Técnicas de Imunodiagnóstico 3

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Interações Antígeno-Anticorpo
Ana Cláudia Carvalho Gouveia
	
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Interações Ag - Ac
 Ligações não covalentes
Reversíveis
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Características das interações Ag-Ac
Afinidade
	Força de interação entre um único sítio de ligação Ag-Ac (em um único epítopo).
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Características das interações Ag-Ac
Avidez
	- Força de interações total entre Ac e Ag.
 - Soma das afinidades de todos epítopos envolvidos 
Especificidade
	- Capacidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ags. 
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Características das interações Ag-Ac
Reação cruzada
- Dois Ag diferentes apresentam epítopos estruturalmente 
semelhantes
- Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não
 relacionado, mas com propriedades químicas similares.
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Métodos
Reagentes não marcados
(A ligação do Ac altera o estado físico do Ag)
Reação de aglutinação
Reação de precipitação
Reagentes marcados
RIA
ELISA 
IF, citometria de fluxo
Western Blotting
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Reação de aglutinação
Direta eritrócitos (hemaglutinação), bactérias, fungos
Passiva látex	
(Ag insolúvel)
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Inibição da Aglutinação
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Quantidades de Ag solúvel são adicionadas a uma quantidade fixa de soro contendo o Ac. 
Precipitado visível
Reação de precipitação
A medida que a quantidade de Ag aumenta, a quantidade de precipitado também aumenta até um máximo, para depois diminuir. 
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Precipitação em solução
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Precipitação em gel
Imunodifusão Radial
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Precipitação em gel
Imunodifusão Dupla
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Reagentes marcados
 Enzimas, fluorocromos, isótopos
 Tipos:
 RIA
ELISA 
IF, citometria de fluxo
Western Blotting
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Radioimunoensaios
 Utilizam Ac conjugados com radioisótopos para quantificar os ensaios.
 • Vantagens:
– Alta sensibilidade
– Permite medidas rápidas e precisas
• Desvantagens:
– Custo
– Vida média dos reagentes
– Risco operacional (radiação)
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ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
- Baseia-se na quantificação de uma reação enzimática associada com complexos imunes.
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Imunofluorescência
- Utilizam-se Ac ou Ag conjugados a moléculas reveladoras
chamadas fluorocromos.
 Visualização em microscópio de fluorescência
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	Isotiocianato de fluoresceína (FITC) VERDE 
 Ficoeritrina (FE) VERMELHA
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Imunofluorescência Direta
Aplicações:
 Detecção direta de microrganismos 
(secreções, urina, cortes de tecidos); 
 Identificação de subpopulações de linfócitos;
 Fenotipagem de células tumorais
Ex.: Detecção de Chlamydia trachomatis 
em secreção uretral
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Ex.: Detecção de Ac anti- T. cruzi
Aplicações:
 Detecção de anticorpos específicos contra 
diversos microrganismos; 
 Diagnóstico de doenças auto-imunes; 
 Detecção de Ac anti-nuclear
Imunofluorescência Indireta
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Citometria de fluxo
 Detecta, separa e quantifica células contendo um antígeno particular, marcadas com um fluorocromo; 
 Cada anticorpo é marcado com um fluorocromo diferente; 
 As células são então analizadas no citômetro de fluxo.
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 As células saem de uma célula de fluxo e são iluminadas por um raio laser; 
Citometria de fluxo
 A quantidade de raios laser que é dispersa para fora das células durante a passagem das mesmas pelo laser pode ser medida, o que proporciona informação a respeito do tamanho das células. 
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- O laser pode também excitar o fluorocromo nas células e a luz fluorescente emitida pode ser medida por um ou mais detectores.
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Aplicações:
Caracterização de populações celulares;
 Contagem de microrganismos;
 Separação de populações celulares de acordo com a densidade dos antígenos, tamanho e granulosidade das células;
- Análise de proliferação celular.
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Western Blot
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Ensaios imunocromatográficos
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Técnicas de Biologia Molecular
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Reação da Polimerase em Cadeia
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RT-PCR 
(Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction)
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Termociclador
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Detecção da Amplificação
Produto 
(PCR ou RT-PCR)
Eletroforese em 
gel de 
poliacrilamida
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Qual a principal diferença entre os métodos de ELISA e imunofluorescência?
2. Em uma tipagem sanguínea houve aglutinação ao se misturar o sangue pesquisado e os soros anti-AB e anti-Rh. Determine o tipo sanguíneo e faça um esquema explicando a reação ocorrida. 
Quais as características do anticorpo que podem influenciar a sua ligação ao antígeno? 
Ao realizar os exames pré-natais, a gestante J.A.C, 26 anos, apresentou teste ELISA positivo para HIV. Como você interpreta este resultado? Descreva suscintamente a reação ocorrida. 
 Qual imunoensaio você escolheria para o acompanhar o prognóstico de um paciente com linfoma? Justifique sua resposta.
Relatório
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