Determinação de aflatoxinas em amendoim e seus derivados

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS 
 
 
Relatório de Ecotoxicologia 
 
Experimento VIII 
Determinação de aflatoxinas em amendoim e seus 
derivados 
 
 
 
Discentes: Nº de matrícula: 
Jussara F. Mesquita - 2015.1.13.041 
Levy B. Alves - 2015.1.13.031 
Rosângela Gonçalves - 2015.1.13.034 
Thiago Amaral - 2015.1.13.035 
Wagner Carlos - 2015.1.13.028 
Profª. Eduardo Costa Figueiredo 
 
 
 
Alfenas, 12 de Dezembro de 2017 
 
 
Introdução 
Os alimentos estão sujeitos à contaminação por substâncias químicas, dentre elas, 
as aflatoxinas, que são produzidas, principalmente, por dois fungos (Aspergillus flavus e 
Aspergillus parasiticus), e são potencialmente carcinogênicas. 
Designa-se contaminante químico de alimento toda substância que não seja um de 
seus constituintes naturais, podendo se tornar parte do alimento durante sua produção, 
processamento ou armazenamento por fatores naturais ou artificiais, e que ofereça risco 
de danificar à saúde do consumidor (Midio & Martins, 2000; Rocha et al., 2008) 
Os alimentos, de modo geral, estão sujeitos à contaminação por estas substâncias. 
Pequenas modificações na composição química dos alimentos dadas pela decomposição, 
tratamento culinário ou tecnológico inadequado, falsificações e adulterações, poderão 
levar a efeitos nocivos aos organismos que os ingerem no decorrer do tempo e, uma vez 
que muitas delas são tóxicas, sua ingestão é capaz de causar sérios transtornos aos 
organismos, tanto humanos quanto animais (Sabino et al., 1997, Rocha et al., 2008) 
O desenvolvimento de fungos não implica na presença de micotoxinas no 
substrato. Mesmo dentro de um gênero potencialmente toxigênico, isso não requer que 
todas as espécies produzam toxinas. Por outro lado, a ausência de sinais aparentes de 
contaminação por fungos não significa que o alimento se encontra livre de toxinas, já que 
elas podem permanecer no produto mesmo depois do desaparecimento dos fungos 
responsáveis por sua produção (Sabino et al., 1997; Oliveira & Koller, 2011). 
Dentre as micotoxinas existentes, as aflatoxinas são as que podem causar maiores 
danos aos seres humanos e animais, pela sua alta toxidez e ampla ocorrência, possuindo 
propriedades carcinogênicas, mutagênicas, teratogênicas e imunossupressoras (Sylos et 
al., 1996; Nordin & Luchese, 1998). 
Estes efeitos sofrem influência do estado nutricional, gênero, idade, exposição a 
outros agentes químicos, dose e período de exposição à toxina, espécie, frequência e 
composição da dieta (Amado, 2002). 
O termo aflatoxinas normalmente se refere aos quatro compostos do grupo 
bifuranocumarina, metabólitos produzidos por Aspergillus flavus e parasiticus: 
aflatoxinas B1, B2, G1 e G2. (Sabino, 2008 apud Oga, 2008). Sendo que a aflatoxina B1 
é classificada como potencialmente carcinogênica (Eaton & Groopman, 1994; Rocha et 
al., 2008). A classificação das aflatoxinas é dada de acordo com a cor da fluorescência, 
em B (blue-azul) ou G (green-verde), sendo esta propriedade importante para sua 
identificação em diversos tipos de alimentos. São substâncias instáveis à luz, porém 
estáveis a temperaturas acima de 100ºC (Rocha et al., 2008). 
Neste contexto, sabendo que as aflatoxinas são altamente tóxicas e que os 
produtos alimentícios, como amendoim e derivados, compõem o substrato ideal para o 
crescimento de fungos, torna-se de importância majoritária um maior conhecimento da 
presença destas micotoxinas em alimentos, visto os riscos que estas possam causar no 
organismo humano, e, com isso, à saúde humana. 
 
Materiais e métodos 
1. Reativos - Metanol; solução de cloreto de potássio 4%; clorofórmio; solução de 
sulfato de cobre 10%; sistema solvente tolueno : acetato de etila : ácido fórmico 
(60:30:10); 
2. Solução padrão de aflatoxinas - B1, B2, G1 e G2 de concentrações conhecidas. 
Técnica 
a) Extração - Pesar 50 g da amostra em um béquer. Adicionar 270 mL de metanol 
e 30 mL de solução de cloreto de potássio 4%. Extrair em liquidificador por 5 
minutos. Filtrar em papel de filtro recolhendo 150 mL do extrato filtrado em um 
béquer de 500 mL; 
b) Purificação do extrato - Adicionar 150 mL da solução de sulfato de cobre 10% 
e 5g de celite. Agitar a mistura com bastão de vidro e filtrar através de papel de 
filtro; 
c) Extração liquido-liquido - Em funil de separação de 1000 mL, transferir 150 mL 
do filtrado da fase anterior. Adicionar 150 mL de água destilada e extrair 2 vezes 
(por 3 minutos) com 10 ml de clorofórmio. Juntar 10 mL do extrato em erlenmeyer 
de 50 mL e evaporar à secura em banho de água a 80oC. Conservar em geladeira 
envolto em papel alumínio; 
d) Cromatografia em camada delgada - Eluir em 500 µL de clorofórmio e aplicar 
10µL da amostra em placas de silica gel G, de 0,25 mm de espessura juntamente 
com os padrões. Leitura em UV-366 nm. 
Resultados e discussões 
As amostras foram conduzidas da seguinte forma na placa de sílica gel G: 
 
Imagem 1: Esquema da placa de sílica gel G, onde foi aplicado diferentes 
amostras para serem analisadas através de soluções padrões de aflatoxinas (B1, B2, G1, 
G2). Nas colunas de B1, B2, G1 e G2 foram realizadas 5 marcações, onde foram aplicadas, 
sempre da esquerda para direita, diferentes concentrações destas aftoxicinas, sendo: 1; 2; 
3,5; 5 e 6 µL de cada uma. As amostras foram aplicadas nas pistas, 1, 2, 3 e 4 da 
cromatoplaca; na pista 5 não foi aplicado nenhuma substância. 
Após a realização dos procedimentos, obtivemos os seguintes resultados: 
 
Imagem 2: Leitura das amostras 1, 2, 3 e 4 dispostas na placa de sílica gel G, de 
0,25 mm de espessura juntamente com os padrões. 
Através da técnica de cromatografia em camada delgada foi possível fazer uma 
triagem semi-quantitativa, onde foi possível identificar as aftoxinas presentes em 
diferentes amostras de paçoca (derivado de amendoim). Para isso, calculamos os fatores 
de retenção (Rf) de 8 marcações realizadas na cromatoplaca através da seguinte equação: 
𝑅𝑓 =
𝑑 (𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎)
𝑑 (𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑒𝑙)
 
 
 Sendo o valor da fase móvel igual a 8 cm, obtivemos os seguintes resultados: 
 𝑅𝑓𝐵1 = 
2,3
8
= 0,29 
 𝑅𝑓𝐵2 = 
1,9
8
= 0,24 
 𝑅𝑓1 = 
1,5
8
= 0,19; 
2,4
8
 = 0,3 
 𝑅𝑓2 = 
1,1
8
= 0,14; 
1,8
8
 = 0,23 
 𝑅𝑓𝐺1 = 
1,6
8
= 0,2 
 𝑅𝑓𝐺2 = 
1,1
8
= 0,14 
Multiplicamos os resultados de Rf por cem e obtivemos os seguintes valores: 
Padrão Resultado (%) 
B1 29 
B2 24 
G1 20 
G2 14 
 
Amostra Resultado (%) 
1 30 
2 23 
3 ø 
4 ø 
 
 Diante desses resultados, podemos observar que as amostras de paçoca I e II 
apresentarem índices de aflatoxinas. Através dos Rf, da cor (azul para B1 e B2 e verde 
para G1 e G2), e a intensidade da cor das marcações na cromatoplaca, tanto das amostras 
quanto dos padrões, foi possível identificar, por comparação, que a amostra I indicou a 
presença de 6 µL de B1 e 6 µL G1. Enquanto a amostra II, 5 µL de B2 e 6 µL de G2. Já 
as amostras 3 e 4 não indicaram a presença das aflatoxinas analisadas (B1, B2, G1 e G2). 
 Os resultados permitiram a quantificação das aflatoxinas através da 
seguinte equação: 
µ𝑔 𝐾𝑔⁄ (ppb)de aflatoxina = 
𝑆 ∗ 𝑌 ∗ 𝑉
𝑍 ∗ 𝑊
 
 Onde: 
 S = µL da aflatoxicina padrão, de fluorescência e Rf igual à amostra 
 Y = concentração de aflatoxina padrão, em µg/mL, usada na cromatografia 
 V = µL do solvente requerido para diluir o extrato final 
 Z = µL do extrato da amostra aplicado na placa 
 W = gramas de amostra contida no extrato final 
 Para a utilização da equação,utilizamos os seguintes valores: 
Amostra Aflatoxinas (µL) 
I 
B1 6 
G1 6 
II 
B2 5 
G2 6 
 
Padrão Composição (mg/mL) 
B1 0,54 
B2 1,05 
G1 1,58 
G2 0,62 
 
 Na prática, foi utilizado 500 µL de clorofórmio para extrair o solvente final 
(V=500 µL) e apenas 10 µL do extrato foi aplicado na cromatoplaca (Z= 10 µL). Apesar 
da massa inicial da amostra conter 50 gramas, considerando as diluições e extrações, a 
massa contida no final do processo foi equivalente a 6,25 g (W = 6,25 g). 
 
 
 Sendo assim: 
𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐼𝐵1 = 
6 ∗ 0,54 ∗ 500
10 ∗ 6,25
= 25,92 µ𝑔 𝐾𝑔⁄ 
𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐼𝐺1 = 
6 ∗ 1,58 ∗ 500
10 ∗ 6,25
= 75,84 µ𝑔 𝐾𝑔⁄ 
𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐼𝐼𝐵2 = 
5 ∗ 1,05 ∗ 500
10 ∗ 6,25
= 42 µ𝑔 𝐾𝑔⁄ 
𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐼𝐼𝐺2 = 
6 ∗ 0,62 ∗ 500
10 ∗ 6,25
= 29,76 µ𝑔 𝐾𝑔⁄ 
 
 Interpretação 
Com os resultados, as amostras I e II estariam inadequadas para o consumo 
humano, uma vez que o Ministério da Saúde determina o limite máximo de contaminação 
de 20 µ𝑔 𝐾𝑔⁄ para o somatório das aftoxinas B1, B2, G1 e G2. Na amostra , o somatório 
das aftoxinas B1 e G1 foi de 101,76 µ𝑔 𝐾𝑔⁄ enquanto a amostra II, o somatório de B2 e 
G2 foi de 71,76 µ𝑔 𝐾𝑔⁄ , ou seja, a amostra I ultrapassou aproximadamente 5 vezes o 
limite máximo permitido, enquanto a amostra II, aproximadamente 3 vezes. Sendo assim, 
constatou um quadro de contaminação nas amostras de paçoquinha de amendoim 
analisadas, sendo estas, impróprias para o consumo humana, pois se consumidas podem 
trazer sérios riscos à saúde humana, inclusive o aumento do risco de contração de câncer. 
Vale ressaltar, que como o método utilizado para a análise é semi-quantitativo, pode-se 
utilizar para uma posterior análise mais precisa, técnicas mais refinadas, como por 
exemplo, a cromatografia líquida de alta eficiência. 
 
Conclusão 
Com os resultados, podemos afirmar que há presença de aflatoxinas nas amostras 
I e II da paçoca de amendoim em concentrações maiores que as do limite máximo 
permitido (de 20 µ𝑔 𝐾𝑔⁄ ). Foi possível concluir que as amostras, caso consumidas, 
poderiam trazer sérios riscos à saúde humana, e também, que as contaminações por 
aflatoxinas representam perigos associados à cadeia produtiva o amendoim e seus 
derivados. 
 Referências: 
 Midio A F, Martins D I. Toxicologia de Alimentos. São Paulo: Varela; 2000. 
 Rocha M D, Maia P P, Rodrigues M A C, Martins I. Incidência de aflatoxinas 
em amostras de amendoim e paçoca comercializadas na cidade de Alfenas-MG, 
Brasil. Rev Bras Toxicol. 2008;1:15 -9. 
 Sabino M, Milanez T V, Lamardo L C A, Navas A S, Stofer M, Garcia C B. 
Evaluation of the efficiency of two immunoassay kits for detection of aflatoxin 
B1 in cor,n fish feed, peanuts and its products. Ciênc Tecnol Aliment. 1997;107-
10. 
 Amado M A. Métodos imunológicos na detecção e determinação de aflatoxinas 
em alimentos: vantagens e inconvenientes. Millenium. Revista do ISPV . 
2002;26:57-60. 
 Oliveira L S F, Koller F F C. Ocorrência de Aspergillus spp.e Aflatoxinas em 
amostras de amendoim in natura e paçocas. Rev Ciên Ambien. 2011;5:57-68. 
 Sylos C M, Rodriguez-Amaya D B, Carvalho P R N. Occurrence of aflatoxin 
M1 in milk and dairy products commercialized in Campinas, Brazil. Food Addit 
Contamin. 1996;13(2):169-72. 
 Nordin N, Luchese R H. Detecção de aflatoxina e zearalenona em milho 
(Zeamays), destinado à alimentação animal. Bol Soc Bras Ciênc Tecnol Aliment. 
1998;32(1):35-9.