TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

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TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS – TSA OU ANTIBIOGRAMA
Mecanismo de Ação dos Antimicrobianos
Histórico 
1929 – Alexandre Fleming – descobriu a penicilina
1929 até hoje
 ~ 250 antimicrobianos comercializados 
Surgimento da resistência aos antimicrobianos – devido ao uso indiscriminado
Essência da quimioterapia antimicrobiana - Toxicidade seletiva, ou seja, o antibiótico prejudica a bactéria mas não pode prejudicar o hospedeiro;
Os antibióticos podem ter uma ação bactericida (antibiótico mata a bactéria) ou bacteriostática (antibiótico inibe o crescimento bacteriano/inibe o metabolismo). 
Observação: no caso de pacientes imunossuprimidos escolhemos os antibióticos que são bactericidas.
Alguns antibióticos são bacteriostáticos em uma determinada concentração, e se aumentamos essa concentração ele também passa a ser bactericida. 
Principais mecanismos de ação dos antimicrobianos
	Os antibióticos podem atuar na parede celular, na membrana plasmática (desorganizando a membrana e levando a formação de poros), na síntese de proteína – ribossomos (faz com que haja uma leitura errada; inibição da peptidil – tranferase; trava a translocação do ribossomo), no DNA (produtos do metabolismo do antibiótico vai se inserir na molécula de DNA, degradando-a, o antibiótico inibe a DNAgirase (responsável por enovelar e desenovelar o DNA), pode também inibir a RNApolimerase, além de poder fazer uma inibição competitiva do metabolismo do ácido para-aminobenzóico, que vai produzir os co-fatores necessários para a produção das bases nitrogenadas. 
Principais mecanismos de resistência
A bactéria pode produzir enzimas inativantes, de modo a degradar o antibiótico; a bactéria mudar o sitio de ação do antibiótico, este não terá mais efeito; a bactéria pode mudar a permeabilidade, isto é, não deixar que o antibiótico entrar, ou se este entrar a bactéria consegue colocá-lo para fora. 
Características gerais
Sinônimos - TSA ou antibiograma;
Notável importância clínica e terapêutica;
Realizados para detecção de resistência de bactérias isoladas de amostras clínicas, onde as mesmas já foram identificadas;
Resultados - Influenciados por diferentes fatores havendo a necessidade de padronizações extremamente rígidas;
Principais métodos - Disco-difusão (ou disco-difusão, é um teste qualitativo – veremos a quais antibióticos a bactéria é resistente), microdiluição em caldo (teste quantitativo), macrodiluição em caldo (teste quantitativo), difusão em ágar e E-test (teste quantitativo);
Parâmetros a serem observados na realização dos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos:
Meio padrão - Müeller-Hinton
pH do meio de cultura - Entre 7,2 e 7,4;
Meio rico em cálcio e magnésio, pois vai fazer com que a bactéria tenha uma alta atividade metabólica e cresça muito bem. 
Padronização do inóculo – é muito importante, pois as bactérias precisam ter um crescimento confluente, isto é, crescimento em tapete. E esse crescimento se dá se tivermos um inóculo muito bom, em torno de 150 milhões de bactérias/ml, e para isso utilizamos a escala MacFarland, que é equivalente à escala 0,5MF (MacFarland - 1,5x108 UFC/mL). 
Observação: como utilizar a escala? Comprar a escala e fazer a comparação através da turbidez. Um outro método é colocar o meio MacFarland no espectrofotômetro para obter um valor de densidade optica e depois pegar amostra, previamente misturada com solução salina, coloca no espectrofotômetro e ver se a densidade é parecida com a do MacFarland. 
Espessura do meio de cultura – no mínimo 4mm 
Temperatura de incubação – normalmente de 37ºC
Atmosfera de incubação – +/- 5% de CO2
Parâmetros a serem observados na realização dos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos:
Prepara o meio de cultura
Semear a bactéria 
Colocar o antibiótico
Incubar e esperar o crescimento
Observação: 
Não devemos colocar a bactéria para crescer sem antes colocar os discos de antibiótico, pois se fizermos isso o antibiótico não vai se difundir no meio e por sua vez inibir o crescimento. 
O local da inibição do crescimento bacteriano em volta do disco de antibiótico se chama halo de inibição. Este halo deve ser medido com uma régua, para saber o diâmetro e posteriormente fazer a comparação com uma tabela que sai anualmente, para então sabermos se a bactéria é sensível ou resistente ao antibiótico.
Seleção dos antimicrobianos:
O laboratório tem a responsabilidade de testar e reportar os antimicrobianos mais apropriados para o microrganismo isolado e o sítio de infecção;
Os antimicrobianos testados e reportados pelo laboratório devem ser adequados para o tipo de hospital ou instituição, isto é, não adianta testar um antibiótico de última geração, se na instituição não tem tal antibiótico para tratar o paciente. 
As orientações sobre os antimicrobianos mais adequados para cada grupo de microrganismos são publicadas e atualizadas anualmente nos manuais de interpretação, como CLSI (mostra o microrganismo e o antibiótico a ser utilizado) ou EUCAST.
Controle de qualidade:
Bactérias conhecidas que são adquiridas em um banco de células americano e essas bactérias vão monitorar a precisão e acurácia dos procedimentos aplicados nos testes. Se os resultados não baterem com a tabela CLSI, o meio de cultura pode estar errado, pode estar havendo erro em algum procedimento até chegar ao inoculo, ou o antibiótico está vencido.
Verificar a qualidade dos materiais empregados e o desempenho do técnico que conduz o teste e finaliza o exame; 
 Cepas padrões
 (ATCC – American Type Culture Collection)
Procedimento Laboratorial
Método de Disco Difusão ou Método de Kirby-Bauer 
Método qualitativo
A partir de uma colônia pura, previamente identificada, devemos colocar na solução salina para que tenhamos um bom inoculo (150 bactérias/ml); fazer a semeadura a partir desse inoculo com auxílio de uma alça de Drigalsky ou swab por toda a placa e depois colocar os discos (colocar no máximo 5 discos de antibióticos por placa para que o halo de inibição de um disco não interfira em outro), feito isso, deve-se incubar de 24-48 H na estufa a 37ºC, com ou sem CO2. Após, devemos medir esses halos e fazer a comparação com a tabela CLSI (com essa comparação conseguimos ver se a bactéria é sensível ou resistente ao antibiótico, ou seja, esse é um teste qualitativo).
Métodos quantitativos (Determinação da Concentração Inibitória Mínima – CIM) – saber qual é a concentração mínima de antibiótico que a bactéria deixa de crescer. 
Macrodiluição em caldo
É realizada em tubo de ensaio. Teremos o meio de cultura, então devemos fazer uma diluição seriada desse antibiótico e também devemos ter um meio sem nenhum antibiótico e depois devemos colocar o inoculo de bactérias (ex.: 2 microlitros) em todos os tubos. Feito isso devemos incubar e visualizaremos que a partir de uma determina concentração não teremos mais crescimento bacteriano. 
Como mostra a imagem acima, abaixo de 2 todas as bactérias cresceram, acima ou igual a dois já não ocorre mais crescimento bacteriano.
Podemos dizer então que 2mg/dl é a concentração Inibitória Mínima do antibiótico a ser utilizado. Esse procedimento não é tão realizado no laboratório, mas é de grande importância. 
Microdiluição em caldo
É realizada em placa de 96 poços e observaremos os poços em que houveram ou não crescimento bacteriano. A leitura é feita em leitor de ELISA, onde tiver maior densidade optica então não está tendo passagem de luz, isso porque teve crescimento bacteriano e vice-versa. Depois deve-se fazer a comparação com a tabela CLSI.
Teste Epsilométrico ou E-Test ou Teste E
É uma tira com antibiótico, e essa tira tem várias concentrações diferentes de antibiótico. Devemos semear a bactéria e colocar a tira no meio e com isso conseguiremos ver qual a concentração mínima que o antibiótico começa a inibir o crescimento da bactéria. Fazer a comparação na tabela CLSI.
	
Interpretação e relato dos resultados 
Sensível- em geral significa que a infecção devida ao microrganismo estudado pode ser adequadamente tratada com a dosagem habitual do antimicrobiano testado e recomendado para este tipo de infecção. 
Intermediário - significa que o microrganismo pode ser inibido por concentrações atingíveis de certas drogas se doses maiores puderem ser administradas ou se a infecção ocorre em local onde o antimicrobiano é fisiologicamente concentrado (trato urinário, por ex.) 
Resistente - quando o isolado não é inibido pela concentração do antimicrobiano obtida no local da infecção ou quando o microrganismo patogênico apresenta mecanismos específicos de resistência.
Aula do dia 16/11/2016
MICOBACTÉRIAS
Gênero Mycobacterium - Bacilos, aeróbios imóveis, não esporulados, não apresentam flagelos e nem liberam toxinas.
Parede celular complexa e rica em lipídeos (60% do peso);
Proteínas - Cerca de 15% e são antígenos biologicamente importantes, estimulando a resposta imune celular do paciente - PPDs (purificado derivado proteico da parede celular da bactéria (é um teste)
É o agente etiológico da tuberculose – mycobacterium tuberculosis.
PPDs - injeta-se esse purificado subcutaneamente no paciente e se ele estiver infectado, vai ocorrer uma reação e depois mede-se o diâmetro da reação, e teremos como resultado positivo ou negativo. Esse teste tem um pequeno problema, pois muitos de nós já entramos em contato com mycobacterium tuberculosis e desenvolvemos anticorpos, e por isso o resultado positivo nem sempre é positivo, teremos um falso-positivo.
Composição química de parede celular: 
Não é igual a parede celular de bactérias gram + e –
tem presença de muitos lipídeos, chamados de Ácidos lipóicos e pouco peptídeo glicano 
Crescimento lento (TG de 12 a 24 horas em média) devido a composição da parede celular. 
Nutricionalmente exigentes;
Resistência à muitos antimicrobianos;
Resistência à detergentes; 
Resistência à ácidos (BAAR) - Coloração de Ziehl-Nielsen – por isso são chamadas de bacilos álcool-ácido resistente;
Tuberculose
A Tuberculose – chamada antigamente de “peste cinzenta”, é conhecida também em português como típica pulmonar ou “doença do peito” – é uma das doenças infecciosas mais antigas documentadas e que continua a afligir a humanidade nos dias atuais.
Os agentes causais da tuberculose humana são o Mycobacterium tuberculosis, o Mycobacterium bovis e, mais raramente, o Mycobacterium avium, mycobacterium africanus.
Mudanças nas manifestações clínicas e epidemiologia da tuberculose - Desenvolvimento de novas técnicas diagnósticas, porem até hoje o diagnostico se dá por baciloscopia, onde veremos a presença de bacilos na amostra de biopsia, escarro.
Aumento mundial da tuberculose;No RJ, a concentração de casos de tuberculose está na rocinha, devido a condição de vida da população. Vivem aglomerados. A transmissão se dá pelo ar.
Co-infecção por HIV;
Fatores de risco de tuberculose.
Classificação das micobactérias
A família Mycobacteriaceae pertence à ordem Actinomycetales e possui apenas um gênero, Mycobacterium;
São bastonetes retos ou ligeiramente curvos, eventualmente ramificados, não esporulados e sem cápsula;
As micobactérias coram-se mal pelo Gram;
O gênero inclui parasitas obrigatórios (intracelulares), saprófitas (vivem da matéria orgânica em decomposição) e formas intermediárias;
O crescimento é lento ou muito lento. Colônias visíveis aparecem de 2 a 8 semanas de incubação e a temperatura ótima varia entre 28-40ºC (são bactérias mesófilas);
A velocidade de crescimento das micobactérias é uma característica usada na classificação. As micobactérias podem ser agrupadas em:
Espécies de crescimento lento;
Espécies de crescimento rápido (mesmo sendo de crescimento rápido, ainda é considerada lenta quando comparada a outras bactérias – elas geram colônias de 3-5 dias)
Micobactérias que ainda não foram cultivadas devido a necessidades especiais – são bactérias que não são mantidas em meio de cultura nos laboratórios, só conseguimos mantê-las vivas infectando um animal ou através de uma cultura celular, onde essa micobactéria vai se desenvolver dentro dessa célula. 
Micobactérias de crescimento lento
-Mycobacterium tuberculosis
Patógeno intracelular capaz de estabelecer uma infecção por toda vida no hospedeiro;
Infecção ocorrer por penetração por vias aéreas superiores, onde pequenas partículas/gotículas infecciosas atingem os alvéolos, onde são fagocitadas por macrófagos (primeiras células que chegam) alveolares, estes podem acabar com a infecção ou o mycobacterium pode suprimir essa resposta e acabar colonizando essa região do organismo. 
Importantes mecanismos de patogenicidade do mycobacterium se dá principalmente por sua parede celular, onde vai impedir a fusão do fagossomo ao lisossomo, onde seria digerido e então fica protegido e começa a se proliferar dentro do macrófago; União do fagossomo à outras vesículas intracelulares e Capacidade de evadir à destruição por macrófagos.
Sinais da infecção - Componentes da resposta do hospedeiro em vez de fatores de virulência específicos, levam a um dano tecidual.
Replicação intracelular das bactérias - Estimulação de células T auxiliares e células T citotóxicas. Onde teremos a ativação de células T CD4+, estimulando linfócito B a produzir anticorpos, tendo uma resposta imune ineficaz. Além da ativação de células T CD8+ que vai levar a lise de células fagocíticas com micobactérias se replicando em seu interior, consequentemente levando a um dano tecidual.
Produção de citocinas pró-inflamatórias, especialmente interferon-, além de TNF e il-1 Beta (mecanismo do inflamossoma que é ativado pelo mycobacterium tuberculosis)
Carga antigênica inicial baixa - Destruição bacteriana como mínimo dano tecidual;
Carga antigênica inicial alta - Necrose tecidual, para conter a infecção;
Fatores do hospedeiro envolvido nesse processo - toxicidade das citocinas, ativação local da cascata do complemento e exposição a enzimas hidrolíticas derivadas de macrófagos
 Nenhuma toxina ou enzima bacteriana conhecida foi associada à destruição tecidual.
Observação: todo dano tecidual se dá por conta do hospedeiro, pois ele tenta conter a infecção de qualquer maneira. 
Doença clínica: 
Tuberculose ou doença de Kock (Bacilo de Koch – BK);
Estágios da doença: 
Infecção primária que pode ser contida e se não for contida ela pode entrar em estado de latência 
Latência / Disseminação
Reativação
Infecção Primária
O mycobaterium tuberculose é fagocitado pelo macrófago, então isso leva a ativação de vários receptores de imunidade inata, principalmente receptores de membrana do macrófago, ou leve vai ativar TLR-2 isso porque ele possui um ácido graxo em sua parede celular chamado LAN (ácido lipoaraninolanana), que ativa o TOLL-2 que leva a cascata de ativação celular, que leva a transcrição de genes pró inflamatórios. 
Além disso, existem outros receptores citoplasmáticos que vão levar a ativação de um complexo proteico chamado inflamossoma, este complexo pega a proforma IL-1 beta e cliva-a, e isso faz com que a infecção seja contida e o macrófago consegue matar o parasita, mas algumas vezes o macrófago não consegue matar o parasita, e quando isso ocorre, acontece uma necrose tecidual leve e as vezes a formação de um granuloma local. Esse granuloma ao invés de matar o parasita, pode protegê-lo, então o parasita entra em uma parte de latência (o parasita se replica e uma parte dele morrer, se replica..., mas ele não morre). O problema da fase de latência é que quando tivermos uma baixa imune o parasita pode ser reativado e se disseminar; ele escapa do granuloma, infecta outras células, pode cair na via hmatogenica e com isso poderemos ter uma disseminação de m. tuberculosis, chamada de tuberculose extrapulmonar. 
O granuloma é formado devido a todos os mediadores inflamatórios que estão sendo produzidos, acabam chamando células para o local e essas células inflamatórios acabam formando o que chamamos de granuloma. Latência/ Disseminação
Reativação
		Depois dessa disseminação, teremos a reativação do bacilo (depende do sistema imune do paciente), ocorrendo uma reinfecção endógena.
Formas clínicas da doença
Tuberculose primária - Pode acometer qualquer órgão;
Tuberculose miliar - Forma mais grave e consequente à disseminação hematogênica - Lesões granulomatosas pequenas e difusas que atingem pulmões, outros orgãos;
Formas extrapulmonares mais frequentes - Pleural, ganglionar, meningoencefálica, urinária, oftálmica, intestinal, óssea e cutânea, qualquer região do corpo. 
Podemos encontrar o M. tuberculosis até no LCR.
2- Mycobacterium bovis
Causadora da tuberculose em bovinos, podendo, eventualmente, causar tuberculose humana; 
A cepa BCG é a usada na vacinação. 
3- Mycobacterium Kansasii 
Causa uma doença pumonar crônica no homem semelhante à tuberculose;
 As colônias são fotocromogênicas.
4- Mycobacterium marinum
Isolada originalmente de peixes, tem sido observada causando lesões cutâneas de ferimento adquiridos em piscinas que possuem o microorganismo;
 As colônias também são fotocromogênicas.
5- Mycobacterium gastri
Isolada de lavado gástrico e do escarro de pessoas normais. 
6- Mycobacterium triviale
Tem sido raramente isolada do escarro mas não é patogênica; 
Pode ser confundida com M. tuberculosis, no exame bacterioscópico. 
7- Mycobacterium gordanae
Produz colônias pigmentadas mesmo no escuro (escotocromogênicas);
Tem sido encontrada como sapr[ofita no escarro, no suco gástrico e também no solo ou na água.
8- Mycobacterium scrofulaceum
Tem sido isolado de linfadenite cervical de crianças; 
Encontrada no escarro e suco gástrico, geralmente como saprófitas. 
9- Mycobacterium intracellurare
Pode causar doença pulmonar grave no homem e lesões limitadas nos suínos;
É chamado bacilo Battey.
10- Mycobacterium avium
Causadora da tuberculose em aves. Menos frequentemente, causa a tuberculose dos bovinos, suínos e outros animais; 
Raramente causa doença humana.
 11- Mycobacterium ulcerans
Causa úlceras cutâneas no homem, de desenvolvimento lento.
Observação: os tipos 3 a 11 não caem na prova.
Micobactérias de crescimento rápido
Mycobacterium smegmatis
Tem sido isolado do smegma, sem relação com doença.
Mycobacterium fortuitum
Tem sido isolado de doenças respiratórias humanas. 
Mycobacterium peregrinum
Foram isoladas duas cepas, provenientes de material de aspiração brônquica. 
Mycobacterium chelonei
Tem sido ocasionalmente encontrado em escarro e em abscessos da região glútea; 
Ocorre também no solo.
Observação: não vão cair na prova.
Os tópicos mais importantes para a prova serão tuberculose e hanseníase. 
Micobactérias ainda não cultivadas
Mycobacterium leprae
É o agente etiológico da hanseníase humana. É conhecido também como bacilo-de-hansen; 
Só é cultivado através de uma cultura animal ou através de uma cultura celular (células de Schwann)
É identificada por uma técnica especialmente agressiva, a técnica de Ziehl-Neelsen;
 A micobactéria parasita os macrófagos e as células de Schwann que formam a bainha de mielina dos axônios, e isso é importante porque quando o neurônio faz o pulso nervoso ele passa de forma saltatória pelo axônio mielinizado, tornando a condução do sinal mais rápida. Então, quando essas micobactérias colonizam as células de Schwann, estas acabam morrendo, tornando o axônio desmielinizado, aí o pulso nervoso ao percorrer o axônio acaba se perdendo. Com isso, a destruição da mielina leva a disfunção dos nervos e faz com que a pessoa perca a sensibilidade/tato.
Período de incubação longo - Pode chegar há 5 anos;
A doença dissemina por contato pessoa-pessoa. Acredita-se que a inalação de aerossóis infecciosos ou o contato cutâneo com secreções respiratórias sejam as principais vias de transmissão; 
Trata-se uma infecção crônica com acometimento de pele e nervos periféricos;
Formas clínicas da doença: 
Lepra tuberculóide ou hanseníase paucibacilar:
Forte resposta imune celular e fraca resposta imune humoral;
Os tecidos infectados possuem numerosos linfócitos e granulomas, mas poucas bactérias; 
Lesões cutâneas hipo pigmentadas e bem delimitadas (a borda da lesão);
Sem acometimento nervoso.
Lepra lepromatosa ou hanseníase multibacilar:
Forte resposta humoral, mas fraca resposta imune celular; 
Observa-se uma grande quantidade de bactérias nos macrófagos cutâneos e nas células dos nervos periféricos;
Forma de alta infectividade; 
Numerosos lesões cutâneas, em especial no rosto; 
Elevado acometimento nervoso, ou seja, perda de sensibilidade. 
Observação: o diagnostico laboratorial vai ser através de biopsia, e a partir desta deve-se fazer uma baciloscopia. 
Mycobacterium lepraemurium 
Causadora de lepra dos ratos.
Diagnóstico laboratorial da Tuberculose
A preconizada até hoje é a baciloscopia (coloração de ziehl neelsen) 
Técnicas de biologia molecular
Estratos lipídicos que a partir deles essas bacterias passam por cromatrografia cromatografia líquido-gasosa
Cultura em caldo, cultura em ágar, automação, cromatografia líquida de alto desempenho;
Segurança no laboratório - NSB 3 + HEPA.
Observação: as formas diagnosticas mais baratas são a baciloscopia e as técnicas de biologia molecular.
COLETA DE AMOSTRAS
Amostras respiratórias - Expectoração ou nebulização – Manhã (mais indicadas).
Observação: fazer o bochecho somente com água. Feito isso, colocar o escarro no pote e levar ao laboratório para ser analisado.
Hemoculturas - Frascos com agentes líticos (ESP Culture System II, BACTEC MYCO/F lítico e MB/BacT) - automatizado
Fezes - Fezes frescas;
Amostras “ estéreis ” - LCR e outros líquidos corporais.
PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS
Microbiota adjacente – Digestão/descontaminação
Observação: ex. os escarros contem bactérias comensais e antes da análise é preciso fazer uma digestão/descontaminação da amostra. Isso é feito da seguinte maneira:
Digestão e descontaminação - NaOH 5%, ácido oxálico 5%, fosfato trissódico (TSP) combinado com cloreto de benzalcônio ou HCl concentrado
Atualmente - NALC-NaOH - Volumes iguais de amostra de NALC-NaOH - Agitar e deixar em repouso TA por 15-20 min - Tampão fosfato – Centrifugação – Pellet
Observação: ex. pegar 1ml da amostra de escarro + 1ml de NALC-NaOH e colocar no tubo falcon. Depois deve-se passar no vortex para agitar bem, após deve-se deixar sobre a bancada por 15 min (esse tempo serve para que o NALC-NaOH degrade as baterias comensais – ele não consegue degradar o mycobacterium tuberculosis). Após, esse tempo coloca-se um tampão fosfato (PPS) para neutralizar, então centrifuga-se novamente, despreza o sobrenadante e sobra o pellet, que é colocado em uma lamina, fixado, corado por ziehl neelsen e analisado.
COLORAÇÃO DE BAAR
Coloração com fucsina fenicada ou carbolfucsina (mais utilizada, pois não precisa aquecer):
 Ziehl-Neelsen (coloração a quente)
 Kinyoun (criocoloração)
Coloração com fluorocromo:
 Auramina O, com ou sem outro fluorocromo (rodamina)
Esse quadro ao lado mostra como é realizada a técnica. Ele não explicou porque um grupo iria apresentar. O problema é que o slide do grupo não está no portal.
CULTURA PARA ISOLAMENTO DE MICOBACTÉRIAS
Após a coloração, parte do material vai para a cultura (em média leva 1 mês para ter crescimento)
Löwestein-Jensen – Verde malaquita (meio indicado para mycobacterium tuberculosis) – seletivo - Detecção em 18-24d - Meio à base de ovo;
Middlebrook - Detecção precoce (10-12d) - Líquido (7H9) e sólidos (7H10 e 7H11) - Meio à base de agar;
Incubação – 30 dias a 37°C, 3-11% de CO2.
MÉTODOS CONVENCIONAIS DE IDENTIFICAÇÃO
Temperatura e velocidade de crescimento (depende do tipo de amostra)
Temperatura - Variação entre 30 a 37ºC; 
Microbactéria de crescimento rápido - 3 a 5 dias - M. fortuitum, M. chelonei, M. abscessus e M. smegmatis
M. ulcerans - 60 dias para crescer
Observação: após fazer a descontaminação da amostra, deve-se fazer a coloração de Ziehl-Neelsene se observarmos bacilos (podemos emitir um laudo parcial), devemos fazer a cultura (padrão ouro) dessas bactérias em verde malaquita.
Laudo parcial - serve para dizer se viu ou não a presença de uma microbactéria, mas não se sabe se é a m. tuberculosis. 
	Na Ziehl-Neelsen, os bacilos ficam corados em vermelhos e as outras células ficam coradas em azul por causa de um outro corante.
Veremos o número de BAAR observados por campo. Normalmente a média de 1 BAAR a cada 10 campos, o exame acaba sendo positivo para tuberculose.