Aula 2 Metodologias Biotecnológicas

Prévia do material em texto

Metodologias 
Biotecnológicas
Prof. Rodrigo Vela
Enzimas de restrição
Também chamadas endonucleases, desempenham função de clivagem da 
molécula de DNA em pontos específicos, em reconhecimento a determinadas 
sequências de nucleotídeos.
Enzimas de restrição
• Reconhecem e clivam o DNA em
pontos específicos, geralmente em
sequências de 4, 6 e 8 bases –
palíndromas.
• São Palíndrome: possuem o mesmo
sentido de leitura nas duas direções.
Corte
Corte
ARARA
Leitura
Enzimas de restrição
Exemplos de enzimas de restrição
Eletroforese em gel de agarose
• Eletroforese: Define-se como o movimento de partículas carregadas 
eletricamente em um meio líquido elétrico, sob a influência de um campo 
elétrico.
Eletroforese em gel de agarose
• Eletrólitos: solução tampão 
• Eletrodos: instalados dentro dos 
reservatórios de tampão, fazem a 
conexão elétrica e aplicação do 
campo elétrico através da coluna; 
Eletrólitos
Eletroforese em gel de agarose
• Ordem de migração: íons positivos 
migram para o polo negativo; íons 
negativos migram para o polo 
positivo; a razão de migração 
depende da razão carga/tamanho; 
↑ a relação carga/ tamanho, ↑ a 
velocidade; íons positivos 
íons negativos 
Eletroforese em gel de agarose
• A agarose é um polissacárido que é 
dissolvido numa solução tampão 
quente e solidifica à temperatura 
ambiente. 
• A concentração 
de agarose determina o tamanho dos 
poros da matriz solidificada. 
• Uma maior concentração 
de agarose faz com que os poros 
formados apresentem menores 
dimensões, e por isso permitam a 
separação de fragmentos de 
DNA menores com maior resolução.
Agarose em pó Gel de agarose
Micrografia eletrônica mostrando 
poros do gel de agarose
Eletroforese em gel de agarose
Eletroforese em gel de agarose
Géis de agarose
Aplicação da Amostra
Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR (Reação em Cadeia da 
Polimerase)
Técnica que amplifica uma sequência 
específica de DNA, com o objetivo de 
torná-la abundante e disponível para 
diversas técnicas de biologia 
molecular.
Gene de interesse
Amostra de 
DNA
1° ciclo
2° ciclo
3° ciclo
4° ciclo
4 cópias 8 cópias 16 cópias 32 cópias
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que flanqueiam a 
sequência específica de DNA a ser amplificada, a qual pode ser um gene 
inteiro ou somente uma região pequena.
...GGACTATTCAGGGACTTCGATCGGATAATCTTTCGCG
GCTTCGCCTCGTAGCTTAGAAACTTCGGAATCGATTAGC
TTAGACAGGCTTCAC...
Gene
Gene total
Fragmento de interesse
Polymerase Chain Reaction (PCR) - Etapas
Desnaturação
É o primeiro passo do PCR, no qual as fitas de DNA são separadas através de 
aquecimento a 95°C. 
Dupla hélice
Fita desnaturada
Polymerase Chain Reaction (PCR) - Etapas
Anelamento
processo através do qual duas sequencias de nucleotídeos são ligadas 
através da formação de ligações de hidrogênio. 
Na reação de PCR, o anelamento se dá através da ligação dos primers com 
o DNA alvo, na temperatura próxima de 55°C.
Primers: sequências de 15 a 30
nucleotídeos, fita única, que
são usadas para flanquearem as
extremidades da região a ser
amplificada. Marcam o início e
o fim da sequência-alvo.
Polymerase Chain Reaction (PCR) - Etapas
Extensão 
A enzima DNA polimerase adiciona nucleotídeos à extremidade 3’ final de 
cada primer. Ocorre à temperatura de 72°C.
Anelamento Extensão
Polymerase Chain Reaction (PCR) - Etapas
Anelamento
Extensão
Desnaturação
Repetição por vários 
ciclos: 30 a 40
Polymerase Chain Reaction (PCR) - Etapas
Equipamento
Termociclador: equipamento que faz ciclos de temperaturas e permite 
realizar a PCR.
Polymerase Chain Reaction (PCR) - Etapas
Coloração das Moléculas amplificadas
Usa-se agentes intercalantes de DNA: são compostos que intercalam entre as 
bases nitrogenadas. Na presença de luz ultra violeta emitem luz visível.
PCR em tempo real (QPCR)
• Metodologia de PCR + Sistema de 
detecção de sinais fluorescentes 
• Detecção, quantificação e 
amplificação de DNA em uma única 
etapa 
- Agilidade na obtenção de 
resultados 
• Técnica quantitativa 
- Quantificação do número de 
moléculas produzidas a cada ciclo 
Sonda Fluorescente
Filtro
Câmera
PCR em tempo real (QPCR)
• Etapas de amplificação de uma 
PCR convencional 
-Temperaturas e tempos diferentes 
- Curva de dissociação 
•Coleta de dados 
-Fase exponencial da reação 
PCR em tempo real (QPCR)
• Reagentes de uma PCR convencional + 
Corante 
-Intercalantes de DNA de dupla fita (dsDNA) 
-Oligonucleotídeos marcados 
Sonda Fluorescente
Fita de DNA
Fita complementar
Nucleotídeos
PCR em tempo real (QPCR)
• Plataforma de instrumentação 
-Termociclador + Sistema Óptico 
-Computador com software para aquisição 
de dados e análise final 
Espelho
Filtro
Câmera
Lâmpada
Lente
Filtro de 
excitação
Placa de 96 
amostras
PCR em tempo real (QPCR) – Sistema de detecção
Detecção não-específica
• Fluoróforos ligando-se ao dsDNA e emitindo fluorescência 
- SYBR-Green® 
PCR em tempo real (QPCR) – Sistema de detecção
Detecção específica 
•Oligonucleotídeos marcados com fluoróforos altamente específico a 
sequência alvo, emitindo fluorescência apenas na presença do 
produto de PCR de interesse o TaqMan® 
Sequenciamento de DNA
Finalidade: -Determinar a ordem dos nucleotídeos em um 
fragmento na molécula de DNA
Sequenciamento de DNA
• Método de Sanger. Método 
enzimático, dideoxi ou de término da 
cadeia
• Síntese enzimática de uma fita 
complementar, cujo crescimento é 
interrompido pela adição de um 
dideoxinucleotídeo (ddNTP)
Frederick Sanger
O radical OH presente no dNTP é 
necessário para o elongamento da 
cadeia. A DNA Polimerase
incorpora um novo nucleotídeo 
nesta região.
Sequenciamento de DNA Frederick Sanger
ddGTP termina a síntese onde a 
amostra de DNA apresenta C. ddCTP, 
ddATP e ddTTP terminam a síntese 
onde aparece G, T e A, 
respectivamente 
Primer
Frederick Sanger
Princípio
Frederick Sanger
Princípio
Sequenciamento de DNA
• Anos 80
• Mesmo princípio utilizado por Sanger
• ddNTPs Fluorescentes
- Substituição dos radioativos
- Aplicação no mesmo poço
Sequenciamento de DNA