Determinação de ácido hipúrico em urina por HPLC

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS 
 
 
Relatório de Ecotoxicologia 
 
Experimento IV 
Determinação de ácido hipúrico em urina por HPLC 
 
 
 
Alunos: Matrícula: 
Ana Viana 2012.1.05.004 
Jussara Ferreira Mesquita 2015.1.13.041 
Levy Bueno Alves 2015.1.13.031 
Rosângela Gonçalves 2015.1.13.034 
 
Profª. Eduardo Costa Figueiredo 
 
 
 
 
Alfenas, 17 de Outubro de 2017 
 
 
Introdução 
 
O Ácido hipúrico é o principal metabólito urinário do tolueno. A determinação 
urinária é utilizada para monitorização biológica de trabalhadores expostos 
ocupacionalmente ao solvente. Os produtos metabólicos do tolueno são o cresol (menos 
de 1%) e o metabólito intermediário benzaldeído. O benzaldeído é metabolizado a ácido 
benzóico o qual se conjuga com a glicina e forma o ácido hipúrico. 
Cerca de 80% do tolueno inalado é metabolizado a ácido hipúrico e é excretado 
na urina 12 horas após a exposição. Alguns trabalhos incluem dosagens desse 
metabólito para confirmação da efetividade da exposição ao tolueno. Porém outros 
autores afirmam que não há valor diagnóstico nas dosagens de ácido hipúrico pois este 
é um constituinte normal da urina e pode ser influenciado pela dieta. No entanto, é 
importante que se observe o intervalo entre a exposição ao tolueno e a coleta da 
amostra. 
Concentrações de tolueno podem ser bifásicas; um pico inicial é seguido por 
uma baixa refletindo ligação ao lipídios no sistema nervoso central e um pico 
subseqüente pode ocorrer em decorrência da liberação lenta do tolueno na corrente 
sangüínea. O exame pode ser positivo mesmo muitos dias após a retirada do tolueno. 
(Forster et al., Rev Saúde Pública, 28 (2), 1994). 
Usando a técnica de Crommatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC ou 
CLAE), que é o método de separação de compostos químicos em solução amplamente 
usada nas áreas da química e biologia, podemos determinar a concentração de ácido 
hipúrico em urina. 
 
Objetivo 
 
 Determinar a quantidade de ácido hipúrico (AH) na urina, através da técnica de 
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), para diagnóstico de indivíduos que 
podem estar expostos ocupacionalmente ao tolueno. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Métodos 
 
Foi realizado pelas monitoras os seguintes procedimentos: 
 
Calibração - Fazer 3 calibradores e branco da urina (em balão volumétrico) 
 
• C1 = 0,1 mg/ml (adicionar 100μL do padrão 2 a 5ml de urina) - 
homogeneizar no sonicador, 10 min 
• C2 = 0,5 mg/ml (adicionar 50μL do padrão 1 a 5ml de urina) - 
homogeneizar no sonicador,10 min 
• C3 = 1,0 mg/ml (adicionar 100μL do padrão 1 a 5ml de urina) - 
homogeneizar no sonicador, 10 min 
 
Padrão de Ácido Hipúrico (AH) 
 
• Sol. 1(50mg/ml) : Dissolver 0,2525g de HÁ (Sigma, 99%) em 5 ml de 
metanol. Sonicar 10 min e deixar a 4ºC 
• Sol2.(5mg/ml) : Diluir 1:10ml (balão de 10 ml) da sol.1 
 
Posteriormente, o nosso grupo realizou os seguintes tratamentos: 
 
Ensaios Reagentes 
1 1 ml de urina (amostra 1) 1 ml de etanol 
2 1 ml de C2 1 ml de etanol 
3 1 ml de branco 1 ml de etanol 
 
Outros grupos realizaram outros tratamentos diferentes, obedecendo as mesmas 
quantidades de reagentes na tabela acima. Ambos ensaios foram homogeneizados em 
tubo de centrífuga e submetidos à centrifugação de 2000 rpm por 15 minutos. Após isso, 
transferiu-se 500 µL do sobrenadante de cada ensaio para frascos âmbar com tampa 
de rosca para que pudessem ser lidos pela HPLC. 
 
 
 
 
 
No final do processo, obtivemos ao todo: 
 
Grupo A1 A2 C1 C2 C3 Branco 
DBZ 
 
X X 
 
X 
 
ELI 
 
X X 
 
Laís 
 
X 
 
X 
 
LJA X 
 
X 
 
X 
WW X 
 
X 
YMT X 
 
X 
 
Total 3 3 2 2 2 2 
 
Totalizando uma duplicata de branco da urina, uma duplicata de cada calibrador 
e uma triplicata de cada amostra. Foram injetados 20 µL do sobrenadante no HPLC. 
Na técnica de HPLC respeitou-se as seguintes condições: 
 
Condições do HPLC 
Fase móvel: água/metanol/ácido acético (para 1L = 792/200/8) 
Vazão: 1,3 ml/min 
C.onda = 257nm 
 
Técnica de Cromatografia Líquida de Alta Pressão 
A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está 
fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre 
devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase 
estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias a 
torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação. A cromatografia pode 
ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com padrões 
previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias 
indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura. O grande avanço 
na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a utilização de suportes com 
partículas diminutas responsáveis pela alta eficiência, as quais tornam necessário o uso 
de bombas de alta pressão para a eluição da fase móvel, devido a sua baixa 
permeabilidade. A Figura 1 mostra um equipamento típico de HPLC. As fases móveis 
utilizadas em HPLC devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxigênio ou 
outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso. 
 
 
Figura 1 – Esquema do equipamento de HPLC 
 
A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta 
reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado. As 
válvulas de injeção usadas possuem uma alça de amostragem para a introdução da 
amostra com uma seringa e duas posições, uma para o preenchimento da alça e outra 
para sua liberação para a coluna. Existem alças de diversos volumes, sendo utilizadas 
geralmente alças na faixa de 5-50 μL para injeções analíticas e 0,5-2 mL para 
preparativas. As colunas utilizadas em HPLC são geralmente de aço inoxidável, com 
diâmetro interno de cerca de0, 45 cm para separações analíticas e na faixa de 2,2 cm 
para preparativas. O comprimento é variável, sendo comuns colunas analíticas de 10-
25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas colunas são reaproveitáveis, sendo 
empacotadas com suportes de alta resolução, não sendo necessária sua regeneração 
após cada separação. O detector mais utilizado para separações por HPLC é o detector 
de ultravioleta, sendo também empregados detectores de fluorescência, de índice de 
refração, e eletroquímicos, entre outros. 
Detectores de polarimetria para HPLC, recentemente desenvolvidos, 
diferenciam compostos quirais, através da rotação de seus estereoisômeros frente à luz 
plano-polarizada. 
 
Fundamento químico: 
O ácido hipúrico é considerado um marcador de exposição ocupacional para o 
tolueno estando a sua concentração relacionada à exposição ocupacional, durante a 
jornada de trabalho do dia. O tolueno é um composto aromático também chamado de 
metilbenzeno por sua estrutura química. É um líquido incolor, volátil quando em pressão 
de vapor a 25°C, com propriedade significativa de lipossolubilidade e que apresenta 
traços de benzeno de até25%, quando utilizado para fins comerciais. A absorção ocorre 
principalmente pela via pulmonar, sendo que cerca de 40% do tolueno inalado é 
absorvido pelos pulmões. A absorção ocorre principalmente pela via pulmonar, sendo 
que cerca de 40% do tolueno inalado é absorvido pelos pulmões. A principal via de 
biotransformação é a oxidaçãodo grupamento metila. O primeiro passo corresponde à 
formação do álcool benzílico, mediado pelo citocromo P450.Segue-se a oxidação a 
benzaldeído, pela ação de álcool desidrogenase e finalmente a formação do ácido 
benzóico, etapa catalisada pela enzima aldeído desidrogenase . Este ácido se conjuga 
principalmente com a glicina, formando o ácido hipúrico e em menor proporção com o 
ácido glicurônico, produzindo benzoilglicuronatos. O Etanol utilizado no tratamento da 
amostra tem função de precipitar cristais de urina. 
 
Resultados e discussões 
 
 Através da análise das cromatografias obtivemos os seguintes resultados: 
Resultados 
Tratamentos 1º 2º Média 
Branco 109684 90816 100250 
C1 291490 269555 280523 
C2 1163451 1655190 1409321 
C3 2872425 2700299 2786362 
 
 Os valores médios de C1, C2, e C3 foram subtraídos com a média do 
branco, permitindo a construção de uma curva de calibração: 
 
 
y = 3E+06x - 92464
R² = 1
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
mg/mL
Curva de Calibração
 Foram analisadas duas amostras: A1 e A2, onde: 
 
Resultados 
Amostras 1º 2º 3º Média 
A1 657704 709010 *1251549 683357 
A2 1996238 2030817 1947686 2013527,5 
 
 Atenção: o terceiro ensaio de A1, representado por “*”, foi desconsiderado 
para o cálculo da média já que pode influenciar no resultado. Assim: 
 
Substituindo em A1: 
683357 = 3000000 x – 92464 
x = 0,26 mg/mL ou 0,26 g/L 
Substituindo em A2: 
2013527,5= 3000000 x - 92464 
x = 0,70 mg/mL ou 0,7 g/L 
Para amostra 1: 
0,26 ÷ 1,5 = 0,17 g de ácido hipúrico /g de creatinina 
Para amostra 2: 
0,70 ÷ 1,5 = 0,47 g de ácido hipúrico/g de creatinina 
 
Interpretação 
 Valores de referência: 
 
VR = 1,5 g/g de creatinina 
IBMP = 2,5 g/g de creatinina 
 
Pode-se interpretar que a quantidade de ácido hipúrico/creatinina na urina tanto 
na amostra 1, que equivale a 0,17 g de ácido hipúrico/g de creatinina, assim como na 
amostra 2 que equivale a 0,47 g de ácido hipúrico/g de creatinina, estão abaixo do Valor 
de Referência e abaixo do IBMP estabelecidos. Portanto, o valor está dentro do 
esperado. 
 
 
 
Conclusão 
 
 Conclui-se que pelo método de HPLC, que a quantidade de ácido hipúrico na 
urina está abaixo do estabelecido, portanto dentro do padrão (VR=1,5g/g de creatinina 
e IBMP= 2,5g/g de creatinina). 
Através do gráfico, pode-se concluir que ele é crescente, porque quanto maior a 
concentração do calibrador, maior o sinal. Este aumento é linear, porque respeita a 
equação de uma reta. 
 
Referências 
 
OGA, S Fundamentos de toxicologia. 3° edição. São Paulo: ateneu Editora, 2008 
 
LORENZETTI, G. G.; LETTIERI, M. T. Avaliação de ácido hipúrico como biomarcador 
de exposição ocupacional em trabalhadores de postos de combustíveis. Revista Saúde 
e Pesquisa, v. 2, n.3, p. 319-324, 2009. 
 
SILVA, Z. L.; NICÁCIO, J. S.; JACINTO, M.; AMORIN, L. C. A.; ALVAREZLEITE, E. M. 
Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. Vol. 38, n. 2, 2002. 
 
SIQUEIRA, M. E. P. B.; PAIVA, M. J. N. Hippuric acid in urine: reference values. Revista 
Saúde Pública, 36 (6), p. 723-727, 2002.