luz intestinal. Seu habitat é o intestino 7 grosso, onde o trofozoíta invade a submucosa intestinal e provoca ulcerações por se multiplicar de forma exacerbante através de divisão binária, se alimentando de hemácias por fagocitose, ou seja, é hematófago. Após passar por processos de desidratação e liberação de substâncias, o trofozoíto se desenvolve a pré – cisto, se tornando cisto assim que ocorre a secreção da membrana cística, e dependendo da existência de diarreia ou não, tem-se a eliminação do trofozoíta ou do cisto nas fezes, respectivamente (NEVES, 2005). A amebíase, doença causada pela Entamoeba histolytica, pode se desenvolver também de forma extra intestinal, se aderindo ao fígado, ao pleuro pulmonar, ao cérebro e até mesmo a pele (DOURADO, 2006). Resumidamente, tem-se o ciclo de vida da Entamoeba histolytica esquematizado a seguir. Figura 2. Esquema do ciclo de vida da Entamoeba histolytica. A amebíase se divide em sintomática e não sintomática, se sendo a segunda responsável por 80% dos casos e só pode ser identificada com o encontro de cistos no exame de fezes. O tipo sintomático tem subdivisões, mas generalizadamente as principais manifestações clínicas se dão por crises diarreicas, fortes dores na região abdominal, perfurações no intestino, graves desidratações e ocorrência de muco e sangue nas fezes (DOURADO, 2006). Para realizar o diagnóstico laboratorial é importante visualizar se as fezes estão liquefeitas ou sólidas, utilizando o método de centrifugo-flutuação ou sedimentação espontânea no primeiro caso e a técnica de hematoxilina férrica no segundo caso. As técnicas imunológicas são utilizadas especialmente para casos extra intestinais pois o exame parasitológico pode ser negativo. 8 HELMINTOS Com espécies de vida livre e também parasitária, são chamados de triblásticos por possuírem um terceiro folheto embrionário, o mesoderma, fato que os reúne no grupo Bilateria, de animais com simetria bilateral, importantíssima para o início da cefalização. Os Anelídeos são chamados de celomados porque são animais triblásticos que possuem celoma, uma cavidade que serve de espaço para as vísceras, já os animais que não possuem essa cavidade são chamados de acelomados, como os Platelmintos, e os que possuem uma cavidade, mas sem o revestimento característico, são chamados de pseudocelomados, como os Nematelmintos, sendo esse o principal fator que os diferencia. O cladograma abaixo mostra a ordem evolutiva desses animais. Os Platelmintos são conhecidos como vermes chatos por possuírem o corpo achatado dorsoventralmente e estão divididos em quatro classes, sendo duas delas importantes parasitas. Não possuem nenhuma outra cavidade além do tubo digestivo e o transporte de substâncias é feito por difusão em pequenas distancias, justificando o fato de serem sempre achatados ou muito pequenos (CORGOSINHO, 2010). Trematoda - Schistosoma mansoni A classe Trematoda é de grande importância médico-veterinária, pois nela encontra-se o, agente etiológico da esquistossomose, uma grande endemia tropical. Os vermes dessa classe possuem o corpo não segmentado, ventosa e, como outras classes dos Platelmintos, tem a epiderme modificada chamada de tegumento, uma estrutura caracterizada por várias camadas, fornecendo uma barreira mais eficiente contra as defesas do hospedeiro. 9 S. mansoni ocorre na África, América do Sul e Antilhas, condicionada geograficamente pelo habitat de algumas espécies de moluscos de água doce, que são os hospedeiros intermediários desse parasito e, no Brasil, existem mais de seis milhões de indivíduos infectados (REY, 2011). A espécie diferencia-se por possuir sexos separados e dimorfismo sexual, principalmente, sendo a fêmea maior (de 1,2 a 1,6 cm), de corpo cilíndrico e mais fino, com coloração acinzentada pela ocorrência de enzimas digestivas de sangue em seu tubo digestivo, e o macho com comprimento de 0,6 a 1,4 cm e de cor branca, com duas ventosas, sendo uma oral e a outra chamada de acetábulo, ambas menores nas fêmeas (NEVES, 2005). A deposição de ovos chega a até 300 por dia, com a expectativa de vida do ovo maduro, com o miracídio (embrião), de aproximadamente 20 dias e a eclosão sempre acontece fora do hospedeiro, onde os ovos se mantém vivos por até cinco dias em fezes sólidas e um dia em fezes liquefeitas. O miracídio invade o molusco e começa uma remodelação estrutural, até passar à fase larvária chamada de esporocisto primário, que se diferenciará em esporocisto secundário e depois em cercarias, que serão eliminadas pelo moluscos após a quarta semana de infestação, pela ação da temperatura. Ao penetrar no hospedeiro definitivo, o ser humano, a cercaria se transforma em esquistossômulo, podendo adentrar em vasos sanguíneos e chegar a circulação se não for destruído por mecanismos de defesa do homem dentro de 3 dias, facilitando a ida do parasito ao coração e aos pulmões, onde aumentará de tamanho e terá uma fase muito ativa, proporcionando a migração até o sistema hepático, onde acontecerá o amadurecimento sexual dos machos e o acasalamento, permitindo que a fêmea desloque-se até seu habitat definitivo, o intestino grosso, onde depositará seus ovos nos vasos mais estreitos da mucosa e submucosa. Da submucosa, os ovos chegarão a luz intestinal e serão eliminados juntamente com as fezes e, ao atingirem a água, liberarão o miracídio, por conta do aumento da temperatura, luz intensa e oxigenação. Existem estudos que comprovam a liberação de substâncias pelo molusco que atraem os miracídios, se deslocando pela parte mais superficial da água, e ao penetrarem no molusco o ciclo biológico recomeça (MALTEZ, 2002; NEVES, 2005; REY, 2011). O esquema abaixo demonstra o ciclo resumidamente: 10 Figura 3. Esquema do ciclo de vida do S. mansoni. O desenvolvimento da doença se dá em uma fase inicial ou aguda e uma fase crônica, sendo a primeira caracterizada por manifestações cutâneas, febre irregular, cefaleia, prostração, náuseas e cólicas precedendo a evacuação, podendo acompanhar muco e manchas de sangue. Depois da fase aguda, os sintomas regridem e a maioria dos pacientes fica assintomático por longos períodos e, muitas vezes, só voltam por uma reexposição com aumento da carga parasitária, causando sintomas vagos como perda de apetite, tenesmo, crises de diarreia alternadas com crises de constipação, dor abdominal, depressão ou irritabilidade nervosa (REY, 2011). O diagnóstico da esquistossomose mansonica se dá pela pesquisa de locais de zonas endêmicas em que o paciente possa ter estado seguido da palpação do de um fígadoou baço aumentado, levando ao diagnostico laboratorial que detectara a presença de ovos nas fezes ou tecidos ou a realização de provas imunológicas. O exame parasitológico ainda é o mais utilizado rotineiramente, pois os ovos de S. mansoni são grandes e de fácil visualização na microscopia comum, sendo os métodos de Lutz, de Stoll para a contagem de ovos e de Kato os mais utilizados para essa doença. Outros métodos parasitológicos utilizados são a eclosão de miracídios e a biopsia retal. Os métodos imunológicos não são muito utilizados porque podem identificar a presença de anticorpos específicos durante muito tempo e até mesmo depois da cura medicamentosa ou espontânea, não servindo para a detecção da eficácia de determinado medicamento ou tratamento proposto, tão pouco para a detecção da doença. 11 Cestoda – Taenia Pertence a ordem Cyclophyllidea, classe Cestoidea, família Teniidae e gênero Taenia, caracterizada por vermes grandes achatados em forma de fita, com duas espécies parasitárias do homem: T. solium de 1,5 a 4 metros e T. saginata de 4 a 12 metros até 25 metros, ambas tem coloração branca ou amarelada e aspecto leitoso com superfície lisa. Possuem o órgão de fixação chamado de escólex, uma dilatação na extremidade do animal com quatro ventosas e ganchos rígidos, seguido por um corpo segmentado em proglotes, independentes sexualmente entre si, levando em conta o hermafroditismo, que possuem o sentido de crescimento contrário ao escólex (REY, 2011). As duas espécies possuem ovos esféricos com 30 a 40 mm de diâmetro e, muitas vezes, ocorre a presença deles nas fezes dos pacientes pela separação das proglotes, que deixa uma cicatriz permitindo a saída. Os ovos são ingeridos pelo hospedeiro intermediário (bovino ou suíno) e eclodem em seu interior, ganhando a corrente sanguínea, que os leva até a musculatura esquelética ou cardíaca, local de desenvolvimento do animal, podendo ser visível os cisticercos após duas semanas e se degenerando algumas semanas depois, calcificando, em sua maioria, em nove meses (NEVES, 2005). A infecção humana se dá com o consumo da carne do animal crua ou mal cozida, liberando cisticercos no tubo digestivo, onde se fixa através do escólex e inicia seu desenvolvimento. O ser humano, hospedeiro definitivo, começa a liberar proglotes nas fezes após 60 dias de infecção, quando o animal já tem metros de comprimento, reiniciando o ciclo com a ingestão das proglotes pelo hospedeiro intermediário. Existem três tipos de infecção por tênias, podendo ser heteroinfecção (ingestão acidental dos ovos), autoinfecção externa (pessoa com teníase tem maus hábitos sanitários e acaba ingerindo os ovos do próprio parasita) e a autoinfecção interna (movimentos antiperistálticos, provocados por diversos motivos, promovem a ação retrógrada das proglotes grávidas ao estomago, onde eclodem por ação do suco gástrico) (COELHO, 1999; PFUETZENREITER & ÁVILA-PIRES, 2000). O ciclo biológico está exemplificado no esquema a seguir. 12 Figura 4. Esquema do ciclo de vida da tenia. Os principais sintomas provocados pelas duas espécies são dor abdominal, náusea, fraqueza, perda de peso, aumento da fome, cefaleia, constipação intestinal e prurido anal, mas a espécie T. solium pode ter o homem como hospedeiro intermediário por engano, gerando a cisticercose humana, doença onde os ovos de tênias calcificam em locais como olhos, sistema nervoso, musculatura, pele, entre outros, causando fenômenos compressivos, obstrutivos e inflamatórios, sendo considerado mais grave que a própria teníase (PFUETZENREITER & ÁVILA-PIRES, 2000; REY, 2011). Para diagnosticar a infecção por tênia são utilizadas as técnicas de pesquisa de proglotes, pesquisa de ovos nas fezes e pesquisa de ovos com fita adesiva, ambos parasitológicos, já que o imunodiagnóstico não é satisfatório. Os Nematelmintos, como dito anteriormente, são chamados de pseudocelomados porque possuem uma cavidade revestida parcialmente de mesoderme, o terceiro folheto embrionário, ocorrendo a formação da boca primeiramente o que caracteriza como animais protostômicos. São invertebrados cilíndricos alongados e com dimorfismo sexual, sendo o macho menor que a fêmea e com uma curvatura acentuada na extremidade posterior corporal, com reprodução sexuada para garantir a variedade da espécie. Ascaris lumbricoides Pertencente ao filo Aschelminthes, classe Nematoda, ordem Ascaridida, família Ascarididae, e espécie Ascaris lumbricoides. É o maior nematódeo que parasita o ser humano, podendo a femea chegar até 40 cm e o macho 30 cm, também é o parasita mais frequente na população, principalmente a de baixa renda e que não possui 13 saneamento básico adequado. A fêmea é mais robusta e o macho possui a extremidade posterior voltada para a face ventral, onde ficam dois espículos utilizados para a cópula e ambos tem três lábios fortes localizados na extremidade anterior (NEVES, 2005). Os ovos de A. lumbricoides são ovais e possuem uma membrana mamilonada formada de mucopolissacarideos, quando férteis, e são mais alongados quando inférteis, podendo contaminar o ser humano quando possuem a larva em seu interior. O ciclo biológico monoxênico é caracterizado por um único hospedeiro, que ao ingerir os ovos com a larva promove a diferenciação da mesma até chegar ao estágio L3 que eclode no intestino delgado e atravessa seu epitélio, podendo chegar ao coração, fígado ou pulmões através do sistema porta. Se estiver nos pulmões, tem a chance de subir pela faringe e ser expelido por expectoração e/ou deglutido, fixando-se no intestino delgado para atingir a maturidade sexual, ou seja, tornam-se vermes adultos e liberam ovos que saem nas fezes do hospedeiro, que, ao chegar no ambiente, transformam-se em férteis e reiniciam o ciclo. A infecção é leve, dependendo da carga parasitária e dos mecanismos de defesa do hospedeiro, não observando-se alterações sintomáticas pela presença de larvas e vermes em pequenas quantidades, mas em infecções maciças as larvas podem causar lesões hepáticas e pulmonares e, os vermes, causam subnutrição pelo consumo de proteínas, carboidratos e vitaminas e irritação da mucosa ou obstrução intestinal (NEVES, 2005; REY, 2011). As localizações ectópicas geram lesões estomacais, pancreatite aguda e abcesso hepático. O ciclo biológico está esquematizado a seguir. Figura 5. Esquema do ciclo de vida do Ascaris lumbricoides. 14 O diagnóstico laboratorial imunológico não é satisfatório no geral, o que torna o parasitológico mais recomendado e utilizado. As técnicas utilizadas diariamente são Sedimentação espontânea e a técnica de Kato-Katz, recomendada pela OMS para estimar o grau de parasitismo. Ancylostoma duodenale e Necator americanus Ambas espécies são agentes infecciosos da Ancilostomose, doença também conhecida por amarelão ou mal-da-terra e que tem ocorrência em regiões tropicais e temperadas, atingindo a faixa etária de 6 a 15 anos e idosos. Os vermes apresentam coloração branca, são cilíndricos, os machos são menores e possuem a extremidade posterior expandida para formar a bolsa copuladora, já as fêmeas são bem maiores e sua extremidade posterior é afilada. Ancylostoma duodenale apresenta dois pares de dentes ventrais e Necator americanos duas lâminas cortantes, ambos utilizados para fixação do animal em suas cápsulas bucais profundas (REY, 2011). Ambas espécies possuem ovos com formato oval e 40 x 60 µm de tamanho, habitam as porções mais altas do intestino delgado em infecções brandas e podem atingir o íleo e o ceco em infecções pesadas, tem o ciclo biológico monoxênico e patogeniaiguais, portando o que difere os dois agentes infecciosos é que N. americanus pode ser transmitido por penetração cutânea/ mucosa e A. duodenale, além da penetração cutânea/mucosa, também pode ser transmitido via digestiva com a ingestão de alimentos contaminados. A fêmea libera ovos nas fezes, após a cópula, que contaminam o ambiente ao se tornarem embrionados, o que não significa que já são infectantes, pois a larva passa por um processo de três etapas para que possa penetrar ativamente no hospedeiro através da pele, por exemplo. Assim que adentra o hospedeiro, chega a circulação sanguínea e/ou linfática que a leva até órgãos vitais como coração e pulmões, onde subirá pela árvore brônquica atingindo a faringe, podendo ser expectorado ou deglutido, se fixando ao intestino para chegar a fase adulta (COELHO, 2001; NEVES, 2005; REY, 2011). A via oral de transmissão segue a mesma linha descrita anteriormente após ser deglutido, e o ciclo biológico está esquematizado abaixo. 15 Figura 6. Esquema do ciclo de vida do Ancylostoma duodenale/ Necator americanus. As principais manifestações da doença são lesões no intestino, anemia e hipoproteinemia, por conta da fixação do animal e de seus hábitos alimentares, podendo também apresentar problemas hepáticos, achatamento das microvilosidades, e, consequentemente, redução da absorção intestinal (REY, 2011). O diagnóstico laboratorial se dá por exames parasitológicos através das técnicas de Sedimentação espontânea de Holfman, Sedimentação por centrifugação, Flutuação de Willis e Centrífugo-flutuação de Faust, não utilizando métodos imunológicos com frequência. Enterobius vermicularis É um pequeno nematoide pertencente ao reino Animalia, filo Aschelminthes, a classe Nematoda, ordem Oxiurida e família Oxyuridae, com hábito parasitário exclusivamente humano e com maior incidência em países desenvolvidos e locais de climas temperados, ao contrário das outras helmintíases (NEVES, 2005; REY, 2011). A fêmea também é maior que o macho, chegando a 1 cm de comprimento, com as extremidades finas e o macho pode ter até 5 mm com a extremidade posterior enrolada ventralmente, sendo que ambos possuem uma coloração branca com estrias transversais bem características, que ajudam a identificar o animal juntamente com as duas expansões vesiculosas presentes na extremidade anterior. Os ovos de E. vermicularis também são bem característicos por se apresentarem achatados de um lado e medindo cerca de 60 µm de comprimento por 30 µm de largura, com a larva em seu interior que se torna infectante para o homem ao chegar em seu 5° estágio de desenvolvimento, em um ambiente aeróbio (COELHO, 1999; NEVES, 2005). Seu ciclo de vida se inicia com a ingestão dos ovos em seu estágio infectante, que eclodirá no intestino delgado liberando as larvas capazes de se alimentar e crescer, tornando-se adultas enquanto vão até seu habitat, o ceco. Após a fecundação, a fêmea 16 migra até o reto, geralmente no período noturno pela diminuição da temperatura corporal nessa região, e lá descarregam seus ovos, que se aderem facilmente à região perineal, causando prurido anal que ajuda a disseminação dos ovos e transmissão da doença para novos hospedeiros. Após a ovoposição, a fêmea morre em pouco tempo e acredita- se que o macho sobrevive somente por uma cópula com a fêmea, tendo o tempo de vida curto. O ciclo se inicia novamente quando os ovos chegam ao ambiente através das fezes ou até mesmo por descolamento da pele de um humano infectado, sendo ingeridos por outro hospedeiro (REY, 2011). O ciclo de vida está esquematizado a seguir. Figura 7. Esquema do ciclo de vida do Enterobius vermicularis. O principal sintoma da enterobíase, doença causada pela presença do Enterobius vermicularis, é o prurido na região perineal, que é intenso, gerando escoriações na pele e infecções por outros microrganismos na região vaginal, no caso das mulheres. Por se proceder no período noturno, as perturbações do sono causam sintomas secundários como irritabilidade, mas as fezes acompanhadas de muco e sangue ocorrem por conta da fixação do animal no intestino e seu hábito alimentar euritrófico (COELHO, 1999). O método mais usado para o diagnóstico da enterobíase é o mesmo usado para a teníase, pois os exames de fezes, mesmo acompanhados de métodos de enriquecimento, só revelam 10% dos casos positivos. 17 Trichomonas vaginalis Causador da tricomoníase, uma das principais DSTs, é um parasita flagelado anaeróbio facultativo pertencente do Filo Sarcomastigophora, subfilo Mastigophora, ordem Trichomonadida, família Trichomonadidae e gênero Trichomonas. Atualmente é responsável por um terço das infecções vaginais em mulheres e, por ser sexualmente transmissível, o tratamento é realizado por ambos os parceiros sexuais na mesma dosagem (NEVES, 2005). Seu habitat é a vagina ou uretra masculina, onde promove corrimento esbranquiçado ou esverdeado, aumento na frequência da micção e prurido, sendo o homem o vetor de transmissão, portando pode ser assintomático, mas também pode causar a infertilidade por impedir a mobilidade do espermatozoide. Este parasita não possui a forma cística, somente o trofozoíto, que se fixa às células epiteliais através dos flagelos, se alimentando dos açúcares em anaerobiose e produzindo ácidos que irritam a mucosa vaginal. O ciclo de vida possui apenas o hospedeiro humano, sendo que ele também serve de vetor para outra infecção, visto que o trofozoíta que se localiza na uretra masculina é transmitido para a vagina feminina, onde se multiplica por fissão binária longitudinal e pode novamente ser transmitido para o homem, caso não ocorra o tratamento (FEITTOSA & CONSOLARO, 2005; NEVES, 2005; REY, 2011). Figura 8. Esquema do ciclo de vida do Trichomonas vaginalis. O diagnóstico da vaginite por T. vaginalis é feito identificando o parasito na secreção vaginal e a técnica empregada consiste na coleta de um pouco de secreção vaginal, recolhida preferivelmente com pipeta grossa e após colocação do especulo. A secreção é misturada com soro fisiológico em uma lâmina, que é levada ao microscópio comum. Nos homens, uma preparação a fresco também é feita no sedimento urinário, mas a cultura é o método mais sensível de diagnóstico e existem, atualmente, kits comerciais específicos para esse parasito. 18 Strongyloides stercoralis Pertencente ao reino Animalia, filo Aschelminthes, classe Nematoda, ordem Rhabditorida e família Strongyloididae, é o agente etiológico da estrongiloidíase, doença que tem maior ocorrência em regiões tropicais e subtropicais, dependendo basicamente da situação socioeconômica do local. Existem fêmeas e machos, mas a morfologia de ambos é diferente de acordo com o modo de vida em que se encontram, podendo descrever a fêmea parasita como um animal com corpo cilíndrico com extremidade anterior arredondada e posterior afilada; o macho de vida livre com aspecto fusiforme com extremidade anterior arredondada e posterior curvada dorsoventralmente e a fêmea de vida livre com o corpo estriações e uma cutícula fina e transparente (NEVES, 2005; PIRES, 1993). É um parasita que possui dois tipos de larvas, o rabditoide e o filarioide, sendo o segundo maior e infectante e a principal diferença entre eles é o tipo de esôfago, se tornando responsável pela existência de dois tipos de ciclo biológico. O primeiro tipo de ciclo de vida é o direto, onde larvas rabditoides que são eliminadas nas fezes se tornam filarióides, ou seja, infectantes, e são capazes de adentrar ao hospedeiro humano diretamente. O segundo tipo de ciclo é o indireto,onde a larva rabditoide eliminada nas fezes se transformam em machos e fêmeas no solo, chamados de animais de vida livre, local da cópula e deposição dos ovos que eclodem, liberando a larva infectante que encontra o humano através do contato com a pele (PIRES, 1993; REY, 2011). Essa transmissão cutânea ocorre mais pelo hábito de andar descalço, pelo contato com o solo contaminado por fezes com o parasito ou via oral pela ingestão de água e alimentos contaminados. A seguir está esquematizado os ciclos de vida do Strongyloides stercoralis. Figura 9. Esquema do ciclo de vida do Strongyloides stercoralis. (A) Ciclo biológico indireto e (B) Ciclo biológico direto. 19 O habitat desse parasita é o intestino delgado, por isso as principais manifestações clínicas da fase crônica são ligadas a fixação dos animais na mucosa intestinal, citando como exemplo dor abdominal, diarreias e má absorção de nutrientes. A fase aguda se dá pela ação de entrada da larva no ser humano, sendo primeiramente lesões cutâneas e, após, problemas respiratórios (COELHO, 2001; NEVES, 2005). Para o diagnostico laboratorial são utilizados métodos de hidro e termotropismo das larvas como o método de Rugai e também métodos imunológicos, mas que precisam da confirmação pelo encontro das larvas para determinar positividade. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Lutz/ Hoffman/ Pons e Janer: É uma técnica de sedimentação espontânea da matéria fecal diluída em agua, para concentrar os ovos dos helmintos. É necessário desfazes as fezes em água e coá-las com gaze antes de completar seu volume com agua, fazendo com que os ovos se depositem no fundo, possibilitando a coleta desse sedimento com pipeta de Pasteur para que seja observado em microscópio comum. Pode-se detectar se a infecção é ativa por encontrar ovos ainda vivos e a amostra usada é bem maior que em outras técnicas, o que torna o método recomendado para a rotina. Stoll para a contagem de ovos: Consiste na diluição da amostra fecal, em um frasco de Stoll, deixando agir por uma hora ou mais e agitar novamente em seguida, tornando o material fecal diluído em 1 para 15. É pipetado 0,15 mL da amostra e colocado em lamina para que a contagem possa ser feita ao microscópio convencional, sempre respeitando a técnica de contagem e multiplicando o valor de ovos por 100 para que se tenha a média por mililitro ou por grama de fezes. De Kato-Katz: É o método mais utilizado, sendo quanti-qualitativo por identificar a presença ou não e a quantidade ovos presentes. É utilizado principalmente para ovos de S. mansoni e outras geo-helmintoses, não possibilitando a observação de cistos de protozoários ou outros parasitas, também não permite saber se o ovos estão vivos por apagar a estrutura do mesmo. A técnica se dá pela clarificação de uma pequena amostra fecal por uma mistura de glicerina e agua que impregna lamínulas recortadas em celofane molhável após contato por uma ou duas horas, facilitando a visualização dos ovos. 20 Eclosão de miracídios: Usado somente para identificação de S. mansoni. A amostra fecal é lavada várias vezes com solução salina isotônica e colocada em tubo com agua filtrada. Depois de minutos ou horas, os miracídios que eclodiram dos ovos poderão ser vistos a olho nu ou por uma lente simples, graças a sua movimentação na agua, dispensando o uso de microscópio. Só é positivo quando estiverem vivos e ovipondo, bastando um único miracídio para determinar positividade, estando sempre associado a outras técnicas. Biopsia retal: Somente em situações especiais. Retira-se com pinça de biópsia fragmentos da mucosa intestinal em diferentes pontos das válvulas de Houston. Depois de lavados, fragmentos são comprimidos entre laminas de microscopia e examinados ao microscópio. Da pra ver ovos imaturos ou maduros, vivos ou mortos, e eventualmente a reação granulomatosa que os envolve. Mas não é recomendado por ser invasivo demais e doloroso. Reação periovular: Utiliza-se o soro do paciente para avaliar a formação de precipitado hialino, globoso ou alongado ao redor da casca dos ovos, se existirem. A prova é especifica para cada espécie de schistosoma e para a fase ovular, não identificando cercarias ou vermes adultos e sua sensibilidade aumenta quando associada a técnica de imunofluorescência. Reação cercariana: Se ocorrer a formação de uma membrana transparente em torno da larva duas horas depois de incubar o soro do paciente, o resultado é positivo. Essa prova não mata o parasito e nem atrapalha sua movimentação, mas é necessário a existência de parasitos vivos para sua realização e torna-se negativa assim que ocorre a cura medicamentosa ou espontânea. Imunofluorescência: Utiliza-se qualquer fase do parasito como antígeno e se dá por cortes de tecidos ou usando soro do paciente, colhido em papel filtro. Se forma um complexo antígeno-anticorpo que é marcado com isotiocianato de fluoresceína e a leitura é feita com um microscópio com luz fluorescente, mas o método é pouco utilizado por ser muito complexo e por requerer equipamento especializado para tal. ELISA: O soro do paciente é colocado em placas de poliestireno e ocorre a formação de complexos imunes, revelados por uma antiglobulina ligada a uma enzima que gera uma reação colorida ao juntar-se ao substrato adequado. Assim como outras técnicas imunológicas, é pouco utilizada por necessitar de equipamento e material muito específico e de alto custo. 21 Reação intradérmica: Ao se injetar intradermicamente extratos do verme, ocorre uma reação do tipo histamínica em até 20 minutos, sendo considerada positiva com a formação de pápula com bordas irregulares e que ultrapasse 1 cm de diâmetro. O teste persiste positivo em pacientes já curados e pode sensibilizar um paciente que era negativo anteriormente. Pesquisa de proglotes: A técnica mais utilizada é a tamisação. O bolo fecal é desmanchado na água e depois passado em uma peneira com malha fina para retê-las. Pesquisa de ovos nas fezes: Pode se utilizar de qualquer técnica corrente, mas o resultado negativo não exclui a possibilidade de infecção, sendo necessário a utilização de técnicas combinadas. Pesquisa de ovos com fita adesiva/ Método de Graham: É considerada a melhor técnica para a detecção de teníase e enterobíase. Utiliza-se celofane colante transparente na região perineal e depois deposita a fita em lâmina de microscopia para observá-la no microscópio. Método de Rugai: Utilizado para a detecção de larvas por hidro e termotropismo. A técnica se dá pela colocação de uma amostra de fezes, envolta por gaze, em uma vidraria com água a 45°, o que provocará a migração das larvas para o fundo do recipiente, podendo ser retiradas com pipeta e observada usando uma lupa. Imunodiagnóstico: Apenas o teste de hemaglutinação indireta e imunofluorescência indireta pode ser útil para teníase. A hemaglutinação indireta ou passiva se dá pela detecção de anticorpos específicos que, quando presentes nas hemácias, provocarão a aglutinação da amostra. O teste de imunofluorescência indireta ou teste de dupla camada se dá pela deposição de anticorpos específicos não fluorescentes em lamina com antígenos previamente fixados e, em seguida, a colocação de anticorpos fluorescentes, permitindo um maior grau de fluorescência no teste. Método direto: É utilizado em fezes liquefeitas para a observação da movimentação dos trofozoítos de protozoários. É colocada sobre a amostra uma solução de lugol, em seguida é preparado uma lâmina e levado ao microscópio comum para a observação em aumento de 100 e 400 x. Hematoxilina férrica: Técnica utilizada para observar as estruturasdo trofozoítos. As fezes são filtradas usando gaze dobrada em quatro após terem sido conservadas em Schaudinn ou SAF. Cerca de 2 ml são transferidos para um tubo e centrifugados por um minuto a 1.500 rpm, desprezando o sobrenadante que se forma e 22 acrescentando solução salina a 0,85%, homogeneizando e centrifugando novamente até obter um sobrenadante límpido. O sobrenadante é desprezado e, ao sedimento, acrescentado duas gotas de soro humano inativado, misturando bem e fazendo um esfregaço fino em lamínula em seguida. A lamínula ainda úmida é colocada em placa de Petri, voltada para baixo, com fixador por 10 minutos e em seguida passada nas outras placas contendo diferentes reagentes: a) álcool 70% por 2 minutos; b) álcool 70% iodado por 5 minutos; c) álcool 70% por 2 minutos; d) lavar em água destilada por 1 minuto; e) alúmen de ferro 2,5% por 10 minutos; f) lavar em água destilada por 1 minuto; g) hematoxilina 0,5% por 5 minutos; h) lavar em água destilada por 5 minutos; i) alúmen de ferro 2,5%; j) lavar em água destilada por 1 minuto; k) álcool 70% por 2 minutos; l) álcool 80% por 2 minutos; m) álcool 95% por 2 minutos; n) álcool absoluto por 2 minutos; o) álcool-salicilato por 2 minutos; p) salicilato de metila por 2 minutos. Finalmente a lâmina é montada com bálsamo-do-canadá ou em resina sintética com o esfregaço voltado para baixo, deixar secar e examinar com objetiva de imersão. Método de Faust/ Centrífugo-flutuação: Muito utilizado para a pesquisa de cistos de protozoários e ovos de helmintos. Se dá pela dissolução de 5 gramas de fezes em 10 mL de água e filtração em gaze dobrada em quatro, levando em seguida para a centrifuga por 2 minutos a 1500 rpm. O sobrenadante é desprezado e o processo repetido até que o sobrenadante fique claro, permitindo a adição de 10 mL de sulfato de Zinco (ZnSO2) a 33%, levando novamente a centrifuga por 2 minutos a 1500 rpm. A película superficial é retirada com alça de platina e colocada em lamina com solução de lugol para a observação em microscópio comum. Método de Willis/ Flutuação espontânea: Utilizada para amostra de fezes sólidas. São dissolvidos 5 gramas de fezes em solução saturada de NaCl e filtrado em gaze dobrada em quatro no frasco de Borrel, completando o volume com solução saturada de NaCl. Após a formação do menisco na borda do frasco, é colocado sobre as bordas a lâmina por 5 minutos, observada ao microscópio após escorrer o excesso presente nela. É usado rotineiramente para a pesquisa de ovos leves dos helmintos. REFERÊNCIAS BELLOTO, M. V. T. et al. Enteroparasitoses numa população de escolares da rede pública de ensino do Município de Mirassol, São Paulo, Brasil. Rev Pan-Amaz Saude, Ananindeua, v. 2, n. 1, mar. 2011 . Disponível em <http://scielo.iec.pa.gov.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2176- 62232011000100004&lng=pt&nrm=iso>. Acesso em 26 de Setembro de 2015. http://dx.doi.org/10.5123/S2176-62232011000100004. 23 ROSA, A. B. et al. Prevalência de enteroparasitas em crianças de creches da periferia do município de São Mateus – ES. Revista da Faculdade de Tecnologia e Ciências – Rede de Ensino FTC. Ano 9, n. 26, jun. 2011. MALTEZ, D. S. Manual das doenças transmitidas por alimentos Giardia lamblia/giardíase. 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