Determinação de ácido delta-aminolevulínico em urina

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS 
 
 
Relatório de Ecotoxicologia 
 
Experimento III 
Determinação de ácido delta-aminolevulínico em urina 
 
 
 
 
Alunos: Matrícula: 
Ana Viana 2012.1.05.004 
Jussara Ferreira Mesquita 2015.1.13.041 
Levy Bueno Alves 2015.1.13.031 
Rosângela Gonçalves 2015.1.13.034 
 
Profª. Eduardo Costa Figueiredo 
 
 
 
 
Alfenas, 09 de Outubro de 2017 
 
Introdução 
 
O interesse sobre acumulação e toxicidade de metais tem crescido nos últimos anos 
como consequência das exposições ocupacionais e ambientais, ou dos distúrbios causados por 
estes elementos. Segundo Chiba Shinohara, o chumbo (Pb) é um dos contaminantes mais 
comuns do ambiente, considerado como um elemento que possui efeitos tóxicos sobre os 
homens e animais, e sem nenhuma função fisiológica no organismo. Devido a sua ampla 
utilização em processos industriais e sua toxicidade aguda e crônica, casos de intoxicação 
ocupacional causados pelo chumbo são bastante comuns. 
A toxicidade do chumbo se manifesta principalmente em quatro sistemas: 
gastrointestinal, renal, nervoso e hematopoiético, sendo este último de grande importância no 
monitoramento biológico à exposição a este metal. O principal efeito do chumbo neste sistema é 
a redução dos níveis do grupo prostético heme, causado pela inibição de algumas enzimas 
utilizadas na síntese da hemoglobina, devido a ligação do metal à enzima ácido d-
aminolevulínico desidratase (ALA-D), causando o acúmulo do ácido delta aminolevulínico (ALA) 
no sangue e na urina (Alessio & Foá, 1983; ATSDR, 1990; Landrigan, 1989; Paolielo et al., 1993). 
 No ambiente de trabalho, a principal via de absorção é o aparelho respiratório. A 
deposição, retenção e absorção de partículas de chumbo no trato respiratório depende de fatores 
tais como: diâmetro de partículas, hidrossolubilidade, densidade, concentração do chumbo na 
atmosfera, exposição e também pelo tipo de trabalho que o indivíduo exerce, pois é diretamente 
proporcional ao risco de intoxicação já que trabalhos mais árduos necessitam de maior volume 
de ar inalado, aumentando drasticamente a probabilidade do indivíduo estar sujeito a substâncias 
tóxicas. 
 A toxicidade do chumbo gera desde efeitos claros, ou clínicos, até efeitos sutis, ou 
bioquímicos. Estes últimos envolvem vários sistemas de órgãos e atividades bioquímicas. Nas 
crianças, os efeitos críticos atingem o sistema nervoso, enquanto que nos adultos com exposição 
ocupacional excessiva, ou mesmo acidental, os cuidados são com a neuropatia periférica e a 
nefropatia crônica. A intoxicação aguda pelo chumbo é bastante rara, mas muito perigosa, 
podendo causar a morte de uma pessoa em poucos dias. Estas geralmente ocorrem de forma 
acidental, onde pode-se verificar o aparecimento de náuseas, dores abdominais, vômitos, e as 
fezes podem apresentar coloração negra em virtude da reação do chumbo com os compostos 
sulfurados existentes nos gases intestinais. A intoxicação crônica é mais comum e bastante 
danosa ao organismo. Segundo Jacob (2002), a cronicidade da exposição ao chumbo pode gerar 
distúrbios gastrointestinais, neuromusculares e sobre o Sistema Nervoso Central (SNC), além 
de alterar a pressão arterial e afetar negativamente o fígado, o sistema renal e a biossíntese do 
heme. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Objetivo 
 
 Determinar a concentração do ácido delta-aminolevulínico (ALA) na urina, através de 
espectrofotometria, para avaliar exposições biológicas ao metal. 
 
Métodos 
 
Para a determinação de ALA na urina, preparou-se soluções estoque de ácido delta-
aminolevulínico em diferentes concentrações para posteriormente comparar com suas 
respectivas absorbâncias das amostras. Foi proposto o preparo de um tubo sem solução estoque 
e mais outros 5 ensaios contendo 2, 5, 10, 20 2 30 µg/mL. 
Nossa equipe ficou responsável pelo preparo da solução estoque de ácido delta-
aminolevulínico de 2 µg/mL, onde dissolveu-se 40 µL de cloridato de ácido delta-aminolevulínico 
em 0,96 ml de água destilada, completando o volume final de 100 ml. 
Para o preparo de tampão acetato pH 4,6 dissolveu-se 13,6 g de acetato de sódio 
trihidratado em 70 ml de água destilada e adicionou 4,0 ml de ácido acético glacial, completando 
o volume de 100 ml. E, para o preparo do reativo de EHRLICH, dissolveu-se 1,0 g de p-
dimetilaminobenzadeído em cerca de 30 ml de ácido acético glacial, juntou-se 5 ml de HClO4 
60% e 5 ml de água destilada, completando o volume até 50 ml com ácido acético. 
Para analisar a concentração ao chumbo, através da concentração de ALA, preparou-se 
dois tubos de ensaio, sendo o primeiro tubo o controle e o segundo tubo a amostra, cada um 
contendo 1 ml de urina (amostra 1) e 1 ml de tampão acetato. Adicionou-se 0,2 ml de 
acetoacetato de etila somente a um dos tubos e agitou-se por 5 segundos. Os dois tubos foram 
submetidos em banho de água fervente durante 10 minutos. Após o esfriamento dos tubos, 
adicionou-se aos dois tubos3 ml de acetato de etila e homogeneizou-se manualmente. 
Ambos tratamentos foram centrifugados a 2000 rpm por 3 minutos, fazendo com que os 
analitos contidos na urina migrassem para a fase orgânica sobrenadante. Após isso, transferiu-
se 2 ml do sobrenadante de cada tubo, para outros dois tubos de ensaio. Adicionou-se 2 ml de 
reativo de EHRLICH modificado a cada tubo e homogeneizou, e posteriormente, foram 
submetidos a repouso por 10 minutos. Posteriormente foi possível determinar a absorbância do 
produto colorido formado em 553 nm usando como referência o tubo da fase orgânica sem 
acetoacetato de etila. Possibilitando o cálculo da concentração de ALA com o auxílio da curva 
de calibração construída a partir da diluição da solução estoque e tratadas da mesma maneira 
que a amostra de urina (2 a 30 mg/L). 
 
Resultados e discussões 
 
 A partir da diluição da solução estoque e o tratamento da mesma maneira que a 
amostra da urina, foi possível construir uma curva de calibração 
ALA 
(mg/L) 
Solução estoque 
(mL) 
Água 
(mL) 
Absorbância (A) 
Ā 
1º 2º 
2 0,04 0,96 0,023 0,073 0,048 
5 0,1 0,9 0,376 0,389 0,383 
10 0,2 0,8 0,76 0,725 0,743 
20 0,4 0,6 1,343 1,408 1,376 
30 0,6 0,4 1,914 1,897 1,887 
 Com a análise de cinco padrões obteve-se a curva de calibração que apresentou 
coeficiente linear de 0,9871 e a seguinte equação linear: Abs = 0,0642x + 0,0268. 
 
 
 
 A amostra 1 foi lida em triplicata e obtiveram as seguintes absorbâncias: 
 
 Absorbâncias (A) 
Amostra 1 0,219 0,577 0,627 
 Através desses valores foi possível foi possível calcular a média: 0,474 A. 
Analisando o desvio padrão de 0,474 ± 0,182 A, vemos a necessidade de excluir a primeira 
leitura de 0,219 pois está muito distante da média, influenciando os valores. Sendo assim, 
através das duplicatas 0,577 A e 0,627 A foi possível calcular a média de 0,602 A e um desvio 
padrão de 0,025 A, evidenciando mais confiabilidade no resultado, já que a primeira leitura 
esteve sujeita a erro experimental na transferência do sobrenadante orgânico para outro tubo, 
onde houve erro no manuseio da pipeta, promovendo uma pequena, mas significativa, agitação 
no meio 
 A amostra de urina foi devidamente preparada para ser medida a absorbância, em 
553 nm, do ácido delta aminolevulínico, obtendo-se um valor de 0,602 A. Portanto, através da 
equação do gráfico, é possível determinar a concentração do ALA: 
 
Abs = 0,0642x+ 0,0268 
0,602 = 0,0642x + 0,0268 
𝑋 = 8,959 𝑚𝑔/𝐿 
 Como ALA sofre considerável variação durante o dia, este valor deve ser corrigido 
de acordo com a concentração de creatinina: 
8,964 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑑𝑒𝑙𝑡𝑎 𝐴𝐿𝐴 → 1,5 𝑔 𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑒𝑎𝑡𝑖𝑛𝑖𝑛𝑎 
𝑥 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑑𝑒𝑙𝑡𝑎 𝐴𝐿𝐴 → 1,0 𝑔 𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑒𝑎𝑡𝑖𝑛𝑖𝑛𝑎 
𝑥 = 5,97 𝑚𝑔/𝑔 
y = 0,0642x + 0,0268
R² = 0,9879
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5 10 15 20 25 30 35
A
b
s
o
rb
â
n
c
ia
 (
A
)
ALA (mg/L)
Curva de calibração
 Outras amostras foram analisadas por outros grupos, que obtiveram os valores: 
Amostras 
Absorbâncias (A) 
Ā 
Conc. De ALA 
(𝒎𝒈/𝑳) 
ALA corrigida 
(mg/g) 1º 2º 
2 0,834 0,736 0,785 11,81 7,87 
3 0,949 0,832 0,891 13,46 8,97 
4 1,393 1,274 1,334 20,36 13,57 
 
Interpretação 
 
O ALA é um indicador biológico que reflete a interferência do chumbo na síntese do 
heme. O chumbo inibe as enzimas ácido delta-aminolevulínico desidratase, coproporfirinogêneo 
descarboxilase e a ferroquelastase. Assim, os substratos dessas reações (ácido delta-
aminolevulínico, coproporfirinogêneo III, protoporfirina) se acumulam. O ALA, em razão do baixo 
peso molecular, atravessa a membrana dos eritrócitos, eleva-se no soro e finalmente é excretado 
na urina. 
A norma brasileira adota o ALA como indicador biológico para a vigilância de 
trabalhadores expostos ao chumbo e estabelece até 4,5 mg/g de creatinina como valor de 
referência da normalidade e estabelece até 10mg/g de creatinina como índice biológico 
máximo permitido (IBMP), portanto, com o resultado da análise da amostra 1, de 5,97 mg/g 
creatinina, é possível perceber que a amostra apresenta quantidade de ALA maior que o valor 
de referência, ou seja não está dentro do normal, portanto deve-se ter um controle maior dos 
níveis de exposição ao chumbo, apesar de o valor encontrado ainda não ultrapassar o IBMP. 
Com base nas referências acima, podemos identificar que as amostras 2 e 3 também 
apresentam quantidade de ALA maior que o valor de referência, 7,87 e 8,97 mg/g de creatina, 
respectivamente, apresentando não estarem nos índices de normalidade de exposição ao 
chumbo. No entanto, ainda não ultrapassam o IBMP. 
Já na amostra 4, possui 13,57 mg/g de creatina, ou seja, há significativa exposição ao 
chumbo, pois ultrapassa os valores de normalidade, inclusive do IBMP. 
Vale ressaltar que o uso de barbitúricos, clordiazepóxido, cloroquina, clorpropamida, 
diazepam, ergotamina, estrógenos, etanol, hidantoína, sulfamídicos pode interferir na sua 
determinação. 
 
Conclusão 
 
 O objetivo da prática foi atingido pois foi possível determinar, através da 
espectrofotometria, a concentração do ácido delta-aminolevulínico na urina e avaliar exposições 
biológicas no metal. 
 É necessário o preparo do branco, o ensaio sem acetoacetato de etila, para calibrar a 
espectrofotometria, eliminando a diferença de absorbância de branco, promovendo então a 
leitura real de absorbância de solução. 
 O p-dimetilbenzaldeido, um componente do reativo de EHRLICH, interage com o Ala-
pirrol, ou seja, o ácido delta aminolevulinico condensado com acetoacetato de etila, e gera um 
composto colorido. Essa coloração pode ser quantificada no espectrofotômetro no comprimento 
de onda determinado, mostrando a concentração de ácido através da intensidade a cor. Quanto 
mais intensa a cor maior a absorbância. 
 O chumbo inibe as enzimas ácido delta-aminolevulínico desidratase, assim os substratos 
dessas reações se acumulam, podendo ser quantificado. 
Referências 
 
AMORIM, Leliane Coelho André, O uso dos biomarcadores na avaliação da exposição 
ocupacional a substâncias químicas. Rev. Bras. Med. Trab., Belo Horizonte, Vol. 1, No 2 p. 124-
132, Out-Dez, 2003. 
Caldeira, Cristiane et al, Applicability limits of urinary D-aminolevulinic acid as a screening test to 
evaluate professional intoxication by lead.